Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ основных классов фотосенсибилизаторов, и методики флуоресцентной диагностики и терапии с их применением .
1.1. Основные классы фотосенсибилизаторов, используемых в клинической практике 10
1.2. Механизм взаимодействия света с фотосенсибилизатором в биологической ткани 14
1.3. Методики флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии патологий тканей заднего отдела глаза 16
1.4. Оптические характеристики и особенности распространения лазерного излучения в глазных тканях 27
1.5. Лазерно-спектроскопическая аппаратура контроля концентрации фотосенсибилизатора в биологической ткани 34
В ы вод ы 36
Глава 2. Разработка методов и аппаратуры для исследования спектральных свойств глазных патологий .
2.1. Методы обработки спектральных данных и модели распространения светового излучения в тканях глаза 37
2.2. Создание методики и аппаратуры для одновременной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии с использованием лазерно-индуцированной флуоресценции 47
2.3. Разработка алгоритмов одновременного захвата, обработки и вывода цветного и флуоресцентного изображений 59
2.4. Создание программного модуля для анализа изображений 69
2.5. Оптимизация системы фильтров флуоресцентного и цветного каналов системы регистрации изображений 70
2.6. Разработка и методика создания тест-объекта для оценки характеристик лазерного спектроскопического комплекса 78
Выводы 82
Глава 3. Исследование взаимодействия лазерного излучения с тканями глаза, содержащими Фотосенс .
3.1. Подготовка биологических моделей тканей глаза для исследования распространения светового излучения в глазных средах 82
3.2. Исследования взаимодействия терапевтического лазерного излучения с тканями переднего отдела глаза 83
3.3. Исследование распространения лазерного излучения в прозрачных средах глаза 94
3.4. Исследование светорассеивания в тканях сетчатки 101
Выводы 118
Глава 4. Применение аппаратуры для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии тканей глаза на экспериментальных моделях и в клинике
4.1. Исследование световых мощностей терапевтического и диагностического режимов 119
4.2. Исследование накопления фотосенсибилизатора в новообразованных сосудах роговицы с помощью флуоресцентных изображений 122
4.3. Апробация аппаратуры для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии тканей глаза на экспериментальных моделях 124
4.4. Исследование флуоресцентных изображений опухолевых образований переднего и заднего отделов глаза 127
4.5. Клиническое использование разработанных методов и аппаратуры для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии тканей глаза 131
Выводы 135
Заключение 136
Список литературы
- Методики флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии патологий тканей заднего отдела глаза
- Создание методики и аппаратуры для одновременной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии с использованием лазерно-индуцированной флуоресценции
- Исследования взаимодействия терапевтического лазерного излучения с тканями переднего отдела глаза
- Исследование накопления фотосенсибилизатора в новообразованных сосудах роговицы с помощью флуоресцентных изображений
Введение к работе
В связи с бурным развитием научно-технического прогресса происходит внедрение достижений лазерной физики в медицину. Одним из наиболее впечатляющих достижений является метод флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ)[ 15,16,32,129]. На сегодняшний день метод активно развивается и внедряется в медицинскую практику[3,14,128], поскольку обладает рядом существенных достоинств по сравнению с традиционными методами диагностики и лечения, а именно:
отсутствие вредных излучений позволяет неоднократного "'повторять процедуры лечения
избирательное накопление фотосенсибилизатора в области патологии и нетепловое воздействие на очаг патологии дает возможность сохранить окружающие здоровые ткани при проведении лечения
возможность контроля концентрации препарата в ткани по характерной флуоресценции позволяет проводить неинвазивные исследования
использование доступных на сегодняшний день высоко чувствительных
аппаратных средств регистрации флуоресценции позволяет выявлять
заболевания на ранних стадиях
ФД и ФДТ уже активно применяется в онкологии, и в ряде случаев
рассматривается как альтернатива традиционным методам лечения и
диагностики опухолевых заболеваний[43,86,91,180]. Успехи фотодинамики в
этой области дали сильный толчок к проведению исследований по
возможности ее внедрения и в других направлениях медицины. В настоящее
время ФДТ уже хорошо зарекомендовала себя в области
дерматологии[4,78,181]. Ведется внедрение методов ФД в области гастро-
эндоскопии для диагностики онкологических заболеваний [20,22], а так же
для диагностирования и лечения ряда офтальмологических
псевдоопухолевых новообразований[161,176]. Основополагающим
компонентом ФД и ФДТ является фотосенсибилизатор(ФС) - препарат, избирательно накапливающийся в области патологии и инициирующий
фото динамические реакции под действием света [16,129]. Несмотря на то, что на сегодняшний день существует большое количество этих веществ, успешно применяемых в клинике, создаются новые классы препаратов, ведется интенсивный поиск наиболее эффективного. Однако исследования возможности использования нового препарата представляет собой комплексную многоэтапную задачу, решение которой требует детального изучения физических процессов, протекающих в фотосенсибилизированных биологических структурах под действием света с целью оценки световой дозиметрии, а так же создание соответствующих систем контроля [7]. Необходимость в проведении комплекса подобных исследований ставится обязательными условиями безопасности, как разрабатываемой методики, так и аппаратуры. Решение вышеперечисленных задач осуществляются индивидуально для конкретного ФС, в зависимости от его физико- . химических свойств, а так же от индивидуальных оптических свойств исследуемой биологической ткани.
На сегодняшний день ФД и ФДТ активно развивается и в нашей стране. " В России в клинической практике используется препараты Аласенс, Фотогем [17]. Одним из наиболее перспективных отечественных ФС второго * поколения, разрешенного в России для лечения онкологических заболеваний, является препарат на основе фталоцианинов - Фотосенс (ГНЦ НИОПИК, Москва)[17,18]. Препарат обладает как высоким фотодинамическим эффектом, а так и способностью флуоресцировать. Фотосенс уже хорошо зарекомендовал себя в области онкологии[179].
Актуальность работы. Существует ряд широко распространенных глазных заболеваний, таких как субретинальная неоваскулярная мембрана (СНМ), эффективным методом лечения которой во всем мире признана ФДТ[172,182]. Актуальность задачи создания методики ФД и ФДТ СНМ с использованием отечественного препарата Фотосенс определяется как отсутствием других эффективных методов лечения, так и отсутствием разрешения на использование импортного ФС Визудин (Ciba Vision,
США)[176,164] на территории России. Помимо этого довольно высокая стоимость, как импортной аппаратуры, так и самого ФС Визудин, затрудняют его внедрение в отечественную клиническую практику. Фотосенс обладает способностью флуоресцировать, что в отличие от западных методик, дает возможность совмещения процедуры лечения и диагностики, что в значительной степени увеличивает эффективность лечения по сравнению с западными аналогами. Однако впервые использование данного ФС для лечения глазных патологий требует детального исследования взаимодействия лазерного излучения (длина волны 675 нм) с фотосенсибилизированными тканями глаза для оценки безопасности методик и избирательности воздействия на очаг патологии.
Цель исследования
Целью настоящей работы ставилось исследование взаимодействия
лазерного излучения с фотосенсибилизированными тканями глаза для
разработки методики визуализации флуоресцирующих
фотосенсибилизированных патологических очагов ткани глаза, разработка аппаратных средств для проведения одновременной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии глазных патологий.
Задачи.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Создание методики флуоресцентной диагностики глазных патологий на экспериментальных моделях с применением лазерной и спектроскопической аппаратуры.
Создание методики видеофлуоресцентной диагностики глазных патологий с применением цветных и высокочувствительных монохромных ПЗС-матриц.
Разработка алгоритмов обработки видеофлуоресцентных изображений патологий глаза для повышения диагностической контрастности.
Создание лазерного спектроскопического комплекса на базе современных офтальмологических приборов, предназначенных для визуализации патологий глаза, а также со специально созданными полупроводниковыми лазерами и видеофлуоресцентными системами регистрации и обработки.
Создание экспериментальных моделей, имитирующих флуоресцирующую структуру глазного дна с соответствующими характерными размерами для оценки чувствительности и пространственной разрешающей способности аппаратуры.
6. Исследование взаимодействия лазерного излучения с различными
тканями глаза, содержащими ФС в диагностических и терапевтических
дозах. Отработка режимов проведения ФД и ФДТ патологий глаза на
экспериментальных моделях.
7. Оценка эффективности применения разработанных методов и
аппаратуры на экспериментальных животных и на пациентах с различными
глазными патологиями.
Научная новизна исследования.
Проведены исследования взаимодействия лазерного излучения (с длиной волны в спектральном диапазоне 675+4 нм и мощностью до 2.5 Вт (плотность мощности от 100 до 1000 мВт/см)) с тканями глаз экспериментальных животных (кроликов), содержащими препарат Фотосенс при вводимой дозе ФС от 0.01 до 0.5 мг/кг веса животного.
Создана аппаратура для одновременной регистрации флуоресцентного и цветного изображений патологий глазного дна
Разработан оригинальный тест-объект для оценки пространственной разрешающей способности и чувствительности оптической части системы регистрации флуоресцентных изображений.
Реализован метод одновременной диагностики и фотодинамической терапии с контролем за ее проведением патологий сетчатки с
использованием одного ФС и в рамках одной процедуры. Получено положительное решение на патент РФ (№2003 126 738 от 03.09.2003).
Разработана оригинальная лазерно-спектроскопическая методика
оценки безопасности применения фотосенсибилизатора для ФД и ФДТ
глазных патологий
Практическая значимость.
Разработан метод и аппаратура для лечения субретинальной неоваскулярной мембраны и некоторых видов опухолей. Разработанные методы и аппаратура проходят клинические испытания в ГУ НИИ Глазных болезней РАМН Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова. Первые результаты показали хорошую эффективность для лечения некоторых патологий глаза.
Положения, выносимые на защиту.
Разработанный алгоритм обработки спектрально-флуоресцентных изображений обеспечивает получение высококонтрастных изображений флуоресцирующих очагов в режиме реального времени при минимальной инерционности обработанного изображения.
Разработанная методика обеспечивает проведение лазерно-флуоресцентных исследований и фотодинамического воздействия патологических очагов в рамках одной процедуры и с использованием одного ФС.
Схемные решения специализированного оптического лазерного адаптера обеспечивают безопасность прилегающих к области патологий здоровых тканей при проведении ФД и ФДТ.
Совмещение процедур спектральных исследований и фотодинамического разрушения патологии с препаратом Фотосенс обеспечивается оптической системой, имеющей следующие характеристики:
- оптический фильтр высокочувствительной матрицы: зона высокого
пропускания 685-715 нм, длина волны на полу высоте - 688 нм, 713 нм
оптический фильтр осветителя: зона высокого пропускания 400-665 нм, длина волны на полувысоте - 663 нм
оптический фильтр лазерного источника: зона высокого пропускания 655-682 нм, длина волны на полувысоте - 657 нм, 679 нм
оптический фильтр канала цветной камеры: зона высокого пропускания 400-665 нм, 717-900 нм, длина волны на полу высоте - 663 нм, 720 нм
' Пропускание оптических фильтров: в зоне низкого пропускания не более
0.01%, в зоне высокого пропускания не менее 85%.
Эффекты поглощения и светорассеяния в глазных тканях лазерного излучения с длиной волны 675+4 нм не влияют на безопасность и избирательность поражения патологического очага при проведении процедур ФД и ФДГ с Фотосенсом.
Оптимальным режимом ФД и ФДТ с применением Фотосенса является режим, при котором терапевтическая плотность мощности излучения составляет 500-700 мВт/см, время экспозиции 120 с, концентрация препарата (0.1-0.5)мг/кг. Безопасная диагностическая плотность мощности составляет 50 мВт/см , при времени экспозиции до 5 минут. Оптимальное время проведения терапии 2-3 сутки после введения препарата.
Апробация работы.
^И Материалы диссертации докладывались на ряде научных конференций: на
международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (Санкт-Петербург, 2001), на научно-практической конференции российских ученых "Актуальные вопросы лазерной медицины" (Москва-Калуга. 2002), на конференции "The International Conference on Advanced Laser Technologies" (Bedfordshire, UK, 2003), на научно-практической конференции МИФИ (Москва, 2003), на международной научной конференции "VIII International Conference Laser and Laser-Information Technologies. Fundamental
Problems and Application" (Bulgaria, 2003), на международной конференции "IX World Congress of the International Photodynamic Association" (Miyazaki, Japan, 2003), на международной конференции по фотобиологии "ESP 2003 10th Congress of the European Society for Photobiology" (Австрия, 2003).
Методики флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии патологий тканей заднего отдела глаза
30 лет назад Hogan [103] изучил статистику по данному заболеванию и спрогнозировал, что СНМ представит собой серьезную экономическую и социальную проблему. Его оценка оправдалась, и по некоторым данным на сегодняшний день в мире более 38 млн. человек страдают слепотой, 110 млн. имеют слабовидение и высокий риск развития слепоты, вследствие появления СНМ [90]. В будущем, по прогнозам специалистов, в развитых странах намечается значительный рост данного заболевания[79,80,169,176]. Несмотря на высокую распространенность патологии и многочисленные исследования в этой области, причины его возникновения до конца не нзучены[79,169]. Это не позволяет выработать однозначные рекомендации по предотвращению появления заболевания, в связи с чем, перед исследователями стоит задача поиска наиболее эффективного и чувствительного метода диагностики и лечения СНМ.
На сегодняшний день диагностика и лечение представляют собой две разнесенных по времени процедуры, которые выполняются на различной аппаратуре, и часто одна значительно предшествует другой. Основным направлением в диагностике СНМ является визуализация мелких очагов патологии. Для решения этой задачи требуются технические средства, обеспечивающие получение изображений с высоким разрешением, при проведении анализа которых можно было бы точно определить наличие очагов патологии на как можно более ранней стадии развития, определить их точные размеры и форму, а так же локализацию на глазном дне. Основной проблемой является то, что по обычным цветным снимкам глазного дна, i которые могут быть получены с использованием стандартной аппаратуры для проведения глазных исследований, в большинстве случаев решение данных задач не представляется возможным. Кроме того, очень часто диагноз, основанный на этих данных, зависит от трактовки и индивидуального опыта конкретного врача. В связи с этим на сегодняшний день, для решения этой проблемы учеными опробуются практически все фундаментальные достижения физики. Основными направлениями являются спектроскопические методы [57,142,172], конфокальная микроскопия[75,77,95,114], а так же оптическая когерентная томография [95,96,97].
К спектроскопическим методам визуализации СНМ относится телевизионная ангиография с "индоцианином зеленым" (или флуоресцентная ангиография с флуоресциином натрия)[55]. Для реализации диагностики данным методом пациенту вводят флуоресцеин натрия (при флуоресцентной \ ангиографии) либо индоцианин зеленый (при телевизионно-оптической ангиографии). Исследования показали, что в области СНМ наблюдается просачивание крови, а так же введенного флуоресцирующего агента через стенки новообразованных сосудов, вследствие чего образуется ее депо в области патологии [186]. После введения препарата проводят облучение глазного дна излучением осветителя в спектральном диапазоне соответственно 455-490 нм (при флуоресцентнной ангиографии) либо 805 нм (при телевизионно-оптической ангиографии). Далее наблюдают изображение исследуемого объекта, полученное видеокамерой видеоканала в спектральном диапазоне 520-530 нм (при флуоресцентной ангиографии) либо 835 нм (при телевизионно-оптической ангиографии), на основании чего делают вывод о наличии и степени патологических изменений [42,51,85,122]. Для получения более детальной информации при таких процедурах предпочтительнее использование индоцианина зеленого, возбуждаемого в более длинноволновой области и, как следствие этого, наиболее эффективное проникает через слой пигментного эпителия, имеющего значительное поглощение в видимой области. Процедуры выполняются на фундус камерах, специально оснащенных видео каналом с цветной камерой высокого разрешения, соединенной с системой захвата изображений на базе персонального компьютера. На данный момент спектральные методы являются наиболее эффективными и широко используемыми методами диагностики и контроля лечения заболевания [90,166]. Однако, несмотря на их распространенность, они дают только поверхностное изображение, по f которому невозможно определить состояние биоткани после воздействия на нее терапевтическими средствами, а так же оценить степень поражения биологической ткани в зоне патологии. Для решения этих задач в последние годы опробуются сканирующие конфокальные офтальмоскопы[68,75,135].
Действие этих приборов основано на конфокальном принципе (две оптически сопряженные диафрагмы малых размеров в плоскости объекта и изображения). Лазерное излучение фокусируется на глазном дне в пятно, малого диаметра. Рассеянный обратно свет проходит через узкую диафрагму, имеющую форму щели, круглого отверстия или же кольца, [62,73,74,76], и попадает на светочувствительный детектор, преобразующий интенсивность светового потока в напряжение. В диафрагму попадает свет, рассеянный в области фокусировки (вклад света в построение изображения, рассеянного вне области фокусировки пренебрежимо мал). Использование такого принципа позволяет получать высококонтрастные изображения, путем последовательного сканирования, сфокусированным излучением слоев сетчатки по 3D области. При наличии в слое области патологии, происходит заметное уменьшение числа обратно рассеянных фотонов, изменения поляризационных свойств излучения [42,122]. Использование источников инфракрасной области позволяет получить информацию о более глубоких слоях глазного дна[56,95,96,114]. На сегодняшний день в клиниках используется два вида конфокальных офтальмоскопов. Один из них разработан фирмами Неіо!е1Ье (Германия) и Laser Diagnostic Technologies (CIiIA)[77j, а другой офтальмоскопы фирмой Rodenstock Instrumente [68,184]. Однако, несмотря на широкое применение в клинике для выявления патологий сетчатки, основным недостатком является низкое на сегодняшний день количество сканов, что дает низкое разрешение полученного изображения. Это может привести к пропуску мелких очагов патологии, поэтому такие исследования чаще являются дополнением к телевизионной ангиографии и сканирование же чаще производят в уже установленной спектральными методами области. В литературе довольно часто встречаются попытки адаптации этих приборов для проведения флуоресцентной ангиографии с флуоресциином натрия (или телевизионной ангиографии с индоцианином зеленым), с целью формирования трехмерной флуоресцентной картины просачивания флуоресцирующего агента через стенки новообразованных сосудов[45,56,85,127,172]. Спектральные характеристики возбуждающего излучения и спектрального диапазона регистрации сигнала аналогичны тем, которые используются при проведении флуоресцентной ангиографии (см.выше.)[56,85]. Но несмотря на то, что некоторые офтальмоскопы обеспечивают довольно высокую скорость и практически позволяют снимать информацию в режиме реального времени[134,172], низкое разрешение, а так же по прежнему ограниченность поля сканирования, являются существенным ограничением, не позволяющим использовать эти приборы вместо спектральных методов.
Создание методики и аппаратуры для одновременной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии с использованием лазерно-индуцированной флуоресценции
Общее устройство лазерного спектроскопического комплекса(ЛСК) и методика проведения исследований на разработанной аппаратуре При создании аппаратуры, позволяющей проводить флуоресцентные исследования и фотодинамическое лечение глазных патологий, была использована стандартная щелевая лампа, которая была адаптирована для ФД и ФДТ с Фотосенсом. Дополнительно прибор был оснащен системой подачи излучения к патологическим очагам, дающей возможность фокусировки лазерного излучения на поверхности глазного дна в пятно, диаметром 100 - 1000 мкм, а так же специально разработанным видео адаптером, включающим в себя каналы формирования цветного и флуоресцентного изображений исследуемой поверхности. Структурная схема ЛСК представлена на рис.14.
Основным узлом стандартной щелевой лампы является микроскоп, дающий возможность увеличения исследуемой поверхности в диапазоне 5 — 36 крат(7,рис.14). Освещение исследуемой области осуществляется с помощью стандартного осветителя(1,2,3,4, рис.14) со встроенным галогеновым источником. Излучение осветителя формируется в щель посредством специальной диафрагмы (3, рис.14), и направляется в глаз пациента с помощью наклонной призмы.
Жесткое позиционирование осветителя относительно микроскопа щелевой лампы и центрирование световой щели относительно его линейного поля дают возможность освещения области, наблюдаемой в окуляры лампы. Система микроскоп- осветитель может перемещаться врачом с помощью стандартного манипулятора, за счет которого осуществляется плавная наводка на зону патологии в процессе проведения исследований. Разработанные лазерный адаптер(5,рис.14) и видеоадаптер , рис.14) так же жестко закреплены с системой микроскопа таким образом, что фокусировка лазерного излучения лазерным адаптером осуществляется в фокусной плоскости микроскопа щелевой лампы, а фокусная плоскость каналов видеоадаптера совмещена с фокусной плоскостью микроскопа. Положение сфокусированного лазерного пятна так же центрировано относительно линейного поля микроскопа щелевой лампы. Такое построение системы дает возможность контролировать облучаемый участок, как с помощью ПЗС матриц видеоадаптера, так и через стандартные окуляры щелевой лампы. Сформированные в каналах, видеоадаптера цветное и флуоресцентное изображения исследуемой поверхности передаются в специально разработанную систему обработки и вывода изображений, которая работает в режиме реального времени и разработанную на базе персонального компьютера.
Методика проведения ФД и ФДТ на разработанном комплексе осуществляется следующим образом. В диагностическом режиме осветитель (1,2,3,4, рис.14) облучает глаз пациента, а цветная видеокамера (11, рис.14) регистрирует рассеянное от нее излучение. Соответствующее изображение выводится на экран компьютера. При этом излучение осветителя офтальмологического прибора благодаря наличию в нем фильтра (4, рис. 14) не содержит компоненты, зашумляющей сигнал флуоресценции Фотосенса. Одновременно выходящее из адаптера излучение (6, рис.14), проходит гомогенизирующий элемент-расширитель пучка (5, рис.14), и облучает широким однородным пучком глаз пациента, вызывая флуоресценцию фотосенсибилизатора. Флуоресцентный сигнал через микроскоп (7, рис.14) попадает в видеоангализатор, где посредством системы оптического переноса изображения (14, рис.14), содержащую фильтр (9, рис.14), поступает на высокочувствительную ПЗС матрицу(10, рис. 14). Фильтр (9, рис.14) обеспечивает пропускание только флуоресценции на высокочувствительную видеокамеру. При этом ни рассеянное от глаза лазерное излучение, ни излучение посторонней засветки (включая излучение осветителя) через данный фильтр практически не поступает. В то же время, благодаря наличию в системе оптического переноса изображения(15, рис.14) на цветную матрицу(11, рис.14) специального фильтра (13, рис.14) рассеянное от глаза лазерное излучение широкого однородного лазерного пучка оказывается практически незаметным в цветной матрице. Благодаря этому цветная матрица формирует в видеоканале цветное изображение исследуемой зоны глаза пациента, а высокочувствительная видеокамера -флуоресцентное изображение данного участка, распределение яркости в котором соответствует распределению фотосенсибилизатора в тканях и сосудах глаза. Сопоставляя эти два изображения, офтальмолог делает вывод о наличии патологических изменений в исследуемой области, их топографии, размерах.
В терапевтическом режиме гомогенизирующий элемент-расширитель пучка (5, рис.14) убирается, и выбранный патологический участок глазного дна облучается сфокусированным пучком лазерного излучения. При этом благодаря наличию фильтра (9, рис.14) высокочувствительная телекамера (10, рис.14) контролирует только интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора в облучаемом месте, поскольку рассеянное лазерное излучение на нее не проходит. Контроль изменения флуоресценции при терапевтическом облучении позволяет судить об интенсивности проходящих фотохимических реакций. Цветная ПЗС матрица (11, рис.14) в терапевтическом режиме регистрирует цветное изображение глазного дна и ослабленное по яркости не менее чем в 10 (см. ниже).
Исследования взаимодействия терапевтического лазерного излучения с тканями переднего отдела глаза
Исследования проводились на свежих энуклеированных глазах экспериментальных животных, в качестве которых брались кролики (самцы массой 2-2.5 кг). Для исследования распространения светового излучения в глазных средах животные забивались путем воздушной эмболии. После этого глаза энуклеировались. У свежих биологических образцов удалялись не прозрачные ткани, такие как склера, хориокапилярный слой, с целью регистрации распределения световой энергии внутри образца.
При исследовании распространения флуоресцентного сигнала в глазных тканях, проводимых в 3.4, животным вводился Фотосенс в концентрации 0.1 мг/кг. Данная концентрация близка к концентрации, которая необходима для достижения фотодинамической деструкции тканей в области СНМ. Забой проводился на 8-12 минутах после введения препарата, что соответствовало времени максимального накопления ФС в сосудистой системе глаза. Контроль концентрации препарата в сосудах дополнительно осуществлялся с использованием спектрометра Lesa 01- Biospec USB 2.0. Проведение исследований непосредственно после подготовки биологических образцов обеспечивало прозрачность сред, которая так же регулярно контролировалась во время проведения экспериментов.
Так же исследовалось содержание Фотосенса в стекловидном теле и хрусталике, поскольку проникновение ФС в эти ткани могло бы вызвать помутнение сред вследствие фотодинамического эффекта во время процедуры ФДТ. Параллельно, содержание препарата в прозрачных средах глаза меняет их спектральные характеристики, что необходимо учитывать при расчете световой дозиметрии. Содержание Фотосенса в этих средах проводилось путем ввода животным ФС в концентрациях 0.1 - 0.5 мг/кг. Измерения концентрации проводились на 3 - 8 сутки после введения. Наличия препарата в этих тканях не обнаруживалось.
При доставке излучения к глазному дну свет распространяется через роговицу и хрусталик, где происходит его многократное рассеяние в присутствии ближнего порядка рассеивателей. Взаимодействие лазерного излучения при многократном рассеянии в тканях глаза описывается сложным аналитическим выражением:
Где I0(a) - индикатриса рассеяния изолированной частицы, а F - функция, учитывающая многократное рассеяние. Для диэлектрических цилиндров (фибрилл роговицы) она определяется следующим образом: где Jo - функция Бесселя нулевого порядка, г - радиус вектор рассеивателя, g(r) - распределение рассеивающих центров по области распространения светового излучения, а S - единичный вектор падающей волны, ар — плотность рассеивателей. Для сферических частиц (для хрусталика) функция определена следующим выражением:
Вторые члены функции многократного рассеяния учитывают влияние актов рассеяния на рассеянный на данной частице фотон. Учитывая тот факт, что плотность рассеивателей в роговице и хрусталике неравномерна (функция g(r)), а так же и то, что распределения несимметричны, то перераспределение световой волны в этих тканях происходит довольно сложно.
Поскольку воздействие на очаг патологии при ФДТ происходит за счет нетеплового фотохимического процесса, для инициации которого требуется относительно низкие плотности мощности, то такое перераспределение излучения передними отделами глаза может инициировать фотодинамический эффект в прилегающих к облучаемой области здоровых тканях. Это в значительной степени может снизить избирательность поражения очага патологии при проведении ФДТ. В связи с этим необходимо было оценить порядок рассеянного излучения на данной длине волны тканями переднего отдела и оценить возможность инициации этим излучением фотодинамической деструкции прилегающих здоровых тканей.
Модели рассеяния в передних тканях исследовались и раньше[27], однако для максимального приближения модели к реальному объекту были взяты биологические образцы, подготовленные в соостветствии с 3.1, у которых удалялась задние непрозрачные ткани. Это давало возможность просвечивать биологические образцы и регистрировать распределение светового поля после прохождения светом передних отделов глаза. Образцы исследовались на стенде, схема которого представлена на рис.36. В качестве источника лазерного излучения был взят лазер ЛФТ-675-Биоспек (Biospec, Москва) мощностью излучения 2,5 Вт и длиной волны излучения 675 нм. Излучение к стенду от источника подводилось с помощью оптического волокна, с числовой апертурой 0.22, диаметром 400 мкм. Для ввода излучения в зрачок перед торцом оптического волокна была помещена собирающая линза с фокусным расстоянием 10 мм, и диафрагма, с изменяемым диаметром отверстия, которым регулировалась ширина пучка. Этими элементами производилось формирование слаборасходящетося пучка.
Исследование накопления фотосенсибилизатора в новообразованных сосудах роговицы с помощью флуоресцентных изображений
Для подтверждения работоспособности, как аппаратуры, так и метода была создана модель, имитирующая накопление препарата в субретинальном пространстве, с помощью которой можно оценить накопление фотосенсибилизатора в заднем отрезке глаза при развитии субретинальной неоваскуляризации. Режимы ФДТ и ФД с помощью ЛСК проводилось у 30 животных. Модель получена при проведении аргонлазерной коагуляция глазного дна кролика (диаметр коагулята 0.2 мм, мощность лазера 550-850 мВт, время экспозиции 0.15 сек, количество коагулятов - 5). На рис.67, приведено изображение пяти свежих лазеркоагулятов на глазном дне с перифокальным отеком и локальной отслойкой пигментного эпителия, полученных в канале цветной камеры ЛСК. Наличие дистрофического очага подтверждалось с помощью гистологических исследований. Спустя третьи сутки после воздействия на ткани глазного дна лазерным излучением и достаточной прогрессией отека вследствие термического повреждения тканей, животным внутривенно вводился препарат Фотосенс в концентрации 0.3 мг/кг.
Накопление препарата в зоне патологии контролировалось по флуоресцентной картине. В интересующей области препарат появлялся с первых минут после введения (рис.68(А)). Концентрация препарата в окружающих тканях дополнительно проводилась по флуоресценции диска зрительного нерва Из-за высокой концентрации кровеносных сосудов в этой области, питающих глазные среды, отмечался высокий уровень флуоресцентного сигнала. 124 Рис. 67. Стрелками на изображении отмечены патологические участки в канале цветной камеры. Характерные размеры очагов патологии составляют 200 мкм. Рис.68. Флуоресценция Фотосенса, аккумулированного в зоне экспериментальной модели патологии в первые минуты (А), два дня спустя (В) после введения. Флуоресценция диска зрительного нерва (Б) в первые минуты после введения.
Очаг патологии продолжал флуоресцировать спустя несколько суток после введения препарата (рис.68 (В)), несмотря на то, что флуоресценции в области диска зрительного нерва практически не наблюдалось. Контроль концентрации препарата в очаге патологии на вторые сутки проведенный с помощью спектрометра Lesa-01-Biospec приведен на рис. 69.
Как видно из приведенных данных, интенсивность флуоресценции сопоставима с флуоресценцией специального тест объекта, интенсивность которой соответствует объемной концентрации препарата 1.5 мг/л. Такая концентрация препарата является достаточной для инициации фотодинамического эффекта и является достаточной для заметного повреждения фотосенсибилизированной ткани. В связи с этим было произведено облучение очага плотностью мощности 500 мВт/см2, что соответствует терапевтической плотности мощности. Экспозиция составляла 90 с. Спустя трое суток было проведено повторное визуальное обследование очагов патологий. На рис.70, приведено полученное в канале высокочувствительной камеры изображение области патологии после терапевтического воздействия.
Изображение запустевших рубцов в области патологии после воздействия лазерным излучением.
На приведенном изображении видны запустевшие рубцы на месте очагов патологии, после воздействия терапевтической плотностью мощности, что свидетельствует о положительном результате ФДТ. Наличие избирательной фотодинамической деструкции области экспериментальной отслойки пигментного эпителия была подтверждена гистологически.
Таким образом, система доставки лазерного излучения ЛСК обеспечивает подвод достаточного количества световой энергии для инициации фотодинамического эффекта. Вводимые дозы ФС, совместно с используемыми плотностями мощности обеспечивают фотодинамическую деструкцию очагов патологии. Чувствительность системы визуализации при вышеуказанных плотностях мощности и концентрациях препарата позволяет контролировать ход лечения по флуоресцентным изображениям.
Исследование флуоресцентных изображений опухолевых образований переднего и заднего отделов глаза.
Разработанная аппаратура позволяет проводить ФД и ФДТ опухолевых заболеваний глаза. Проведение традиционных методов лечения, таких как химия терапия, хирургическое вмешательство, а так же радиотерапия являются довольно травматичными для глаза и обеспечивают сравнительно низкое избирательное воздействие. Особенно проведение данных процедур осложняется при локализации опухолей в задних отделах глаза. Разработанный ЛСК обеспечивает доставку излучения к задним отделам глаза, а так же визуальный контроль за распределением препарата на глазном дне с помощью флуоресцентных изображений. Помимо этого возможность фокусировки лазерного излучения на глазном дне в пятно диаметром 100-1000 мкм обеспечивает избирательное поражение довольно мелких очагов патологий. В связи с этим была исследована возможность использования ЛСК для проведения ФД опухолевых заболеваний глаз.
Эксперимент проводился на 20 животных, которым была подсажена мелонома В-16 с локализацией в заднем отделе глаза (40 глаз). После трех недель, когда опухоль достигала достаточных размеров, животные были разделены на две группы. В этих двух группах животным вводился препарат Фотосенс в концентрации 0.1 мг/кг и 0.7 мг/кг. Контроль за динамикой накопления препарата осуществлялся как помощью системы визуализации ЛСК, так и с помощью спектрометра Lesa 01 Biospec USB 2.0.
Препарат регистрировался в патологическом очаге на первой минуте после введения. На рис.71 приведено изображение опухолевого очага полученного с канала высокочувствительной камеры. На изображении видны отдельные сосуды опухоли. На рис.72 приведены спектры флуоресценции опухолевого очага и нормальной конъюнктивы. Как видно из спектров в первые минуты значение коэффициента контрастности довольно низкое. Максимальный контраст патологического очага с окружающей нормальной тканью был зафиксирован на 3 сутки после введения. На рис. 73. приведено изображение очага на шестые сутки после введения. Видно, что весь опухолевый очаг равномерно флуоресцирует и не видно отдельных сосудов. Это происходит из-за частичного выхода ФС за пределы опухоли вследствие просачивания его через стенки патологических сосудов, имеющих "рваную структуру".
