Содержание к диссертации
Введение
1. Современные методы анализа жидких биологических сред 10
1.1. Краткая характеристика жидких биологических сред человека 11
1.2. Существующие методы клинико-биохимического анализа 14
1.3. Количественный абсорбционный спектральный анализ жидких биологических сред в УФ области 18
1.3.1. Электронные спектры поглощения органических молекул. Основные принципы лежащие в основе УФ спектрофотометрии 18
1.3.2. Примеры использования прямой УФ спектофотометрии для анализа поликомпонентных ЖБС 28
1.3.3. Спектрофотометры для клинико-биохимических исследований,.. 32
Ф 1.4. Методы контроля состава жидких биологических сред в процессе детоксикационных мероприятий 33
1.4.1. Перитонеальный диализ. Тест перитонеального равновесия 34
1.4.2. Исследование состава диализата хроматографическими и масс-спектрометрическими методами 36
1.4.3. Применение спектрального анализа для контроля состава диализата... 39
1.5. Постановка задач исследования 40
Выводы по главе 1: 41
2. Разработка метода спектрофотометрического анализа ЖБС 43
2.1. Основные требования, предъявляемые к математической модели поглощения ЖБС в УФ области спектра 43
2.2. Спектральный анализ однокомпонентных сред в ультрафиолетовой области 46
2.2.1. Математическая модель поглощения однокомпонентных сред 46
2.2.2. Методика проведения градуировки 49
2.2.3. Методика расчета концентрации по спектру 51
2.3. Спектральный анализ многокомпонентных сред в УФ области 52
Выводы по главе 2: 61
3. Применение метода для анализа однокомпонентних сред 63
3.1. Автоматизированный многоканальный спектроанализатор 63
3.2. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов глюкозы 69
3.3. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов сывороточного альбумина 73
3.4. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа цианкобаламина 78
3.5. Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов мочевой кислоты 83
3.6. Применение разработанной методики для количественного анализа препарата содержащего гидрохинон 88
Выводы по главе 3: 94
4. Количественный анализ перитонеального диализата методом УФ абсорбционной спектрометрии 96
4.1. Разработка методики регистрации спектров экстинкции перитонеального диализата 97
4.2. Исследование формы спектральной кривой 100
4.3. Обоснование принципиальной возможности применения количественного спектрального анализа в УФ области для исследования состава диализата 116
4.4. Учет влияния светорассеяния на спектр экстинкции диализата 121
4.5. Исследование динамики процесса выведения веществ различной молекулярной массы через перитонеальную мембрану 123
4 4.6. Определение концентрации мочевой кислоты и креатинина в перитонеальном диализате методом УФ спектрофотометрии 128
Выводы по главе 4: 134
Заключение 136
Библиографический список использованной литературы: 140
- Существующие методы клинико-биохимического анализа
- Спектральный анализ однокомпонентных сред в ультрафиолетовой области
- Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов глюкозы
- Обоснование принципиальной возможности применения количественного спектрального анализа в УФ области для исследования состава диализата
Введение к работе
Актуальность исследований. Метод абсорбционного спектрального анализа широко используется в науке и технике. Преимуществами данного метода являются оперативность, высокая воспроизводимость, малый объем пробы, неинвазивность, возможность реализации мониторинга состава среды в проточном режиме, сравнительно невысокая стоимость используемой аппаратуры, отсутствие необходимости в использовании реактивов, низкая трудоемкость и возможность автоматизации. Особое место спектральные методы анализа занимают в биомедицинских исследованиях, где в более чем 30% аналитических методик используется оптическая регистрация. Отметим лишь несколько основных направлений этих исследований - контроль экологического состояния среды обитания человека, клинико-лабораторные биохимические исследования нативных жидких биологических сред (ЖБС) организма, мониторинг процессов при проведении эфферентной терапии, фармакологические исследования, контроль качества пищевых продуктов.
Наиболее информативной для спектрального анализа ЖБС является ультрафиолетовая (УФ) область, где, с одной стороны, лежат электронные полосы поглощения многих хромофорных групп, а с другой, располагается «окно прозрачности» воды, которая является растворителем во всех жидких средах естественного происхождения. Современные УФ спектрофотометры построены на основе многоэлементных приемников излучения, полностью автоматизированы, передают спектры непосредственно на компьютер, что дает возможность проводить анализ в реальном масштабе времени.
Количественный абсорбционный анализ базируется на законе Бугера-Ламберта-Бера, устанавливающем линейную зависимость спектрального показателя поглощения однородной среды от концентрации, и принципе аддитивности, согласно которому показатель поглощения смеси равен сумме показателей поглощения отдельных компонентов. Многими исследователями показано, что закон Бера и принцип аддитивности соблюдаются лишь для слабоконцентрированных сред. Кроме того, обычно анализ проводится на одной или нескольких дискретных длинах волн, как правило, соответствующих максимумам характеристических полос поглощения компонентов среды, в то время как информация о составе ЖБС рассредоточена в широком спектральном интервале. Поэтому, применение классического абсорбционного спектрального анализа для исследования ЖБС и жидких лекарственных форм, когда концентрация может изменяться в широких пределах, в случае однокомпонентных сред приводит к значительным погрешностям, а для поликомпонентных сред практически исключено.
Цель настоящей работы - разработка и исследование методов спектрального анализа ЖБС и их компонентов в УФ области спектра, снимающих ряд ограничений классической абсорбционной спектрофотометрии применительно к поликомпонентным средам.
Основные задачи, которые необходимо решить для достижения указанной цели включают в себя следующее: построение математической модели, описывающей зависимость спектральных характеристик поглощения ЖБС в УФ области спектра от концентрации компонентов; разработка методики определения параметров модели для конкретной ЖБС и расчета концентрации компонентов по спектру; оценка эффективности модели применительно к анализу однокомпонентных биологических сред в широком диапазоне концентраций; экспериментальное исследование разработанных моделей для анализа поликомпонентных сред - перитонеального диализата больных, страдающих хронической почечной недостаточностью (ХПН), и поликомпонентных жидких лекарственных сред.
Методы исследований.
Для решения поставленных задач использовались методы абсорбционного спектрального анализа по электронным спектрам поглощения, аналити ческие методы аппроксимации функций многих переменных, методы оптимизации, статистические методы оценки степени достоверности результатов.
Научная новизна работы состоит в следующем:
Сформулирована математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области при изменении концентрации в широких пределах.
Разработана новая методика анализа однокомпонентных сред с учетом нелинейной зависимости показателя поглощения от концентрации в пределах информативной области спектра.
Разработан метод спектрофотометрического определения концентрации доминирующего компонента в поликомпонентных средах.
Впервые обнаружены индивидуальные особенности УФ спектров экс-тинкции перитонеального диализата больных страдающих ХПН, и предложена методика классификации спектров диализата по форме кривой пропускания.
Практическая значимость работы заключается в следующем:
Разработанная методика может быть использована в клинико-биохимических лабораториях учреждений практического здравоохранения при анализе жидких поликомпонентных сред, а также для оперативного контроля эффективности детоксикационных мероприятий.
Результаты работы подтверждены актами внедрения Городского центра гемокоррекции г. Санкт-Петербурга и научно-исследовательской лаборатории фармакологических исследований СПб химико-фармацевтической академии.
Научные положения выносимые на защиту: - Математическая модель, описывающая спектральные характеристики
поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области, должна учитывать
возможное несоблюдение закона Бера и принципа аддитивности путем
введения в разложение показателя поглощения по концентрации членов высших порядков.
- Количественный спектрофотометрический анализ ЖБС в УФ области спектра должен проводится в пределах всего информативного для исследуемой среды спектрального диапазона.
- Методика спектрального анализа, основанная на предлагаемых принципах, позволяет существенно повысить точность анализа однокомпо-нентных сред в широком диапазоне изменения концентрации, а также дает возможность проводить анализ сложных поликомпонентных сред по доминирующему компоненту.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:
- Вторая международная конференция молодых ученых и специалистов "Оптика-2001", Санкт-Петербург, 2001.
- Международный оптический конгресс «Оптика-XXI век», Санкт-Петербург, 2002.
- VIII Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2002», Санкт-Петербург, 2002.
- IX Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2004», Санкт-Петербург, 2004.
- VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, 2004.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них - 2 статьи, тезисы к 7-ми докладам на международных и национальных научно-технических конференциях.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 73 наименования и одного приложения. Основная часть работы изложена на 109 страницах машинописного текста. Работа содержит 68 рисунков и 21 таблицу.
Существующие методы клинико-биохимического анализа
В настоящее время число компонентов ЖБС, определяемых в ходе рутинных биохимических исследований, составляет несколько сотен. Наиболее часто анализу подвергается кровь и моча пациентов, исследования состава других жидких биологических сред проводится значительно реже вследствие трудности получения проб, например, взятие цереброспинальной жидкости или суставного выпота требует проведения у больного опасной и болезненной пункции, или из-за отсутствия надежных методов интерпретации результатов, как при исследовании слюны [26,36,22].
Все многообразие современных методов клинико-биохимического анализа можно разделить на следующие группы [26]: 1) Хроматографические; 2) Радионуклеидные; 3) Электрофоретические; 4) Оптические. Хроматографию относят к наиболее универсальным и чувствительным методам исследования ЖБС, так как она позволяет получить наиболее полную информацию о составе анализируемой среды. В силу высокой стоимости и трудоемкости, хроматографические методы используются главным образом в научных исследованиях, и лишь в исключительных случаях находят применение в клинической практике. Кроме того, будучи незаменимым методом качественного анализа, хроматография имеет весьма ограниченные возможности для количественного определения веществ.
Радионуклеидные методы широко применяются при функциональной диагностике, выявлении злокачественных новообразований. Электрофорез главным образом используется для разделения белковых фракций при построении протеинограмм.
Большая часть современных методов, включая хроматографические и электрофоретические, на том или ином этапе использует оптическую регистрацию. Оптические методы обладают высокой точностью и позволяют автоматизировать процесс анализа, что широко используется при создании автоматической и полуавтоматической аналитической аппаратуры. По данным справочника [26] оптические методы количественного анализа, применяемые в клинической биохимии, можно разделить на следующие группы: 1) рефрактометрические; 2) поляриметрические; 3) фотометрические: а) абсорбционные: - спектрофотометрия, - нефелометрия, - атомно-абсорбционная фотометрия; б) эмиссионные: - флюориметрия, - пламенная фотометрия, - атомно-эмиссионный спектральный анализ. Рефрактометрия базируется на измерении показателя преломления света при прохождении его через оптически неоднородные среды. Ранее метод рефрактометрии применялся в основном для определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Поскольку преломляющая способность сыворотки зависит от уровня не только белков, но и небелковых компонентов, рефрактометрический анализ давал ложнозавышенные результаты.
В основе поляриметрии лежит свойство прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света. Метод поляриметрии широко используется для быстрого, без применения реактивов определения глюкозы в моче.
Более 80% используемых в клинико-диагностических лабораториях методов биохимических исследований базируется на спектрофотометрии. При этом спектрофотометрические методы могут использоваться как самостоятельный вид анализа, так и в качестве дополнения к другим методам, например при расшифровке хроматограмм или для анализа белковых фракций разделенных электрофорезом. Ближняя ультрафиолетовая (200...400 нм) и видимая (400...700 нм) спектральные области являются основным «окном прозрачности» для воды [29], что обуславливает их выбор при проведении спектрального анализа ЖБС. Несмотря на то, что инфракрасная спектроскопия предоставляет значительно более широкие возможности по идентификации и количественному определению веществ в многокомпонентных средах, перспективы ее применения для исследования биологических жидкостей в значительной степени ограничены из-за сильного поглощения ИК излучения водой.
Наибольшее распространение в клинико-биохимических исследованиях, благодаря своей универсальности, простоте в применении и невысоким требованиям к используемой аппаратуре, получили непрямые спектрофото-метрические методы, которые также часто называют колориметрическими. Анализ по таким методам требует добавления в исследуемую среду специфического для определяемого компонента реагента, который вступает с ним в химическую реакцию с образованием соединения сильно поглощающего свет в области прозрачности анализируемой среды. Если исследуемая среда прозрачна в видимой области, зрительно это наблюдается как окрашивание, и соответствующая реакция называется цветной. Концентрация анализируемого компонента затем вычисляется по величине экстинкции, измеренной на длине волны максимума полосы поглощения продукта цветной реакции. Часто колориметрические методы реализуются способами «сухой химии», с использованием различных аналитических полосок, что еще больше упрощает процедуру анализа. Достоинством непрямых спектрофотометрических методов является возможность определять концентрацию веществ, которые не поглощают или слабо поглощают в УФ и видимой области, а также минимизация влияния мешающих компонентов за счет использования области прозрачности среды. К недостаткам таких методов следует отнести необходимость применения реактивов, инвазивность и ограниченные возможности одновременного анализа по нескольким компонентам.
Прямые методы базируются на непосредственном определении содержания анализируемого вещества в пробе по результатам измерения экстинкции среды на одной или нескольких длинах волн без использования каких-либо дополнительных реагентов в соответствии с основными принципами абсорбционного спектрального анализа. Прямая УФ спектрофотометрия является неинвазивным методом, что дает принципиальную возможность одновременно определять концентрацию сразу нескольких компонентов при малом объеме пробы и позволяет проводить анализ в режиме on-line с использованием проточной кюветы. Метод широко применяется для количественного и качественного анализа однокомпонентных сред: жидких лекарствен 18 ных форм, пищевых добавок, калибровочных растворов, при расшифровке хроматограмм, электрофоретическом разделении белков и т.д. При условии повышения точности и воспроизводимости, прямой спектрофотометрический анализ может успешно конкурировать со значительно более сложными и дорогостоящими методами. Рассмотрим этот вопрос более подробно.
Спектральный анализ однокомпонентных сред в ультрафиолетовой области
В основе классического абсорбционного спектрального анализа лежит закон Бугера-Ламберта-Бера, предполагающий существование линейной зависимости между спектральным показателем поглощения исследуемой среды и концентрацией: 1Я = / exp{k,d) + Sx = /0 exp{exCd)+ 3Л9 (2-2) где /д - интенсивность падающего света; /д - интенсивность света прошедшего через слой среды; кЛ- спектральный показатель поглощения среды; д- молярный (удельный) спектральный показатель поглощения; С- концентрация; d- толщина слоя среды (оптическая толщина кюветы); 8Х- случайная ошибка измерения. Как следует из (2.2), в случае соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера концентрация легко может быть рассчитана по результатам измерений показателя поглощения исследуемой среды на одной аналитической длине волны Лтт, в качестве которой обычно выбирают длину волны максимума одной из характеристических полос поглощения: Выражение (2.3) справедливо лишь в области малых концентраций, когда межмолекулярные взаимодействия не оказывают заметного влияния на процесс поглощения оптического излучения средой. В том случае, если концентрация исследуемой среды изменяется в небольших пределах [С0 - АС, С0 + АС] И АС/С0 «1, можно продолжать использовать для практических расчетов соотношение (2.3) и в области больших концентраций определив молярный показатель поглощения как єя = кл/С0. Иными словами, небольшой участок нелинейной кривой кл(С) можно аппроксимировать отрезком прямой линии. Если же измеряемые значения концентрации для исследуемой среды лежат в широком диапазоне [0,Стах], соотношение (2.3) дает неточные результаты, так как молярный показатель поглощения, формально вычисленный как єя =кл/С, будет зависеть от концентрации.
В настоящее время отсутствуют развитые теоретические методы, позволяющие количественно оценить влияние межмолекулярных взаимодействий на показатель поглощения жидких сред, и наиболее эффективным подходом представляется использование феноменологических моделей. Процедуру построение таких моделей можно разделить на три основных этапа: - априорное задание вида функции, аппроксимирующей экспериментально наблюдаемую зависимость кя(С); - анализ предложенной аппроксимирующей функции; - экспериментальное определение параметров модели (численных коэффициентов аппроксимирующей функции) индивидуально для каждой среды - проведение градуировки.
При малых концентрациях члены высших порядков (начиная с квадратичного и старше) пренебрежимо малы, зависимость кЛ(С) можно считать линейной, и выражение (2.6) обращается в классический закон Бугера-Ламберта-Бера. С ростом концентрации вклад членов высших порядков ста 49 новится ощутимым и их необходимо учитывать при расчетах. Будем называть коэффициент разложения 2-го порядка молярным показателем поглощения 2-го порядка ef\ коэффициент разложения 3-го порядка молярным показателем поглощения 3-го порядка є ] и т.д.
На практике не всегда возможно непосредственно проверить выполнение условия (2.7). В этом случае число членов ряда, которое необходимо удерживать в разложении, можно определить эмпирически, постепенно увеличивая Мдо тех пор, пока погрешность не перестанет уменьшаться. Далее будет показано, что для исследуемых в работе сред достаточно двух первых членов ряда, линейного и квадратичного по концентрации.
Молярные показатели спектрального поглощения єя,є \...є[М) не могут быть рассчитаны теоретически, поэтому параметры модели применительно к конкретной среде должны быть определены экспериментально в ходе градуировки. Для этого необходимо приготовить набор из L проб исследуемой среды с известной концентрацией, измерить их спектры и определить границы информативной спектральной области.
Современные спектрофотометры на основе многоэлементных приемников излучения позволяют параллельно регистрировать спектр во всем рабочем диапазоне длин волн за время, не превышающее нескольких секунд, и передавать данные непосредственно на компьютер. Это дает возможность использовать для определения концентрации не одну дискретную длину волны, как принято в классическом спектрофотометрическом анализе, а весь информативный для исследуемой среды спектральный диапазон. Работа в широком интервале длин волн дает целый ряд преимуществ по отношению к традиционному подходу, основанному на использовании одной дискретной длины волны. Во-первых, такой подход позволяет уменьшить влияние на результат анализа случайной ошибки определения показателя поглощения. Во-вторых, появляется возможность выявлять и исключать из интервала длин волн, используемого для анализа, те участки спектра, где уровень сигнала выходит за пределы динамического диапазона используемого спектрофотометра. В частности, не всегда целесообразно проводить анализ в центре полосы поглощения, где влияние шумов фотоприемника максимально. В-третьих, уменьшается погрешность определения концентрации, связанная с влиянием мешающих примесей. Обычно, если спектральные характеристики поглощения примеси заранее известны, ее влияния на результаты анализа можно избежать путем выбора для анализа длин волн вдали от соответствующей мешающей полосы поглощения. В противном случае, единственным способом уменьшить связанную с примесью погрешность является проведение анализа в широком спектральном диапазоне.
Применение разработанной методики для количественного спектрального анализа растворов глюкозы
Глюкоза входит в состав большинства жидких биологических сред организма человека, а также широко используется как лекарственный препарат. В ходе исследований были сняты спектры набора растворов глюкозы концентрацией 5; 10; 20; 40 г/л; использовалась кварцевая кювета оптической толщиной d = 5 мм. Раствор были приготовлены из раствора глюкозы для инъекций исходной концентрации 40 г/л путем разведения дистиллированной водой. Для каждой пробы регистрация спектра проводилась неоднократно, при обработке данные усреднялись. Из рис. 3.7 очевидно, что экспериментально наблюдаемая зависимость кл(С) для раствора глюкозы не подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера при концентрациях выше 5 г/л. В связи с этим, в соответствии с выражением (2.8) на каждой длине волны информативной спектральной области были рассчитаны векторы удельных спектральных показателей поглощения для случая М = 2 (квадратичный полином) и М - 3 (кубический полином), а также удельный показатель поглощения закона Бугера-Ламберта-Бера при концентрации С0 = 5 г/л. Полученные аппроксимирующие зависимости кх(С) на длине волны 282.5 нм представлены в таблице 3.2. и на рис. 3.7. На рис. 3.8 и рис. 3.9 приведены спектральные зависимости удельного показателя поглощения первого и второго порядка. По полученным данным был восстановлен спектр поглощения глюкозы при концентрации 20 г/л в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, а также квадратичной и кубической аппроксимирующей зависимостями (рис. 3.10). Длина волны,нм
Спектральная зависимость удельного показателя поглощения второго порядка для глюкозы. спектр восстановленный по закону Бера (М=1) спектр восстановленный по предложенной методике (М=2) спектр восстановленный по предложенной методике (М=3) реальный спектр. В таблице 3.3 приведены результаты спектрофотометрического определения концентрации глюкозы с использованием классического подхода, основанного на законе Бугера-Ламберта-Бера (удельный показатель поглощения найден при концентрации С0 = 5 г/л), и по предложенному методу для случаев М = 2 и М = 3. Таблица 3.3
Из таблицы видно, что при использовании закона Бугера-Ламберта-Бера в широком диапазоне концентраций относительная погрешность SC/C достигает 50%. Учет нелинейности путем введения дополнительного квадратичного члена разложения по концентрации позволяет существенно снизить погрешность до величины порядка 3-5 % во всем рабочем диапазоне концентраций. Введение кубического члена представляется излишним, так как не приводит к дальнейшему повышению точности анализа.
В ходе исследований были получены спектры поглощения человеческого сывороточного альбумина концентрацией 1; 2; 3; 4 и 5 г/л (рис. 3.11 и таблица 3.4). Рабочие растворы были приготовлены из донорского альбумина для инфузии концентрацией 100 г/л путем разбавления дистиллированной водой; для регистрации спектров использовалась кварцевая кювета оптической толщиной 5 мм. Для уменьшения погрешности процедура разведения и регистрации спектров повторялась неоднократно для каждого значения концентрации, затем полученные спектры усреднялись.
Измеренные спектры несколько отличаются от приведенных в справочной литературе спектров поглощения альбумина, так как исходный препарат не подвергался глубокой очистке и неизбежно содержит остаточные количества различных компонентов плазмы крови. Наиболее заметное влияние на спектральные характеристики белков оказывают примеси нуклеиновых кислот, имеющих очень интенсивную полосу поглощения вблизи 260 нм. Нуклеиновые кислоты также меняют показатель поглощения белковых растворов на традиционно используемой при спектрофотометрическом определении белков длине волны 280 нм, поэтому в таких случаях рекомендуется применять специальные эмпирические формулы. Чаще всего в справочной литературе приводятся формулы Варбурга-Кристиана и Каркара [21, 22]. Данные формулы имеют один существенный недостаток: они составлены в расчете на некий «усредненный» белок, в то время как удельные экстинкции различных белков могут отличаться в несколько раз.
Наиболее точные результаты могут быть получены, если предварительно провести градуировку по набору растворов известной концентрации для конкретного анализируемого белка. Как видно из рис. 3.12 и таблицы 3.4, где представлена зависимость спектрального показателя поглощения альбумина от концентрации на длинах волн 253 нм и 278 нм (характеристические максимум и минимум поглощения), в исследуемом диапазоне концентраций 1...5 г/л достаточно хорошо соблюдается закон Бугера-Ламберта-Бера, и во введении нелинейных поправок нет необходимости. В то же самое время, отношение экстинкции на двух длинах волн А2П/А252 и A2S0/ A260 не остается постоянным, что говорит о нестабильности формы спектра. Это может быть связано с изменением рН, температуры раствора, возникновением структурных неоднородностей и множеством других факторов. В соответствии с предложенным алгоритмом во всем рабочем спектральном диапазоне по методу наименьших квадратов был рассчитан удельный показатель поглощения альбумина .
Обоснование принципиальной возможности применения количественного спектрального анализа в УФ области для исследования состава диализата
Необходимым условием, при котором возможен количественный анализ по спектрам поглощения, является наличие корреляционных связей между концентрацией определяемых компонентов и экстинкциеи исследуемой среды в рабочей спектральной области. Для выявления таких корреляционных связей применительно к перитонеальному диализату, для группы больных во время проведения теста перитонеального равновесия были взяты пробы выводимого диализата. Затем параллельно были сняты спектры и проведен биохимический анализ, в ходе которого в частности определялась концентрация креатинина и мочевой кислоты. Тесная корреляция между уровнем поглощения и концентрацией креа-тинина и мочевой кислоты свидетельствует о том, что количественная оценка содержания данных компонентов в диализате по спектрам экстинкции принципиально возможна. Между тем, наличие такой корреляции не является достаточным условием, при котором изменение концентрации какого-либо компонента на самом деле вызывает изменение спектра экстинкции среды. Как было показано выше, при увеличении длительности перитонеального обмена растет общий уровень поглощения, а форма спектра практически не изменяется. При этом возможно наличие корреляционной связи уровня поглощения и концентрации даже тех компонентов, которые в действительности не оказывают влияния на спектр диализата. Следовательно, необходимо показать, что поглощение света определяемым компонентом заметно на фоне поглощения другими компонентами среды.
На рис 4.17 приведен спектр экстинкции перитонеального диализата одного из больных и спектры поглощения растворов чистого креатинина и мочевой кислоты в концентрациях, найденных в ходе биохимического анализа (в приближении соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера); на рис 4.18 показана процентная доля мочевой кислоты и креатинина в общей экстинкции среды. Из рис. 4.17 следует, что в длинноволновой части спектра 285...305 нм вклад мочевой кислоты составляет 80...95 %, и мочевая кислота может быть определена по предложенному методу как основной компонент. В области 250...270 нм на графиках хорошо заметен провал, связанный с присутствием в диализате достоверно неидентифицированного вещества, имеющего максимум поглощения вблизи длины волны 260 нм (предположительно аденозина), содержание которого определяет форму кривой пропускания. В коротковолновой части спектра 230...240 нм наиболее сильно проявляется поглощение креатинина, его вклад в общую экстинкцию диализата в указанном диапазоне длин волн достигает 50 %, поэтому количественное определение креатинина по предложенному методу как основного компонента также возможно, но с меньшей степенью достоверности.
Таким образом, исследования показали: 1) Имеет место тесная корреляционная связь между уровнем поглощения диализата в спектральной области 230...310 нм и концентрацией его компонентов: креатинина и мочевой кислоты; 2) Доминирующий вклад в экстинкцию среды вносят три вещества: мочевая кислота, креатинин и неидентифицированный биохимическими методами компонент с максимумом поглощения вблизи 260 нм (предположительно аденозин). Следовательно, имеется принципиальная возможность проведения количественного спектрального анализа диализата по мочевой кислоте и креа-тинину, при этом обязательно требуется учет влияния неидентифицирован-ного компонента.
В процессе спектральных измерений регистрируется спектр экстинкции, который формируется как за счет поглощения, так и за счет рассеяния в исследуемой среде. При проведении ПД со стенок брюшной полости отделяются и переходят в диализат клетки эпителия, на которых имеет место светорассеяние. Уровень рассеянной компоненты зависит от цитоза диализата (количество клеток в единице объема) и может быть существенным. При проведении количественного анализа необходимо предварительно вычленить из спектра экстинкции составляющую, связанную с рассеянием, учитывая, что рассеяние неселективно по длине волны. Для этого на регистрируемых спектрограммах был выделен интервал длин волн 330...360 нм, где поглощение пренебрежимо мало, и экстинкция среды практически полностью обусловлена рассеянием (рис. 4.19).
В более коротковолновой области лежит крыло полосы поглощения мочевой кислоты, а в более длинноволновой на спектрограммах проявляется второй порядок дифракции. В рамках информативного для количественного анализа перитонеального диализата спектрального интервала 220...350 нм зависимость показателя рассеяния диализата от длины волны в первом приближении можно считать линейной. Исходя из этого, спектр рассеяния может быть восстановлен путем линейной экстраполяции участка спектра экстинкции в области 330...360 нм по методу наименьших квадратов; для выделения кривой поглощения полученную линию необходимо вычесть из спектра экстинкции (рис. 4.19).
Из выражения (4.4) следует, что во время нахождения диализата в брюшной полости концентрация выводимых метаболитов в нем экспоненциально растет, приближаясь к концентрации в плазме. Величина постоянной времени г, которая характеризует скорость процесса выведения, зависит от молекулярной массы выводимого вещества и транспортных характеристик брюшины больного. Зависимость (4.4) лежит в основе классического теста перитоне-ального равновесия, в ходе которого больному проводится обмен длительностью четыре часа, после чего измеряется концентрация мочевины, креатинина и глюкозы в выводимом диализате и плазме крови. При этом г может
Большие значения т соответствуют низкому перитонеальному транспорту, характерному для больных с низкой проницаемостью брюшины. И наоборот, маленькие т говорят о высоком перитонеальном транспорте, что обычно наблюдается у больных с высокопроницаемой брюшиной.
Скорость выведения находится в обратной зависимости от молекулярной массы вещества: чем меньше масса, тем быстрее происходит диффузия. Воспользуемся данной закономерностью для оценки молекулярной массы второго компонента, концентрация которого определяет форму кривой поглощения. Для определения молекулярной массы необходимо найти т для нескольких веществ с известной молекулярной массой, определить вид зависимости М(т) и соответствующим образом аппроксимировать её, а затем вычислить искомую молекулярную массу по известной величине х, используя полученную аппроксимацию.
Была отобрана группа больных (7 чел), которым проводился плановый тест перитонеального равновесия. По результатам биохимического анализа для каждого больного из группы были построены графики зависимости концентрации мочевины, креатинина и мочевой кислоты в диализате от длительности обмена (рис. 4.20-4.22). Графики были аппроксимированы экспоненциальной функцией (4.4), откуда были определены величины постоянной т для каждого из перечисленных веществ. Аналогичная процедура была проведена для аденозина, с тем отличием, что концентрация определялась не из результатов биохимического анализа, а спектрофотометрически по уровню поглощения диализата в спектральной области 255-265 нм (рис. 4.23).
