Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лазерная спектроскопия структуры белковых молекул 13
1.1. Особенности структуры белковых молекул 13
1.2. Особенности структуры и функционирования химотрипсина и люциферазы . 22
1.3. Методы лазерной физики в исследованиях белковых молекул 30
1.3.1. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением 30
1.3.2. Спектроскопия комбинационного рассеяния света 45
1.3.3. Нелинейная лазерная спектроскопия 5 6
Литература 60
Глава 2. Многофункциональный лазерный спектрометр для исследования биомолекул 74
2.1. Лазерные источники 74
2.2. Оптическая схема МЛС. 80
2.2.1. Оптическая схема экспериментов по флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. 80
2.2.2. Оптическая схема экспериментов по КР спектроскопии 84
2.2.3. Оптическая схема экспериментов по микроспектроскопии 88
2.3. Оптимизация оптической схемы конфокального микроскопа 92
2.3.1. Элементы дифракционной теории построения изображения в конфокальном микроскопе 92
2.3.2. Определение параметров оптической схемы 97
2.4. Системы регистрации 105
2.4.1. Система счета фотонов с временным разрешением 105
2.4.2. Многоканальное детектирование КР спектров 110
2.4.3. Система регистрации на основе позиционно-чувствительного ФЭУ 111 МКП
2.5. Методика обработки экспериментальных данных 116
2.5.1. Обработка кинетик затухания интенсивности флуоресценции 116
2.5.2. Обработка данных флуоресцентной спектрохронографии 121
2.5.3. Коррекция стационарных спектров флуоресценции 122
2.5.4. Обработка спектров комбинационного рассеяния 124
2.6. Воздействие лазерного излучения на образцы 128
Глава 3. Примеры применения МЛС для диагностики биообъектов 139
3.1. КР спектроскопия нефлуоресцирующих фталоцианинов в растворах, модельных средах и клетках 139
3.2. Флуоресцентная спектрохронография белкамелиттина 148
3.3. Флуоресцентная спектроскопия при двухфотонном возбуждении 156
3.4. Определение параметров широкополосного фона в КР спектрах белковых молекул 162
Глава 4. КАРС спектроскопия как метод диагностики структуры белковых молекул 176
4.1. Особенности КАРС спектроскопии белковых молекул 176
4.2. Техника КАРС спектроскопии 186
4.3. КАРС спектроскопии белковых молекул 197
4.3.1. КАРС спектроскопия имидазольного кольца 197
4.3.2. КАРС спектроскопия ароматических аминокислотных остатков 200
4.3.3. КАРС спектроскопия полосы амид I 203
4.3.4. КАРС спектроскопия полосы амид III 216
4.3.5. Невырожденный КАРС растворов аминокислот 217
Глава 5. Колебательная спектроскопия функционально-значимых структурных изменений белковых молекул 224
5.1. Определение изменения структуры фермента при его взаимодействии с лигандом 224
5.1.1. Изменения полосы амид I 228
5.1.2. Изменения полосы амид III 234
5.1.3. Изменения полос ароматических аминокислотных остатков 235
5.1.4. Изменения полос дисульфидных мостиков 237
5.2. Конформационные изменения белков при переходе от кристаллического состояния к раствору: сравнение данных рентгеноструктурного анализа и КР спектроскопии 240
5.3. Структурные изменения химотрипсина, связанные с эффектом "инверсии функции" 252
Глава 6. Светоиндуцированные конформационные изменения в биолюминесцентной системе люциферин-люцифераза 273
6.1. Спектральные свойства компонент биолюминесцентной системы 273
6.2. Тушение флуоресценции люциферазы при взаимодействии с лигандами 278
6.2.1. Взаимодействие люциферазы с люциферином 278
6.2.2. Взаимодействие люциферазы с АТФ 284
6.3. Фотоиндуцированные изменения молекулы люциферина. 290
6.4. Внутримолекулярная динамика люциферазы 302
6.5. Эффект фотоиндуцированного разгорания флуоресценции люциферазы 309
6.6. Схема фотоиндуцированных конформационных изменений 323
Заключение к главе 6 326
Литература 327
Заключение 330
- Особенности структуры и функционирования химотрипсина и люциферазы
- Оптимизация оптической схемы конфокального микроскопа
- Методика обработки экспериментальных данных
- Флуоресцентная спектрохронография белкамелиттина
Введение к работе
Методы лазерной физики обеспечивают уникальный инструментарий, при помощи которого исследователи самых разных областей научного знания получают не просто новую, но принципиально недоступную в долазерную эру информацию о структуре и свойствах объектов различной природы. Без сомнения, едва ли не самые впечатляющие успехи современной лазерной физики связаны с исследованиями, проводимыми в области наук о жизни. Желание раскрыть фундаментальные закономерности процессов, происходящих в живой природе, заставляет обращаться к исследованиям на молекулярной уровне. Здесь же основное внимание оказывается сконцентрированным на белках - молекулах, обеспечивающих реализацию практически всех жизненно важных процессов. Последние являются процессами принципиально динамическими, поэтому для их исследования необходимы методы, высокая информативность которых дополняется возможностью регистрации изменений в реальном времени. Методы лазерной физики безусловно удовлетворяют этим требованиям.
Следует особо отметить то обстоятельство, что применение лазеров не только революционизировало традиционные ("долазерные") методы исследования, такие, например, как флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния света, но и дало возможность реализовать принципиально новые методы оптической спектроскопии, основанные на нелинейно-оптических эффектах. Нелинейно-оптические методы, хорошо зарекомендовавшие себя в исследованиях сравнительно простых веществ, должны быть опробованы и в экспериментах с объектами биологической природы.
Поглощение кванта света биомолекулой само по себе может являться первопричиной целой цепочки сложнейших изменений, включающих как элементарные физические, так и биохимические процессы. Хорошо известны две природные системы, "запускаемые" светом. Это фотосинтетическая система растений и система зрительного восприятия. Свидетельством впечатляющих успехов оптических методов в их изучении являются десятки монографий и специализированные научные конференции соответствующей проблематики.
5 Возникает естественный вопрос: не могут ли имеющиеся наработки быть применены при изучении других объектов?
В последнее время в мировой науке закрепился и стал общепринятым подход, основанный на рассмотрении биомолекул и, в первую очередь, белков как молекулярных машин. Такое рассмотрение логически тесно связано с концепцией "белок-машина" сформулированной советскими учеными в 60-х годах прошлого века. И если в первых работах были сформулированы общие закономерности, оправдывающие "механистический" подход к функционированию белков, то в современных исследованиях рассмотрение доведено до прямого расчета кпд молекулярных машин.
Любой машине, в том числе и молекулярной, свойственна взаимосвязь между структурой и функцией. Является обыденным то обстоятельство, что макроскопические машины и механизмы изменяют свою пространственную структуру при выполнении той или иной функции. В связи с этим возникает вопрос: существует ли такая же взаимосвязь и в мире молекулярных машин? Существует значительное количество экспериментальных данных прямо или косвенно подтверждающих такую взаимосвязь.
Актуальность работы определяется несколькими обстоятельствами. Во-первых, изменение структуры биомолекул и, в частности, белков приводит во многих случаях к существенным изменениям в механизмах их функционирования (одним из наиболее впечатляющих примеров является способность белковых молекул с измененной структурой вызывать серьезные заболевания). Во-вторых, физика функционирования молекулярных машин, без которой невозможна их инженерия, не может быть понята без ясного представления как о собственно структуре этих макромолекул, так и об ее изменении в реальном времени. В третьих, несмотря на существование многочисленных методов диагностики структуры белковых молекул, не существует единой методики проведения экспериментов по определению как статической структуры, так и динамики этих макромолекул в реальном времени во всем диапазоне характерных времен, начинающемся в фемтосекундной области. В четвертых, нельзя считать удовлетворительной ситуацию, при которой уникальные особенности методов лазерной физики используются в исследованиях биомолекул далеко не в полном
объеме. Так, в частности, крайне редки случаи успешного применения методов нелинейной лазерной спектроскопии, а эксперименты с высоким временным разрешением проводятся в основном на фотосинтетических системах и их аналогах, а также на молекулах, обеспечивающих зрительное восприятие.
Таким образом, на основании вышесказанного можно сформулировать основную цель работы: основываясь на методах лазерной физики, установить связь между функциональной активностью белковых молекул и внутримолекулярными структурными изменениями.
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
Создание многоцелевого лазерного микроспектрометра для исследования биомолекул методами спектроскопии комбинационного рассеяния света и флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением (в том числе и при двухфотонном возбуждении), а также для исследования фотоиндуцированных изменений в биомолекулах при помощи метода "накачка-зондирование".
Определение методами лазерной спектроскопии функционально значимых структурных изменений белковых молекул (молекулярных машин).
Разработка новых методов диагностики структуры белковых молекул на основе спектроскопии когерентного антистоксова рассеяния света.
Комплексный анализ фотоиндуцированных конформационных изменений в биолюминесцентной системе люциферин-люцифераза.
Предлагается следующий план решения поставленных задач. Выявляются характерные структурные особенности белковых молекул и определяются способы их диагностики при помощи методов лазерной спектроскопии (с временным разрешением). Формулируется перечень требований, предъявляемых к аппаратуре для соответствующих экспериментальных исследований. Создается комплекс аппаратуры и методов обработки экспериментальных данных, отвечающих сформулированным требованиям. Отдельно рассматривается вопрос о возможности применения нелинейно-оптических методов. Проводятся эксперименты по выявлению функционально-значимых структурных изменений белковых молекул. Разрабатываются экспериментальные подходы к решению проблемы запуска светом внутримолекулярных динамических процессов и рассматривается связь этих процессов с функциональной активностью.
7 Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения. Работа изложена на 333 страницах, включает 119 рисунков, 21 таблицу и списки литературы (по главам; общее число ссылок - 340).
В первой главе охарактеризованы основные особенности строения молекулярных машин - белков. Приведены данные о структуре и функциональных особенностях химотрипсина и люциферазы. Представлен обзор литературы по применению методов спектроскопии комбинационного рассеяния, флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и нелинейной лазерной спектроскопии для исследования структуры биомолекул.
Во второй главе приводится описание многоцелевого лазерного микроспектрометра. Описываются лазерные источники и оптические схемы для экспериментов по КР и флуоресцентной (микро)спектроскопии и экспериментов по схеме "накачка-зондирование". Приводится описание систем регистрации на основе техники счета фотонов с временным разрешением и многоканального детектирования. Рассматриваются основные методы обработки экспериментальных результатов.
Третья глава посвящена описанию примеров применения лазерного микроспектрометра. Приводятся результаты экспериментов по флуоресцентной спектрохронографии белка мелиттина, по лазерной КР микроспектроскопии фталоцианинов в живой клетке, по флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением порфиринов и пиридона при двухфотонном возбуждении и по определению параметров фона в КР спектрах белковых молекул.
В четвертой главе рассматриваются особенности КАРС спектроскопии при исследованиях белковых молекул. Приводится описание КАРС спектрометров, детально обсуждаются условия и формулируются практические рекомендации по проведению экспериментов. Рассматриваются результаты применения КАРС спектроскопии для исследования структуры белковых молекул. Демонстрируются преимущества метода по сравнению со спектроскопией спонтанного комбинационного рассеяния.
8 В пятой главе приводятся результаты определения функционально значимых структурных изменений молекулярных машин при помощи методов КР и КАРС спектроскопии. Определены конформационные изменения химотрипсина при взаимодействии с лигандом; исследованы изменения струкутры химотрипсина, связанные с эффектом "инверсии функции"; рассмотрены различия данных рентгеноструктурного анализа и КР спектроскопии при изучении структуры растительных токсинов.
В шестой главе представлены результаты комплексного исследования биолюминесцентной системы люциферин-люцифераза. Применены методы флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии с временным разрешением, а также проведены эксперименты по схеме "накачка-зондирование". На основе анализа совокупности экспериментальных данных предложена схема фотоиндуцированных конформационных изменений, имеющих непосредственное отношение к функциональной активности люциферазы.
В Заключении сформулированы основные результаты и выводы работы.
Научная новизна
Методом флуоресцентной спектрохронографии впервые измерены параметры внутримолекулярной динамики белков мелиттина и люциферазы.
Впервые измерены КР спектры фталоцианинов в живых клетках и получены изображения клеток "в свете" сигнала КР.
Метод КАРС спектроскопии впервые применен для анализа структуры белковых молекул.
Предложен метод определения вторичной структуры белков, основанный на поляризационной КАРС спектроскопии.
Методом лазерной КР спектроскопии впервые определены изменения всех основных конформационно чувствительных полос в колебательном спектре белка (химотрипсина) при его взаимодействии с лигандом.
Методом лазерной КР спектроскопии впервые установлены конформационные изменения белка химотрипсина, связанные с эффектом "инверсии функции".
Методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением впервые исследовано тушение собственной триптофановой флуоресценции люциферазы лигандами и определены механизмы тушения.
Методом спектроскопии наведенного поглощения впервые экспериментально исследованы изменения молекулы люциферина при фотовозбуждении.
Впервые проведено исследование комплекса люциферин-люцифераза при помощи схемы "накачка-зондирование", при котором производилось фотовозбуждение люциферина и регистрировались параметры триптофановой флуоресценции люциферазы; предложена схема и проведен анализ светоиндуцированных конформационных изменений.
Методом лазерной КР спектроскопии впервые проведено исследование особенностей структуры растительных токсинов в водной среде и показано, что полученные данные существенным образом дополняют данные рентгеноструктурного анализа.
Практическая ценность
Созданная экспериментальная установка позволяет проводить исследования биомолекул с применением методов КР (микро)спектроскопии, флуоресцентной (микро)спектроскопии с временным разрешением, в том числе и с двухфотонным возбуждением, и метода "накачка-зондирование". Возможность использование нескольких экспериментальных методик на одной установке существенным образом повышает ее практическую ценность в исследованиях структуры биомолекул. Практическую значимость имеет новый метод диагностики структуры белков, основанный на спектроскопии когерентного антистоксова рассеяния света.
Защищаемые положения
1. Использование пикосекундных лазерных импульсов дает возможность инициировать и регистрировать методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии с временным разрешением последовательность конформационных изменений в комплексе люциферин-люцифераза. Эта последовательность включает в себя изменение геометрии и собственного дипольного момента молекулы люциферина при переходе в возбужденное
10 электронное состояние, вызванную этими изменениями диссоциацию комплекса, конформационные изменения молекулы белка и, как следствие, изменение квантового выхода флуоресценции последней.
Разработанный лазерный микроспектрометр с диапазоном длин волн возбуждения от ближнего ИК (1,06 мкм) до ближнего УФ (0,266 нм) позволяет проводить комплексные исследования биомолекул и биообъектов методами КР спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии. Возможно проведение измерений с временным разрешением, использованием двухфотонного возбуждения и применением техники "накачка-зондирование". Спектрометр дает возможность измерять спектры комбинационного рассеяния света, (время-разрешенные) спектры флуоресценции, времена жизни флуоресценции, времена вращательной корреляции, времена ориентационной релаксации, пространственное распределение сигнала КР, распределение фотонов флуоресценции в пространстве и времени, сечения двухфотонного поглощения.
Использование поляризационно чувствительной КАРС спектроскопии позволяет выявить спектральные компоненты широких (~ 40-50 см"1) полос в колебательном спектре белка, определяемых нормальными колебаниями амидной группы, и таким образом реализовать новый метод диагностики вторичной структуры белковых молекул не требующий априорных предположений о структуре полос.
Сочетание методов линейной (спонтанное КР) и нелинейной (поляризационно-чувствительное КАРС) колебательной спектроскопии позволяет экспериментально определить и количественно охарактеризовать функционально значимые конформационные изменения, которые претерпевает молекула белка в целом как единая механическая система. Эти изменения проявляются в трансформации состояния микроокружения ароматических аминокислотных остатков, вторичной структуры и пространственной конфигурации дисульфидных связей, стабилизирующих третичную структуру молекулы.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследований, представленных в диссертации, докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях: I Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982), Всесоюзное совещание "Применение лазеров в биологии" (Москва, 1983), V Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1984), Советско-чехословацкий семинар "Исследование структуры физических свойств и энергетики биологически активных молекул" (Вильнюс, 1986), V Международный симпозиум "Сверхбыстрые процессы в спектроскопии" (Вильнюс, 1987), Советско-чехословацкий семинар "Динамика и активность биологических макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент" (Ереван, 1988), Всесоюзное совещание по молекулярной люминесценции (Караганда, 1989), XIX Европейский конгресс по молекулярной спектроскопии (Дрезден, 1990), Симпозиум по биолюминесценции (Гавайи, 1993), Конференция по квантовой электронике и лазерным наукам (QELS) (Балтимор, 1993), Международная конференция по квантовой электронике (IQEC) (Анахайм, 1994), Ежегодная конференция OSA (Лонг Бич, 1997), II съезд биофизиков России (Москва, 1999), Международная конференция по методам и применениям флуоресцентной спектроскопии (Париж, 1999), Европейские конференции по спектроскопии биомолекул (ECSBM) (Лилль, 1995; Энсхеде, 1999), Международные конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния (ICORS) (Гон Конг, 1994; Пекин, 2000), XII-XVII Конференции по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 1985; Минск, 1988; Санкт-Петербург, 1991; Санкт-Петербург, 1995; Москва, 1998; Минск, 2001), I—VIII Конференции по применению лазеров в науках о жизни (LALS) (Прага, 1986; Печ, 1988; Москва, 1990; Ювяскюля, 1992; Минск, 1994; Йена, 1996; Братислава, 1998; Токио, 2000).
По теме диссертации опубликованы 72 статьи (42 - в отечественных и зарубежных журналах, 19 - в трудах конференций и 11 - в тематических сборниках) и более 30 тезисов докладов. Список основных статей приведен в конце автореферата.
Под руководством автора выполнены и успешно защищены три диссертационные работы на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности "лазерная физика".
12 Личный вклад автора
Все изложенные в диссертации результаты получены автором лично либо при его непосредственном участии. Автор осуществлял выбор направлений и объектов исследования, разработку методик измерений и обработки результатов, постановку экспериментов и их проведение.
Особенности структуры и функционирования химотрипсина и люциферазы
Подавляющая часть экспериментальных исследований по проблеме "структура-функция" в этой работе выполнена на двух объектах - белках химотрипсине и люциферазе. Выбор именно этих двух белков из огромного множества молекулярных машин обусловлен следующими причинами. Химотрипсин является классическим объектом биохимических исследований, особенности его функционирования разобраны во многих монографиях (см., например, [26]). Этот белок был одним из первых объектов в экспериментах по определению пространственной структуры молекулы методом рентгеноструктурного анализа. Люцифераза также является достаточно хорошо изученным белком. Однако выбор именно белка определяется не методическими, а научными соображениями: проведенные исследования показали, что системы, основанные на люциферазе могут занять место в немногочисленном ряду сложных объектов биологической природы, структурные изменения в которых могут быть инициированы световыми импульсами. Таким образом, именно для этого белка возможно успешное решение ключевой проблемы экспериментов по определению структурных изменений биомолекул с высоким временным разрешением -проблемы синхронизации. По своим функциям химотрипсин напоминает молекулярные "ножницы". Задачей этого белка, вырабатываемого поджелудочной железой млекопитающих, является расщепление полипептидной цепочки. Таким образом, данная молекулярная машина участвует в процессе переваривания белковой пищи. Химотрипсин выступает в роли катализатора реакции разрыва (гидролиза) пептидной связи, в ходе которой полипептидная цепочка рвется, а в места разрыва присоединяются "фрагменты" молекулы воды (Н+ и ОН-): [...-CHR-NH CO-CHR2-...] + [Н-ОН] — [...-CHR -NHJ + [HOOC-CHR2-...]. Здесь R1 и R2 - остатки двух соседних аминокислот фрагмента пептидной цепи, волнистой чертой показана разрываемая пептидная связь. Вероятность самопроизвольного протекания указанной реакции крайне мала из-за высокого энергетического барьера. Молекулярная машина образует комплекс с атакуемой молекулой (субстратом), в котором последняя попадает в специально организованное силовое поле и фиксируется в нем.
При этом параметры потенциального рельефа все время флуктуируют. Потенциальный рельеф в активном центре молекулярной машины организован специальным образом, что способствует снижению исходного энергетического барьера. В состав молекулы химотрипсина входит примерно 250 аминокислотными остатками, ее молекулярная масса - 24800 а.е.м. По данным рентгеноструктурного анализа [27] молекула химотрипсина состоит из двух частей - субглобул (доменов), связанных между собой небольшим участком полипептидной цепи и слабыми нековалентными взаимодействиями. Предполагается, что движение субглобул носит колебательный характер. При этом аминокислотные остатки связующего звена (37-38 и 204-205) выполняют роль шарнира. Активный центр расположен между субглобулами. В его состав входят аминокислотные остатки Serl95, His57 и Aspl02. Отметим, существенную удаленность этих остатков друг от друга в первичной последовательности. Их пространственная близость связана с высшими уровнями иерархии структуры белковой молекулы. Важно и то, что Serl95 и His57 размещены на поверхности различных субглобул (на разных "режущих кромках" молекулярных ножниц). Каждая из субглобул а-ХТ представляет собой устойчивую "конструкцию", остов которой состоит из шести вытянутых, уложенных в р-структуры, отрезков полипептидной цепи, сшитых водородными связями. Субглобулы образуют как бы два "бочонка", также соединенных между собой звеном полипептидной цепи и несколькими водородными связями.
Остановимся на некоторых структурных особенностях химотрипсина, которые важны для понимания представленных экспериментальных результатов. Рис. 1.2.1а дает представление о вторичной структуре молекулы. Видно, что основным элементом порядка является р-структура, хотя существуют достаточно короткие а-спиральные участки. Важнейшим элементом стабилизации пространственной структуры молекулярной машины являются дисульфидные связи - ковалентные связи между двумя атомами серы аминокислотных остатков цистеина. Эти связи показаны на рис. 1.2.16. В силу особенностей формирования КР спектра белковых молекул (см. раздел 1.3), особенного внимания заслуживают ароматические аминокислотные остатки. На рис. 1.2.1в И 1.2.1Г выделены аминокислотные остатки тирозина и триптофана, соответственно. Особую роль в функционировании молекулярной машины играет состояние поверхностных групп и их взаимодействие с молекулами окружения (в первую очередь - воды). На рис. 1.2.1д выделены поверхностные аминогруппы химотриписна, взаимодействие которых с некоторыми органическими веществами, существенным образом влияет на функциональную активность. Молекулярные компоненты и кинетика протекания биолюминесцентной реакции, катализируемой люциферазой светляков Photinus pyralis, были изучены группой американских ученых под руководством профессора МакЭлроя [28, 29]. Было показано, что необходимым компонентом биолюминесцентной реакции являются аденозин-5 -трифосфорная кислота (АТФ) и ионы двухвалентного магния. В процессе реакции происходит окисление люциферина (рис. 1.2.2) кислородом воздуха.
Продукт реакции - оксилюциферин - образуется в синглетно-возбужденном электронном состоянии [30], и его дезактивация сопровождается испусканием кванта света (максимум спектра биолюминесценции располагается при 560-570 нм). Роль белков в функционировании конкретных биолюминесцентных систем ясна не до конца. Можно лишь сделать предположение, что белковая глобула обеспечивает закрепление наиболее энергетически выгодной конформации реагирующих веществ. Это может происходить за счет образования электростатических, водородных и других связей с функциональными группами белка. Окисление люциферина без участия люциферазы приводит к образованию оксилюциферина без испускания кванта биолюминесценции [31]. Известно несколько видов люцифераз, частично отличающихся по аминокислотному составу, в том числе по количеству триптофановых остатков. Люцифераза L. mingrelica содержит единственный триптофановый остаток, что делает ее особенно удобной для флуоресцентных исследований. Всего в состав люциферазы L. mingrelica входят 19 тирозиновых, 27 фенил ал аниновых и 1 триптофановый остаток. Люцифераза светляков представляет собой димер, состоящий из двух мономерных субединиц с молекулярной массой 62000 а.е.м. Установлено, что мономеры не обладают каталитической активностью. Различные виды люцифераз содержат от 523 до 550 аминокислотных остатков. Пространственная структура люциферазы светляков Photinus pyralis была определена с разрешением 2 А методом рентгеноструктурного анализа [32]. Главная часть белка, содержащая с 4 по 436 остаток (N-мономер), образует (5-структуру. С-мономер (остатки 440-544) белка сформирован из смешанной а + (3 структуры. Домены соединены друг с другом подвижной и неупорядоченной петлей (остатки 435 141). При этом данные о структуре петли, соединяющей домены, отсутствуют вследствие плохо разрешенной электронной плотности в этой области белка. Модель пространственной структуры люциферазы Luciola mingrelica (рис. 1.2.3а) была получена путем сравнения гомологичных участков последовательностей аминокислот двух названных белков [33]. Согласно этой модели, Тгр419 находится в основании подвижной петли, соединяющей N- и С-домены. Однако участок, в котором располагается Тгр419, образует (З-структуру, поэтому положение триптофанового остатка можно считать достаточно жестко фиксированным. Ароматический цикл триптофанового остатка частично экспонирован в растворитель, в его окрестности находятся по меньшей мере семь молекул воды. На первой стадии биолюминесцентной реакции люцифераза связывает люциферин в активном центре с образованием фермент-субстратного комплекса [30]. Положение активного центра фермента до сих пор точно не
Оптимизация оптической схемы конфокального микроскопа
Проблеме расчета оптической схемы конфокального микроскопа посвящен целый ряд работ (см., например, [10, 11, 12, 13, 14]). Однако, следует отметить, что в большинстве случаев конечные формулы содержат интегральные соотношения, не представимые в аналитическом виде. Кроме того, в литературе в основном рассчитываются конкретные схемы микроскопов, что не позволяет говорить об универсальности получаемых результатов. Таким образом, отсутствие достаточно простых универсальных соотношений для расчета оптической схемы сделало необходимой описываемую в настоящем разделе процедуру оптимизации. Рассмотрим установку для измерения КР-спектров микрообъектов, изображенную на рис. 2.3.1. Лазерный луч поступает на линзу L1 и фокусируется объективом L2 на объекте, рассеянный свет от которого собирается тем же объективом, проходит через диафрагму D и регистрируется детектором. Представленную на рис. 2.3.1 оптическую схему можно отнести, согласно [15, 16], к конфокальным микроскопам (КМ). В этой схеме точечным источником можно считать, в некотором приближении, перетяжку лазерного пучка S, расположенную в фокусе линзы L1, а точечность детектора обеспечивает диафрагма D. Объектив L2 играет роль одновременно осветительной и приемной линзы, что автоматически обеспечивает конфокальность, то есть согласованность этих линз. Как правило, для серийных объективов известно их линейное увеличение
Ми числовая апертура NA. Через эти величины можно выразить и другие параметры объектива [17]: фокусное расстояние fob=A0/M, где А0 - тубусное расстояние микроскопа, а - fobNA(l + \/ М) - радиус входного зрачка , fob=nfob - заднее фокусное расстояние. Если не принимать во внимание ход лучей внутри объектива, то в расчетах можно рассматривать в качестве объектива тонкую линзу с фокусными расстояниями fob, fob и радиусом а. Для описания распространения лазерного луча через такую оптическую систему можно воспользоваться формализмом ABCD-матриц [18]. Гауссов пучок можно описать комплексным параметром q(z): 1/q = 1/ R(z) - 2il kw (z), где R(z) - радиус кривизны волнового фронта вблизи оптической оси; w(z) - радиус пучка по уровню интенсивности 1/е и к-2т Х - волновое число. Для определения результатов воздействия оптической системы на гауссов комплексный параметр до и после оптической системы соответственно [18]. Таким образом, по известным начальным параметрам лазерного луча вычисляется геометрия пучка в любой точке пространства, в частности, находится распределение интенсивности в плоскости объекта: где г - радиальная координата, w0 = w(z = 0) - радиус перетяжки гауссова пучка в области предмета. Как известно, перетяжка гауссова пучка вследствие фокального сдвига смещена на некоторую величину Sf от предметной плоскости ближе к объективу. В работе [19] показано, что для чисел Френеля N = a /Xf» 10 фокальный сдвиг Sf/f пренебрежимо мал. В нашем случае широкоапертурного объектива a/f 1, и условие 7V » 10 хорошо выполняется. Поэтому в дальнейшем будем пренебрегать фокальным сдвигом и считать, что перетяжка пучка расположена в предметной плоскости А.
Так как комбинационное рассеяние и флуоресценция являются некогерентными процессами, то построение изображения в плоскости диафрагмы D нужно описывать с помощью дифракционной теории, в основе которой лежит интеграл Кирхгоффа-Френеля, который в свою очередь следует из скалярной электромагнитной теории. Этот интеграл определяет амплитуду поля в любой плоскости в зависимости от амплитуды в исходной плоскости: где h(u,v)= J2exp(—up )J0(vp)pJp - импульсная функция расстояние до предметной плоскости объектива, то, принимая во внимание, что z«dx, продольную координату можно представить в виде и « —z. Интегрируя формулу по плоскости предмета и по плоскости изображения с учетом диафрагмы D, получим интегральную интенсивность, поступающую на детектор в зависимости от расстояния и между рассеивающей и предметными плоскостями (считаем, что все излучение прошедшее через диафрагму регистрируется детектором): В аналитическом виде интегралы не берутся, следовательно для расчета схемы необходимо использовать численное интегрирование. Интегрирование производилось по методу Симпсона, с удвоением шага разбиения до тех пор, пока не будет достигнута заданная точность. Погрешность интегральных сумм оценивалась по формуле Рунге. Для вычисления зависимости / (и,у была написана программа, вычисляющая определенный интеграл по методу Симпсона [20]:
Методика обработки экспериментальных данных
При анализе кинетик затухания флуоресценции нужно учитывать, что получаемая кривая u(t) есть свертка аппаратной функции системы p(t) и функции затухания флуоресценции/( ): Простейшим методом определения времен затухания флуоресценции по полученным кривым является нанесение данных на график в логарифмическом масштабе и определение константы затухания по тангенсу угла наклона кривой. Однако такой метод оказывается довольно грубым, поэтому на практике широкое распространение получил метод обратной свертки. Суть этого метода состоит в решении уравнения (2.5.1) для функции/( . В этом случае в уравнение (2.5.1) подставляется известная аппаратная функция системы p(t) и предполагаемая модель функции f(t). Полученная в результате такого решения функция u(t) исследуется на наилучшее соответствие измеренной функции u(t). Критерием правильности в процессе проверки служит так называемый критерий наименьших квадратов, который предполагает минимизацию среднеквадратичного отклонения u(t) от uc(t): модели функции f(t) и с; - статистический вес 1-го канала. Так как счет фотонов подчиняется пуассоновскои статистике, стандартное отклонение о\ равно квадратному корню из числа отсчетов в данном канале: сг,- = ut . Минимальное значение %2 указывает на наилучшее совпадение. Принято считать, что при %2 2 качество аппроксимации неудовлетворительное, а при %2 1.2 - хорошее [28]. Наиболее распространены одно-, двух- и трехэкспоненциальные функции N подгонки: f(t) = J] а, ехр(-11г,-), N 3. Следует подчеркнуть два важных обстоятельства. В том случае, когда параметрами аппроксимации являются и амплитуды а І и времена ц, задача восстановления функции/является некорректно поставленной. Это означает, в частности, что при сколь угодно высокой точности измерения аппаратной функции р мы не можем гарантировать соответствующей точности определения функции/ Во-вторых, следует иметь в виду, что достаточно распространены модели аппроксимации, которые помимо экспонент содержат еще и постоянную составляющую.
Учет последней необходим только лишь при наличии строгой физической мотивации (например, постоянный фон, связанный с паразитной засветкой). Но даже при обоснованном включении в модель постоянной составляющей следует избегать ее варьирования и пытаться определить ее при помощи прямых измерений. Опасность варьирования постоянной составляющей состоит в том, что в рассматриваемой модели времена затухания оказываются связанными с ее величиной. То есть в довольно широких пределах варьирования для каждого значения постоянной составляющей находятся свои значения времен затухания. Ясно, что аппроксимации такого рода смысла не имеют. В случае 1-3-экспоненциальной модели задача определения параметров может быть решена при помощи, например, метода Ньютона-Гаусса [20]. Ставится задача определения такой аппроксимирующей функции F, для которой Fj(z) = ui, где 1 - вектор параметров (2 = \Zj},j = 1, ..., АО и щ - экспериментальные точки (/=1, ...,M;M N). Введем невязку ф(г) = ( .(г)-«;.)2 . Необходимо найти такой 2\ при котором невязка минимальна. Реализуем итерационный процесс: зададим 2к (произвольным образом) и будем искать по нему 2 +1. Произведем линеаризацию F{l) в точке 2к Заметим, что, вообще говоря, минимизация Ф не обязана обеспечивать минимизации Ф.
Находим 2Л+1 из условия минимизации Ф(г): — = 0 при любом j. Таким dZj образом, получаем систему линейных алгебраических уравнений: или матричное уравнение относительно поправок АЫ =р, Решаем систему и изменяем вектор параметров: 2Л+1 = 2к + S Д2. В случае сильной взаимной зависимости параметров на диагональ матрицы добавляется произвольная величина: акк = а +а (смысл введения добавки - в отклонении градиента от направления наискорейшего спуска). Однако, в ряде случаев модель с конечным числом экспонент оказывается несостоятельной.
Так происходит, например, при аппроксимации кинетик затухания интенсивности флуоресценции образцов, в которых происходит процесс ориентационной релаксации окружения флуорофора. В этом случае затухание в принципе не является экспоненциальным и ставится задача построения гладкой кривой, которая обеспечивала бы минимальное значение %2: Для этой цели был предложен метод многоэкспоненциальной функции затухания [29]. Основная идея этого метода состоит в том, чтобы производить обратную свертку с переменным числом экспонент. Заметим сразу, что в отличие от случая аппроксимации 1-3 экспонентами, сами значения времен затухания не имеют физического смысла. Функция/ в таком случае будет иметь следующий вид:
Флуоресцентная спектрохронография белкамелиттина
Метод флуоресцентной спектрохронографии позволяет определять параметры внутримолекулярной динамики белковых молекул в случае если в молекуле происходит процесс ориентационной релаксации микроокружения хромофора и если характерное время этого процесса сопоставимо с временем жизни флуоресценции. Схематическое представление процесса ориентационной релаксации приведено на рис. 3.2.1. Если при поглощении кванта света собственный дипольный момент хромофора изменяется по величине и/или направлению (как это происходит при фотовозбуждении триптофана - основного естественного хромофора белков), он выходит из равновесия со своим микрокружением. Последнее релаксирует вокруг изменившегося дипольного момента, и время-разрешенный спектр сдвигается в длинноволновую сторону (рис. 3.2.1). Другим проявлением процесса является увеличение времени жизни флуоресценции с увеличением длины волны флуоресценции (быстрое затухание на коротковолновом краю спектра и медленное - на длинноволновом). Если характерное время этого процесса сравнимо с временем жизни флуоресценции, то сдвиг спектра приведет к уменьшению времени затухания на коротковолновом краю спектра. Белок мелиттин - основной компонент пчелиного яда. Молекула мелиттина состоит из 26 аминокислотных остатков. Биологическое действие белка основано на его способности встраиваться в липидные мембраны, вызывая в них существенные изменения. Характер этих изменений зависит от соотношения белок-липид: "разжижение" липидного бислоя, образование ионного канала, лизис мембраны [35]. Мелиттин удобен для исследований методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, так как содержит единственный остаток ароматической аминокислоты (триптофан, Тгр19), являющийся хорошо изученным естественным хромофором. В растворе в зависимости от условий среды мелиттин может существовать в мономерной и тетрамерной формах; структура этих форм хорошо изучена. При низкой концентрации, низкой ионной силе раствора и нейтральных значениях рН молекула белка является мономером и представляет собой статистический клубок (полностью неупорядоченная конформация) [36].
Стационарный спектр флуоресценции имеет максимум на длине волны 352 нм [37, 38], как и спектр триптофана в водном растворе. При высокой ионной силе раствора мелиттин самоагрегирует в тетрамер. В этом случае его молекула представляет собой высокоупорядоченную пространственную структуру с высоким (65-70%) содержанием ос-спиральных участков [37], причем отдельные субъединицы в тетрамере спектроскопически эквивалентны [39]. Стационарный спектр флуоресценции тетрамера смещен в коротковолновую область и имеет максимум на 333 нм [37, 38]. Стационарный спектр флуоресценции и количество ос-спиральных участков у тетрамерного мелиттина в растворе и у белка, встроенного в мембрану, близки [35]. Мелиттин выделялся из пчелиного яда при помощи гельфильтрации и ионообменной хроматографии [38]. В экспериментах использовались растворы мелиттина с концентрацией 10 мкМ в 50-мкМ трис-буфере (рН 7.4). Тетрамерную форму получали в таком же растворе при добавлении 2М NaCl. Липосомы из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) готовили озвучиванием. Температурная стабилизация образцов осуществлялась с точностью +2С. Для фотовозбуждения использовались импульсы излучения IV гармоники Nd:YAG лазера (А. =266 нм, химп «100 пс). Данные стационарной флуоресцентной спектроскопии позволяют сделать предположения о внутримолекулярной динамике белка.
В случае мономера триптофан экспонирован в воду. Релаксация микроокружения (молекул воды) происходит за пикосекундные времена. Поскольку характерное время жизни триптофановой флуоресценции принадлежит наносекундному диапазону, изменений времени жизни по полосе флуоресценции или сдвигов время-разрешенных спектров ожидать не следует. Напротив, коротковолновый сдвиг стационарного спектра флуоресценции тетрамера указывает на частично неполярное окружение триптофана и его "защищенность" от воды. Таким образом, в тетрамере микроокружением являются уже не молекулы воды, а аминокислотные остатки белка, перестройка которых происходит за значительные времена, поскольку речь идет о конформационных изменениях высокоупорядоченной структуры. Особенно интересным представляется сравнение данных флуоресцентной спектрохронографии раствора тетрамера и белка, встроенного в мембрану (стационарная спектроскопия дает практически одинаковые результаты). Начнем с результатов по флуоресцентной спектроскопии мономерного мелиттина. Измерялись кинетики затухания интенсивности флуоресценции на восьми длинах волн в диапазоне 310-390 нм. Удовлетворительного качества аппроксимации (см. раздел 2.5) удавалось добиться уже при двухэкспоненциальной модели затухания. На рис. 3.2.2 представлена зависисмость среднего времени жизни флуоресценции от длины волны флуоресценции. Видно, что время жизни практически не изменяется по полосе флуоресценции. Такое поведение параметра в точности соответствует представлению о быстрой релаксации (водного) микроокружения триптофана в мономерном мелиттине. Уменьшение времени жизни при увеличении температуры объясняется температурным тушением флуоресценции. На рис. 3.2.3. представлены данные, полученный для тетрамерного мелиттина в растворе. Видно монотонное возрастание среднего времени жизни флуоресценции, характер которого изменяется при изменении температуры раствора.
Такое поведение кривых полностью соответствует предположению о наличии релаксационной динамики окружения триптофана в наносекундном временном диапазоне. Для того, чтобы пронаблюдать изменение время-разрешенных спектров флуоресценции был проведен дополнительный эксперимент, в котором число измеренных кинетик затухания было увеличено до 19. Увеличение количества экспериментальных кривых позволяет повысить точность аппроксимации спектров. На рис. 3.2.4. представлены время-разрешенные спектры флуоресценции тетрамерного мелиттина. Ширина временного окна, в пределах которого производилось интегрирование по времени, составляла 0,6 нс. Видно, что как и ожидалось, спектр флуоресценции смещается в длинноволновую сторону с увеличением времени задержки относительно импульса возбуждения. Анализ время-разрешенных спектров показал, что их форма меняется во времени незначительно (в пределах указанной ошибки эксперимента). В связи с этим дальнейшая обработка экспериментальных данных проводилась следующим образом. Аппроксимировали спектр в "нулевой" момент времени (см. раздел 2.5.2). Параметры аппроксимации фиксировали и считали, что они не являются функциями времени. Предполагали, что спектр смещается во времени по экспоненциальному закону с характерным временем % (время ориентационной релаксации). При этом положение любой характерной точки спектра (например, максимума) изменяется во времени по закону v = v0 + Ду-(1-ехр(-#%)). Затухание интенсивности флуоресценции на любой длине волны определяется как собственно уменьшением населенности возбужденного состояния, так и движением спектра флуоресценции. Считая, что параметры затухания в отсутствие процессов релаксации (времена жизни и относительные амплитуды) не зависят от длины волны, осуществляли аппроксимацию всех кинетик затухания при заданной форме спектра. Варьируемыми параметрами были ть х2, а/а2 (использовалась двухэкспоненциальная модель затухания) и %. Таким образом для пяти значений температуры раствора тетрамерного мелиттина получили пять значений времени релаксации (рис. 3.2.5). В предположении активационного характера процесса xR ехр(у7), где Еа
