Введение к работе
1. Актуальность темы.
Интенсивное развитие в последние годы оптических методов исследований биологических объектов, связанное в первую очередь с существенным прогрессом в области разработок лазерных источников с широким спектром управляемых параметров излучения, привело к формированию биомедицинской оптики, как нового научного направления, которая включила в себя лазерную хирургию, низкоинтенсивную терапию, фотодинамическую терапию, лазерную диагностику заболеваний, визуализацию биообъектов, оптику биотканей и. т.д.
В связи с этим, в настоящее время актуально детальное исследование характера и закономерностей протекания оптических процессов в биологических тканях. Особый интерес вызывают исследования флуоресцентно-спектральных особенностей биотканей, обусловленные развитием фуоресцентно-диагностических методов биомедицинской оптики.
Благодаря оперативности, хорошей воспроизводимости результатов и, что особенно важно, высокой чувсвительности к малым концентрациям исследуемого вещества, метод лазерного флуоресцентного анализа в последнее время стал активно применяться для решения широкого круга задач в области молекулярной биологии, цитологии, вирусологии, иммунологии, биофизики и биохимии мембран и т. д. В практической медицине указанный метод используется для диагностики важнейших физиологических процессов, для контроля за поступлением, превращением и выводом из организма лекарств, для диагностики большого числа заболеваний и т. д. В частности, в онкологии весьма актуальна задача неинвазивной оптической биопсии злокачественных опухолей на основе спектрально-флуоресцентного анализа. Однако проблема разработки эффективных оптико-диагностических методов и создания на их базе надежных клинических установок в полной мере еще не решена и требует активных исследований в данной области.
Уникальные достижения последних лет в области создания лазерных источников сверхкороткой длительности и развитие на их базе новых исследовательских методов, анализирующих дополнительные каналы взаимодействия свет-биообъект, инициируемых воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения, открыли новые экспериментальные возможности для исследователей. Е настоящее время представляется весьма актуальной разработка и внедрение в практику более информативных лазерных спектроскопических методов исследования свойств биосистем, среди которых ключевую роль могут иметь нелинейно оптические методы. К примеру, использование многофотонных экспериментальных схем позволяет инициировать новые каналы возбуждения флуоресценции квантово-механически запрещенные правилами отбора в режиме однофотонного взаимодействия и, следовательно, добиться высокоселективного взаимодействия [1]. В многофотонных схемах возможно достижение высоких степеней локализации светового поля в требуемой области пространства и значительное снижение уровня фонов. В режиме нелинейного взаимодействия новые перспективы исследований биообъектов связаны также с анализом когерентных эффектов генерации гармоник, преобразования частоты и т.д Указанные методы позволили экспериментально исследовать такое фундаментальное свойство живой природы как хиральность, то есті преимущественный выбор одного либо левого либо правого из двух возможных зеркальных изомеров одной и той же биомолекулы [2] Метод генерации второй гармоники (ГВГ) оказался эффективным і исследовании таких специфическим биосистем, как электрически ориентированные пурпурные мембранные пленки (ОПМП) и пленки Ленгмюра - Блоджета [3].
Между тем, нелинейные оптические эффекты в условиях неоднородной и сильно рассеивающей среды биотканей слабе изучены, что в настоящеее время является ограничительным фактором для их применения в задачах биомедицинской оптики.
Сформулированные выше нерешенные вопросы определили тем} и цели данной диссертационной работы.
Целью диссертационной работы является:
-
Создание лазерных источников с широким спектром управляемых выходных параметров для проведения спектрально-флуоресцентных исследований биотканей.
-
Исследование спектрального состава флуоресценции биотканей: определение вклада натуральных флуорофоров и инжектированных фотосенсибилизаторов.
-
Исследование физического механизма процесса тушения флуоресценции пиридиннуклеотидов (НАД*Н) в растворе и фотосенсибилизированных биотканях.
-
Исследование особенностей генерации второй гармоники в биотканях.
-
На основе проведенных исследований разработка комплекса линейно и нелинейно-оптических методов диагностики и терапии и изучение возможности их клинического применения в биомедицине.
Научная новизна.
1. Проведены первые экспериментальные исследования спектральных особенностей флуоресценции нормальной и опухолевой ткани при облучении на длинах волн 355 и 440нм. Состав и характерные формы спектров позволяют выделить пиридиннуклеотиды в качестве основных флуофоров. Получены значения параметра флуоресцентного контраста злокачественных и доброкачественных опухолей человека различной локализации, с применением фотосенсибилизирующего препарата флюренат. Показана эффективность применения флуоресцентного метода для оптической биопсии случаев опухолей желудочно-кишечного тракта и саркомы.
2. Впервые проведен экспериментальный и теоретический анализ явления тушения автофлуоресценции в биотканях. На основе рассчета эффективного радиуса переноса энергии электронного возбуждения в донор-акцепторных парах НАД*Н- флуоресцеин, НАД»Н - хлорин е6, а также исходя из экспериментальных результа-
тов выявлено формирование в биотканях концентрационных неоднородностей, обусловленных существованием центров локализации вводимых красителей. Показано влияние процесса переноса энергии на спектрально-однородное снижение уровня автофлуоресценции в фотосенсибилизированных тканях.
-
Впервые получены спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения хлорина е6 и Zn- тетрасульфофтало-цианина, при длине волны возбуждения 660нм, расположенной в "оптическом окне" биотканей. Показана возможность лазерной биопсии в области максимальных оптически достигаемых глубин 1см.
-
Предложен и на экспериментальной модели опухоли апробирован новый метод оптического диагнозирования, основанньш на подборе лазерного возбуждения на двух длинах волн, для которых существенно различны коэффиценты поглощения биоткани. Данный метод дает возможность определить важный клинический параметр: проникновение опухоли вглубь тканей.
-
Впервые в оптически непрозрачных мышечных тканях показано наличие двухфотонной флуоресценции и каскадной двухэтапной фотодиссоциации туморотропных фотосенсибилизаторов при воздействии пикосекундного лазерного излучения.
6. Впервые получена пикосекундная генерация ГВГ (532нм) в
различных мягких тканях животных. Продемонстрирована корреля
ция эффективности ГВГ с содержанием фибриллярного белка
коллагена.
Практическая ценность работы.
Разработанная в диссертации экспериментальная техника может быть использована для решения широкого класса спектроскопических задач оптики.
Проведенные в диссертационной работе исследования расширяют возможности оптических методов в биомедицине. Разработанные линейно и нелинейно-оптические методы и методики
могут быть использованы в практических задачах диагностики и терапии.
Предложенная волоконно-оптическая лазерная система на базе твердотельного YAG:Nd лазера может применяться в клинике для диагностики ряда онкологических заболеваний.
Применение лазерного возбуждения в "окне прозрачности" биотканей расширяет диагностические возможности до максимальных оптически достигаемых глубин, а предложенный многочастотный лазерный метод диагностики опухолей с разрешением по глубине может применяться для более информативного и достоверного клинического диагнозирования.
Данные полученные из исследования двухквантовых процессов в биотканях могут быть использованы для разработки новых методов диагностики и терапии опухолей.
Метод ГВГ может применяться для исследования конфор-мационных переходов спираль-клубок а также для экспресс анализа состояния биотканей содержащих макроструктуры молекул коллагена.
Защищаемые положения.
-
Реализован и экспериментально исследован пикосекундньш режим генерации лазера на красителе с распределенной обратной связью (РОС): на основе исследования спектральных и энергетических параметров излучения выявлены характерные особенности процесса. Предложены и апробированы новые схемы лазера на красителе с РОС, обеспечивающие непрерывную перестройку пикосекундного излучения в широкой спектральной области (А560-650нм), что превышает в три раза известный ранее результат.
-
Методом лазерно-возбуждаемой флуоресценции исследованы спектрально-флуоресцентные особенности биотканей. При облучении на длине волны 355 и 440нм, выявлено различие между спектрами флуоресценции нормальной и опухолевой тканей.
Экспериментально продемонстрирована применимость флуоресцентной диагностики случаев злокачественных опухолей человека с применением фотосенсибилизирующего препарата флюренат. На основе проведенных исследований создана волоконно-оптическая система для флуоресцентного анализа биотканей на базе многочастотного твердотельного YAG.Nd лазера.
-
На основе экспериментального и теоретического анализа выявлены условия процесса тушения автофлуоресценции в биотканях Показано наличие влияния процесса переноса энергии электронного возбуждения на явление спектрально-однородного снижения уровня автофлуоресценции в фотосенсибилизированных тканях. Выявлено наличие в биотканях центров одновременной локализации вводимых фотосенсибилизаторов и пиридиннуклео-тидов.
-
Получены и исследованы спектры флуоресценции фотосенсибилизаторов второго поколения при возбуждении на длине волны ббОнм. На примере хлорина е6 и Zn- тетрасульфофталоцианина показана и опробирована возможность диагностики тканей в области максимальных глубин проникновения оптического излучения. Предложен новый многочастотный лазерный метод оптической диагностики опухолей с разрешением по глубине. С использованием лазерного возбуждения на двух длинах волн (355 и ббОнм) осуществлена апробация метода на модели опухоли (фантом).
5. Экспериментально исследованы явления двухфотонной
флуоресценции и каскадной фотодиссоциации туморотропных
фотосенсибилизаторов: производной гематопорфирина (11111) и
хлорина е6 в оптически непрозрачных биотканях, в поле пико-
секундного лазерного излучения. Получена и исследована пико-
секундная генерация второй гармоники (ГВГ) Х=532нм в различных
мягких тканях животных. Выявлена корреляция эффективности
ГВГ с содержанием белка коллагена образующей в биоткани
молекулярные квазикристаллы. Показана возможность нелинейно-
оптического метода ГВГ для исследования фазовых (конфор-
мационных) переходов спираль-клубок молекул каллвгена в тканях.
Апробация
Результаты работы докладывались автором на международных конференциях по лазерной физике и и нелинейной оптике (Аштарак, Армения 1995, 1996 гг.), на симпозиуме черноморского региона по прикладному электромагнетизму (Мецово, Греция, 1996), на международном симпозиуме по биомедицинской оптике Photonix West / BiOS97 (Сан Хосе, США, 1997), на седьмом всемирном конгрессе по фотодинамической терапии (Нант, Франция, 1998), научных семинарах кафедр биофизики и квантовой электроники физического факультета ЕГУ. Разработанный в диссертации пикосекундный перестраиваемый лазер на красителе " ПикоРОС-2" на всесоюзной юбилейной выставке (Октябрь-70, ВДНХ, 1987) экспонировался в составе удостоенного золотой медали пикосекундного комплекса "ЛП-2" - " ПикоРОС-2".
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 25 работ, список которых приведен в конце автореферата.
Личный вклад соискателя в работах по теме диссертации состоит в создании лазерных источников и экспериментальных установок, в постановке и проведении экспериментальных исследований, обработке данных и интерпретации результатов.
Структура и объем работы.
Диссертационной работа состоит из трех глав, введения и заключения. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок, библиографию, включающую 135 наименований, и приложение ( всего 136 листа).
