Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. Принципы проточно — оптического метода анализа биоаэрозолей 14
1.1 Структура системы биомониторинга 14
1.2 Физические принципы проточно-оптического метода
1.2.1 Характеристики флуоресценции биологических компонент частиц биоаэрозоля 21
1.2.2 Характеристики упругого рассеяния частиц биоаэрозоля 25
1.2.3 Анализ данных, полученных устройством на основе ПОМ. Необходимость поиска новых информативных признаков частиц
1.3 Обзор современных систем на основе ПОМ 31
1.4 Анализ индикатрисы флуоресценции в качестве нового информативного признака биоаэрозолей 36
1.7 Постановка цели и задач диссертационной работы 38
Глава 2. Исследование зависимости характеристик индикатрисы флуоресценции частицы аэрозоля от ее оптических свойств на основе численного моделирования 40
2.1. Постановка задачи анализа индикатрисы флуоресценции 40
2.2 Метод численного моделирования углового распределения флуоресценции частицы аэрозоля 41
2.3 Результаты численного моделирования углового распределения флуоресценции частицы аэрозоля 46
2.4 Выводы по главе 2 60
Глава 3. Разработка оптической системы регистрации устройства ПОМ, обеспечивающей измерение характеристик индикатрисы флуоресценции и параметров индикатрисы рассеяния частицы аэрозоля 62
3.1 Точность измерения сигналов в ПОМ. Выбор источника оптического излучения...62
3.2 Требования, предъявляемые к оптической системе регистрации 68
3.3 Блок-схема оптической системы. Определение геометрии объектива регистрации -эллиптического зеркала 71
3.4 Оптические системы регистрации сигналов упругого рассеяния и флуоресценции. 76
3.5 Описание сигнализатора ПБА, в основу конструкции которого положены разработанные оптические схемы з
3.6 Схема измерения характеристик флуоресценции и рассеяния на основе ПОМ 96
3.7 Выводы по главе 3 98
Глава 4. Экспериментальная оценка информативности новых признаков аэрозольных частиц 100
4.1 Результаты экспериментальных исследований информативных признаков ПОМ 101
4.1.1. Измерение интегральных (угол светосбора П=3к стер или 0= 2я стер) сигналов флуоресценции в нескольких широких спектральных диапазонах и сигнала упругого рассеяния частиц при освещении частиц излучением на длинах волн Яв03.=266 нм иЛвоз.=365 нм 101
4.1.2 Измерение характеристик индикатрисы флуоресценции аэрозольных частиц 105
4.1.3 Измерение характеристик индикатрисы рассеяния аэрозольных частиц 111
4.2. Анализ полученных результатов. Оценка избирательности информативных признаков ПОМ 114
4.2.1 Оценка избирательности ПОМ при измерении интегральных сигналов флуоресценции и сигнала упругого рассеяния при возбуждении частиц излучением на длинах волн Яв03 =266 нм и AD03.=365 нм 117
4.2.2 Оценка избирательности ПОМ при измерении характеристик индикатрисы флуоресценции аэрозольных частиц 122
4.2.2 Оценка избирательности ПОМ при измерении характеристик индикатрисы рассеяния аэрозольных частиц 128
4.3 Выводы по главе 4 130
Заключение 132
Основные результаты диссертационной работы 134
Список сокращений 136
Список литературы
- Физические принципы проточно-оптического метода
- Результаты численного моделирования углового распределения флуоресценции частицы аэрозоля
- Блок-схема оптической системы. Определение геометрии объектива регистрации -эллиптического зеркала
- Анализ полученных результатов. Оценка избирательности информативных признаков ПОМ
Введение к работе
Актуальность работы. Анализ аэрозолей в приземном слое воздуха относится к числу актуальных проблем экологического мониторинга, поскольку носителями аэрозоля могут выступать патогенные биоаэрозоли (ПБА), способные вызывать аллергические реакции и заболевания человека. Одной из важных задач, стоящей перед биомониторингом приземного слоя воздуха атмосферы, является обнаружение патогенных ПБА и установление их видовой принадлежности. Эффективность средств экстренной профилактики поражений ПБА зависит как от достоверности определения типа биоаэрозолей, так и от времени, которое прошло с момента заражения. К сигнализаторам аэрозолей, обеспечивающим первичное обнаружение ПБА, предъявляются следующие основные требования:
обнаружение ПБА за минимально возможное время;
обеспечение минимально возможного количества ложных срабатываний.
В настоящее время задача высокоскоростного экспресс-анализа респирабельной (вдыхаемой) фракции аэрозоля 1-10 мкм успешно решается проточно-оптическим методом (ПОМ). При анализе ПОМ отдельные частицы аэрозоля в потоке подвергаются воздействию внешнего возбуждающего излучения, диапазон длин волн которого соответствует возбуждению типичных для биологических веществ флуорофоров. Измерение сигналов флуоресценции и упругого рассеяния позволяет выделять потенциально опасные биологические частицы на фоне остальных частиц. При этом наибольшая информативность обеспечивается измерением характеристик спектров флуоресценции триптофана и других ароматических аминокислот в спектральном интервале АХфя -310 -г- 380 нм при возбуждении излучением с длинами волн Д?1ВОз(1)=250 + 290 нм.
Однако исследование аэрозолей только на основе регистрации излучения флуоресценции, возбуждаемой в диапазоне длин волн Л?івоз , сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, флуоресценция триптофана при Л?івоз свойственна всем биологическим частицам, что затрудняет регистрацию ПБА в присутствии естественного биологического аэрозольного фона атмосферы и приводит к росту вероятности ложных срабатываний сигнализатора ПОМ. Во-вторых, из-за частичного перекрытия спектров флуоресценции триптофана биологических частиц проявляется ограничение на проведение условно-групповой дифференциации патогенных биоаэрозолей с точки зрения количества выделяемых условных таксономических групп, информация о которых важна для оперативной профилактики ПБА. Указанные трудности требуют использования при измерениях на основе ПОМ дополнительных информативных признаков, повышающих избирательность метода и улучшающих классификацию биоаэрозолей.
В настоящее время для повышения избирательности в устройствах ПОМ используется регистрация спектров флуоресценции флуорофоров, отличных от триптофана, возбуждаемых излучением АХВ03 >Л?івоз Однако данное решение, с одной стороны, не всегда обеспечивает повышение избирательности в присутствии фоновых аэрозольных частиц, а с другой стороны -приводит к существенному усложнению устройств ПОМ. Следовательно, является актуальной задача поиска новых информативных признаков, повышающих избирательность метода.
В качестве новых маркеров, расширяющих границы ПОМ как метода анализа ПБА, потенциально могут выступать сигналы углового распределения флуоресценции и углового распределения упругого рассеяния аэрозольных частиц.
Целью диссертационной работы является повышение избирательности проточно-оптического метода за счет включения в состав анализатора дополнительных информационных каналов для измерения характеристик индикатрисы флуоресценции и индикатрисы рассеяния отдельных частиц биоаэрозоля.
Задачи исследования. Достижение поставленной цели требует решения следующих научно-технических задач:
-
Разработка метода моделирования индикатрисы флуоресценции биоаэрозолей и анализ на его основе зависимости пространственного распределения флуоресценции от характеристик частиц биоаэрозоля.
-
Разработка оптической системы регистрации для аппаратуры ПОМ, обеспечивающей возможность регистрации параметров индикатрисы флуоресценции и индикатрисы рассеяния частиц аэрозоля.
-
Проведение экспериментальных исследований зависимости параметров индикатрисы флуоресценции и индикатрисы рассеяния частиц биоаэрозоля от их характеристик с помощью разработанной аппаратуры ПОМ.
Научная новизна:
1. Разработан метод численного моделирования углового распределения флуоресценции
аэрозольных частиц, позволяющий:
вычислять угловое распределение флуоресценции с учетом совместного влияния эффекта преломления излучения на поверхности частицы и эффектов поглощения;
отдельно анализировать вклады эффектов поглощения и преломления излучения в асимметрию индикатрисы флуоресценции частицы.
На основе разработанного метода выполнено численное моделирование угловой зависимости флуоресценции для частиц аэрозоля сферической и эллиптической формы, оптические характеристики которых соответствуют экспериментальным данным, для бактерий Erwinia herbicola и спор Bacillus subtilis, полученными исследователями Tuminello P.S., Arakawa Е.Тидр. (лаборатории Health Sciences Research Division, Oak Ridge National Laboratory, США).
2. Теоретически показано, что индикатриса флуоресценции частиц аэрозоля анизотропна и
определяется совместным действием геометрического эффекта преломления излучения
поверхностью частицы и эффектов поглощения излучения на длинах волн возбуждения и
флуоресценции. Разработана методика определения оптических параметров частиц биоаэрозоля
DB, /)ф, кв, кф (значения оптической плотности (D) и показателя поглощения (к) на длинах волн
возбуждения и флуоресценции) на основе измерения характеристик индикатрисы
флуоресценции а и (3 (а=Ен обратное/н прямое и $=Ен обратное/н боковое, где Ен обратное,
Ен прямое и Ен боковое - доли энергии флуоресценции, излучаемые частицей аэрозоля в
обратном, прямом и боковом направлениях регистрации).
3. Разработаны оптические системы регистрации аэрозольных частиц, обеспечивающие:
1) возможность измерения характеристик пространственного распределения световой энергии
флуоресценции и рассеяния; 2) возможность измерения интегральных (угол светосбора Q = Зж стер или Q = 2ж стер) сигналов флуоресценции или упругого рассеяния в нескольких широких спектральных диапазонах; 3) высокую точность измерений сигналов флуоресценции и упругого рассеяния.
4. Экспериментально показано, что:
индикатриса флуоресценции биоаэрозолей анизотропна и определяется эффектами поглощения и преломления частиц;
измерение характеристик индикатрисы флуоресценции а, /? позволяет оценивать поглощающие свойства аэрозолей. Показано, что для оптически плотных на длинах волн флуоресценции веществ (споры Bacillus subtilis) наблюдается существенное изменение характеристик индикатрисы при переходе от одного спектрального диапазона измерений к другому, тогда как индикатриса слабо поглощающих флуоресценцию веществ (белок Ovalbumin) мало зависит от выбора спектрального диапазона регистрации;
измерение характеристик индикатрисы флуоресценции и характеристик индикатрисы упругого рассеяния, которые являются новыми информативными признаками биоаэрозолей в ПОМ, обеспечивает получение дополнительной информации о свойствах частиц биоаэрозоля и, тем самым, повышают информативность и избирательность ПОМ.
Основные результаты и положения, выносимые на защиту:
1. Метод численного моделирования углового распределения флуоресценции аэрозольных частиц.
-
Результаты численного моделирования зависимости характеристик индикатрисы флуоресценции а и (3 от значений оптической плотности вещества DB, D на длинах волн возбуждения и флуоресценции. Методика определения оптических параметров DB, )ф, кв, кф (значения оптической плотности (D) и показателя поглощения (к) на длинах волн возбуждения и флуоресценции) на основе измерения характеристик а и (3.
-
Оптические системы возбуждения и регистрации оптических сигналов для аппаратуры ПОМ.
-
Результаты экспериментальных исследований, показавшие, что:
на основе измерений параметров индикатрисы флуоресценции возможна оценка поглощающих свойств аэрозолей;
измерение характеристик индикатрисы флуоресценции и характеристик индикатрисы рассеяния повышает избирательность ПОМ.
Методы исследования, используемые в работе: математическое моделирование, метод компьютерного моделирования на основе программы Zemax-EE, экспериментальные исследования, статистические методы, компьютерная обработка результатов измерений.
Теоретическая и практическая значимость. Разработан метод численного моделирования углового распределения флуоресценции аэрозольных частиц. Получены результаты численного моделирования зависимости характеристик индикатрисы флуоресценции а и (3 от значений оптической плотности вещества DB, D на длинах волн возбуждения и флуоресценции. Разработана методика определения оптических параметров DB, /)ф, кв, кф (значения оптической плотности (D) и показателя поглощения (к) на длинах волн возбуждения и флуоресценции) на основе измерения характеристик а и (3. Разработана аппаратура ПОМ, позволяющая исследовать аэрозоли на основе измерения параметров индикатрис флуоресценции и рассеяния, а также на основе измерения сигналов флуоресценции, регистрируемых в широких телесных углах и сигналов упругого рассеяния. Исследована избирательность новых информативных признаков ПОМ. Показано, что новые информативные признаки биоаэрозолей повышают информативность ПОМ. Реализация результатов работы позволяет:
вычислять угловое распределение флуоресценции частиц аэрозоля на основе известных оптических характеристик частиц;
проводить исследование оптических характеристик частиц аэрозоля DB, )ф, кв, кф на основе измерения параметров индикатрисы флуоресценции частиц аэрозоля методом ПОМ;
проводить неспецифический экологический мониторинг с целью первичного выявления и дифференциации ПБА. При этом измеряемые характеристики индикатрисы флуоресценции или индикатрисы рассеяния могут использоваться в качестве независимых параметров при классификации частиц, либо как дополнение к существующим признакам с целью повышения избирательности ПОМ.
В частности, измерение характеристик индикатрисы флуоресценции оказывается полезным при разделении биоаэрозолей, отличающихся показателями поглощения кв, кф, таких как вегетативная и споровая форма патогенных клеток, которые плохо различимы спектральными методами ПОМ. Измерение характеристик индикатрисы рассеяния оказываются полезными при классификации биоаэрозолей, близких по спектральным свойствам спектров флуоресценции, но отличающихся агрегатным состоянием.
Апробация результатов исследований. Материалы исследований по теме диссертации изложены в статьях в изданиях, включенных в Перечень ВАК, докладывались и обсуждались на 4й Всероссийской с международным участием научной конференции «Метромед 2011», Всероссийской научно-технической конференции «Медицинские информационные системы» («МИС-2012) г. Таганрог, научно-технических конференциях в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 публикаций, в том числе 6 статей в реферируемых журналах, включенных в перечень ВАК РФ, патент РФ на изобретение, патент РФ на ПМ.
Физические принципы проточно-оптического метода
Аэрозольный путь распространения свойственен многим бактериальным и вирусным инфекциям. Возбудители таких инфекций, относящиеся к группе особо опасных, могут быть использованы в качестве биологического оружия, а также стать орудием биотерроризма. Кроме того, патогенные биологические аэрозоли (ПБА) могут образовываться в результате утечек и аварий на биологически опасных объектах. Таким образом, существующая вероятность загрязнения окружающей среды ПБА ставит совершенствование системы биологического мониторинга приземного слоя атмосферы в число актуальных проблем.
Первоочередной задачей, стоящей перед биомониторингом, является обнаружение ПБА в воздухе и установление их видовой принадлежности. Эффективность средств экстренной профилактики поражений патогенными частицами зависит как от достоверности определения типа биоаэрозоля, так и от времени, которое прошло с момента заражения. Так, антитоксические и противовирусные препараты наиболее эффективны в первые часы после заражения. Эффективность антибиотиков сохраняется максимальной до половинного срока инкубационного периода для заболеваний, вызванных возбудителями бактериальной и риккетсиозной природы. Учитывая, что эффективность профилактики при поражении ПБА падает с ростом времени, прошедшего с начала заражения, набор мер и средств по устранению последствий заражения должен быть оперативным и основанным на достоверной информации о биологической обстановке.
Анализ отечественных и зарубежных систем биомониторинга аэрозольной составляющей приземного слоя воздуха показывает, что в общем случае регистрация и анализ ПБА осуществляется как методами специфической, так и неспецифической индикации. Два названных класса методов обладают своими преимуществами и недостатками и характеризуются набором основных параметров, определяющих эффективность метода при анализе биоаэрозолей. Такими параметрами являются: - избирательность - способность определять тип вещества на фоне примесных веществ; - чувствительность - минимально детектируемая концентрация биологически опасных веществ; - быстродействие - скорость получения результата анализа. К группе систем специфической индикации (СИ) относят приборы (идентификаторы), которые способны определять в пробе присутствие определенных биологических агентов. В таких приборах наиболее часто применяют иммунологические и молекулярно-генетические методы.
Иммунологические идентификаторы выявляют в пробе присутствие антигенных детерминант, которые специфичны для заданного биологического агента. Идентификаторы на основе молекулярно-генетических методов ПЦР и ПЦР-РВ выявляют в образцах веществ специфические последовательности ігуклеиновьтх кислот (ДНК или РНК). С точки зрения экспресс-индикации биоаэрозолей, избирательность иммунологических и молекулярно-генетических методов равноценна. Чувствительность ПЦР-РВ превышает таковую для распространенных иммунологических методов. Ввиду методических особенностей пробоподготовки и анализа, идентификаторы не работают в условиях реального времени.
Примером системы биомониторинга, объединяющей основные методы специфического анализа ПБА, является разработанный в США комплекс APDS (Autonomous Pathogen Detection System - APDS). В основу APDS положены иммунологический и ПЦР метод специфической индикации [1]. Система производит непрерывный отбор аэрозоля с респирабельной фракцией частиц 1-10 мкм и осаждением в жидкую фазу. Периодически (1 раз в час) система проводит иммуноанализ собранной пробы с одновременной детекцией 8 патогенов (авторы заявляют о возможности расширения анализа до 100 патогенов). Для снижения вероятности получения ложноположительных результатов, APDS проводит подтверждающий ПЦР-тест.
В настоящее время типовые системы неспецифической индикации (НИ), не обладая достаточной избирательностью для определения вида опасного возбудителя, применяются для раннего обнаружения аномалий биологического аэрозольного фона атмосферы и включают: - автоматические сигнализаторы биологических аэрозолей; приборы (наборы, комплекты) для предварительной дифференциации биологических аэрозолей на условные таксономические группы.
Автоматические сигнализаторы аэрозолей осуществляют непрерывный мониторинг приземного слоя воздуха и определяют присутствие в пробе потенциалыю опасного биологического аэрозоля на фоне аэрозоля мешающих примесей (почвенной пыли, пыльцы растений, спор грибов). В большинстве случаев их действие основано на возбуждении и анализе флуоресцентного свечения молекул - биологических маркеров, таких как ароматических аминокислот, NADH или флавинов. Преимуществами данных детекторов является высокая чувствительность и быстродействие.
К сигнализаторам аэрозолей, обеспечивающим первичное обнаружение ПБА, предъявляются следующие основные требования: 1) высокое быстродействие, т.е. обнаружение ПБА за минимально возможное время; 2) обеспечение минимально возможного количества ложных срабатываний. Количество ложных срабатываний при заданной пороговой чувствительности определяется степенью избирательности применяемого метода регистрации ПБА в условиях переменного собственного фона атмосферы как неорганического, так и биологического происхождения, который маскирует присутствие патогенов. Решение задачи избирательного детектирования ПБА на фоне мешающих примесей упрощается для приборов НИ, обладающих возможностью проведения условно-групповой дифференциации исследуемых аэрозолей на условные таксономические группы — анализаторы ПБА.
Результаты численного моделирования углового распределения флуоресценции частицы аэрозоля
Приведенный в разделе 1 обзор показывает, что анализ спектров флуоресценции широко применяется в современных сигнализаторах ПОМ для разделения биологических и небиологических частиц. При этом среди методов анализа ПБА, применяемых в рассмотренных устройствах ПОМ, отсутствует исследование характеристик индикатрисы флуоресценции частицы биоаэрозоля.
Из работ [61-64] следует, что характеристики индикатрисы флуоресценции отдельной частицы определяются ее оптическими свойствами. В работе [61] продемонстрировано влияние поглощения на индикатрису флуоресценции оптически плотных частиц суспензий с малым относительным показателем преломления. С другой стороны, как показано в [62-64], для оптически прозрачных частиц аэрозоля в диапазоне размеров aNl-ИО мкм пространственное распределение интенсивности флуоресценции определяется преломлением излучения на поверхности частицы.
Для реальных биоаэрозолей, исследуемых ПОМ, оптическая плотность D (определение см. п. 1.4) изменяется в широком диапазоне значений [65-67], а относительный показатель преломления частицы во внешней среде (воздух) находится в диапазоне 1.3-1.5. Таким образом, следует ожидать, что индикатриса флуоресценции аэрозольной частицы должна одновременно зависеть как от поглощения излучения веществом частицы, так и от преломления излучения на ее поверхности.
Чтобы оценить возможность использования индикатрисы флуоресценции в качестве нового информативного признака аэрозольных частиц, необходимо разработать метод расчета углового распределения флуоресценции частицы аэрозоля, учитывающий как свойства поглощения, так и свойства преломления частицы аэрозоля. Результаты моделирования, полученные на основе данного метода, позволят решить следующие задачи: - исследовать возможность решения «обратной» задачи - определения оптических характеристик частиц на основе измерения параметров индикатрисы флуоресценции; - исследовать возможность использования индикатрисы флуоресценции в качестве нового маркера аэрозольных частиц, позволяющего расширить границы ПОМ как метода анализа; - исследовать влияние углового распределения флуоресценции на величины сигналов флуоресценции, измеряемых в различных направлениях регистрации; - учесть для реальных оптических систем, используемых в ПОМ и отличающихся углами регистрации излучения частицы, влияние углового распределения флуоресценции на измеряемые сигналы. Результаты исследования должны учитываться при обработке результатов измерений в ПОМ.
В данном разделе описан метод исследования углового распределения флуоресценции частиц аэрозоля [69-72]. С использованием данного метода выполнены расчеты для частиц сферической и эллиптической формы, оптические характеристики которых соответствуют экспериментальным данным, для бактерий Envinia herbicola [65] и спор Bacillus subtilis [66]. Частицы с оптическими характеристиками бактерий Envinia herbicola [65] и белка Ovalbumin [67] схожи по оптическим свойствам и являются моделью частиц оптически плотных для возбуждающего излучения и слабо поглощающих излучение флуоресценции. Частицы с оптическими характеристиками спор Bacillus subtilis [66] являются моделью оптически плотных частиц как для возбуждающего излучения, так и для флуоресценции.
При моделировании углового распределения флуоресценции частиц аэрозоля примем следующие допущения: 1) моделирование производится в рамках геометрической оптики: а=4ти//Ы, (2.1) где d - диаметр частицы (здесь и далее в качестве диаметра реальных частиц аэрозоля принимается диаметр проецируемой поверхности, равный диаметру круга, имеющего такую же площадь, как проекция частицы [73]), Х- длина волны излучения; 2) частица состоит из однородного и изотропного по оптическим свойствам вещества; 3) форма поверхности частицы - сфера или эллипсоид; 4) большая ось эллиптической частицы параллельна потоку. Указанные допущения правомерны, так как: - диаметр исследуемых в ПОМ частиц составляет 1-4-10 мкм, а диапазон измеряемых длин волн - 0.26-гО.б мкм, и для нижней границы измеряемого диапазона частиц d=l мкм а=20,9-41,9» 1; - исследуемые патогенные микрочастицы являются простейшими микроорганизмами - прокариотами, не содержат клеточного ядра [74], а биологические вещества, входящие в состав данных частиц, образуют однородную и изотропную по оптическим свойствам среду [65]; - общепринятой моделью аэрозольной частицы является частица с сферической формой поверхности [73], кроме того, форма поверхности множества ПБА, например, спор Bacillus anthracis [75], близка к эллиптической; - при ориентации большей оси эллиптической частицы параллельно потоку выполняется условие наименьшего аэродинамичесткого сопротивления. Тем самым принимается допущение, что при движении эллиптической частицы в области АО ее ориентация не меняется, а большая ось эллипсоида параллельна потоку.
Для расчета характеристик флуоресценции аэрозольной частицы введем малый флуоресцирующий кубический объем AV, для сторон которого выполнено условие: АХ = AY = AZ« d . (2.2) Объем A J7 является достаточно малым, чтобы считать плотность потока световой энергии /, падающей на грань AX-AY, постоянной, но достаточно большим, чтобы среда внутри AV являлась оптически однородной, изотропной и содержала большое количество флуоресцирующих молекул.
Для каждого AV угловое распределение излучения флуоресценции принимается изотропным, аналогично [62]. С точки зрения структуры частицы, это соответствует модели, предполагающей, что вещество частицы состоит из вращающихся в жидкой среде изотропно-излучающих диполей [63,64]. Так как выполнено условие (2.2), излучение элементарного объема эквивалентно излучению точечного источника, помещенного в центр AV. Тогда энергия флуоресцентного излучения є элементарного объема AV при нахождении частицы в области анализа равна: s = W,,-AV = —AV. (2.3) с Здесь \Уф (Дж/м3) - средняя объемная плотность энергии флуоресцентного излучения в объеме AV, /(Вт/м2) - средняя плотность потока возбуждающего излучения, попавшего на грань элементарного объема, к — коэффициент, учитывающий эффективность возбуждения флуоресценции (к = K-AZ-%, К - показатель поглощения на длине волны возбуждения, % - квантовый выход флуоресценции), с - скорость света. Если внутри частицы к= const, а размеры ДГпо всему объему частицы постоянны, то є определяется только падающей на грань элементарного объема плотностью потока /.
Блок-схема оптической системы. Определение геометрии объектива регистрации -эллиптического зеркала
Для проверки результатов численного моделирования флуоресценции модельных частиц аэрозолей (глава 2) необходимо разработать оптическую систему, обеспечивающую измерение параметров индикатрисы флуоресценции в нескольких направлениях регистрации. Измерение параметров индикатрисы позволит сравнить полученные результаты теоретического моделирования индикатрисы флуоресценции аэрозольных частиц и оценить степень информативности измерения пространственного распределения флуоресценции в качестве нового информативного признака биоаэрозолей. Кроме того, полученные экспериментальные данные по разделению биоаэрозолей на основе измерения аир необходимо сравнить с данными по классификации биоаэрозолей на основе измерения других информативных признаков, таких как регистрация излучения флуоресценции, возбуждаемой в диапазоне AXB03(1) и AXDo3(2), или измерение индикатрисы рассеяния в нескольких широких углах регистрации (п. 1.2.2). Следовательно, в конструкции системы регистрации целесообразно дополнительно предусмотреть возможность измерения указанных признаков.
Таким образом, необходимыми требованиями по назначению к разрабатываемой оптической системе регистрации являются: 1) возможность исследования индикатрисы флуоресценции аэрозольной частицы; 2) возможность одновременного регистрации нескольких спектральных диапазонов флуоресценции и рассеяния при возбуждении аэрозолей излучением АКвт и А -воз ; 3) возможность исследования индикатрисы рассеяния аэрозольной частицы в нескольких широких углах регистрации; 4) возможность освещения области АО излучением нескольких УФ источников с длинами волн УФ возбуждения в диапазоне ДЛ.ВОТ и АЯВ03(2). Выбор в качестве источника излучения в диапазоне АА.В03(1) лазера ЗАО «Лазерная физика» позволяет сформулировать конструктивные требования, предъявляемые к системе регистрации с точки зрения обеспечения высокого отношения сигнал/шум и минимизации разброса измеряемых сигналов. Как следует из 3.4, эффективность передачи оптического сигнала частицы на ПОИ определяется минимальной плотностью энергии возбуждающего излучения в АО: G =А/Е, (3.9)
Так как при постоянном г, G определяется величиной телесного угла регистрации Q (см. 3.5), то необходимо выбрать величину Q, обеспечивающую выполнение условия 3.4.
В современных системах ПОМ угол светосбора Q может изменяться в широких пределах и, при использовании мощных источников УФ излучения, как правило, не превышает я/2 стер, при этом для AXDOT(1) необходимая минимальная плотность энергии источника в пятне излучения должна составлять рЕ = 250 мкДж/ см2 (G= я/4, при т 0,5 (см.3.5)).
Оптическая система регистрации системы с эффективностью светосбора 2= 7i/2 стер показана на рис. 3.1 [78]. Как правило, в качестве объектива регистрации в подобных системах используется зеркальный объектив Кассегрена [78] или Швальцшильда [6], однако возможно использование линзового объектива [7]. В данной схеме излучение частицы аэрозоля (на рис. 3.1 показаны только регистрируемые лучи), вышедшее из АО, фокусируется объективом регистрации в область полевой диафрагмы и далее, пройдя через коллимирующую линзу, попадает на систему спектроделительных зеркал и широкополосных светофильтров, обеспечивающую разделение регистрируемого излучения на несколько спектральных диапазонов [78]. Наличие полевой диафрагмы во втором фокусе объектива регистрации позволяет выделять резкие границы области анализируемого объема, что исключает возможность попадания в канал регистрации сигналов частиц расположенных вне АО одновременно с измерением сигнала частицы в АО. Кроме того, данная диафрагма подавляет оптическую фоновую засветку приемника возбуждающим излучением. Отметим, что вместо системы спектроделительных зеркал за полевой диафрагмой может устанавливаться диспергирующий элемент (дифракционная решетка или призма), передающий разложенный в пространстве спектр на спектрограф [6].
В разрабатываемой системе в качестве источника излучения в диапазоне длин волн АХ.В03(1) предполагается использовать импульсно-периодический лазер ЗАО «Лазерная физика» (п. 3.1). Опыт эксплуатации данных УФ лазеров показывает, что наиболее стабильные характеристики работы (частота повторения импульсов, стабильность распределения энергии в пятне и др.) достигаются при энергии в импульсе, не удовлетворяющей условию (3.1) при Q = я/2 стер (G = я/4 стер). Так, при характерном размере пятна в области АО 0,04x0,04 мм средняя плотность энергии в импульсе лазера составляет рЕ = 100 мкДж/см2, тогда как необходимое значение плотности равно рЕ = 250мкДж/см2. Тем самым, использование системы регистрации с Q = я/2 стер при возбуждении флуоресценции от данного источника приводит к ухудшению чувствительности прибора. Следовательно, необходимым требованием при разработке оптической системы регистрации является обеспечение высокого угла светосбора Q 2л стер.
К недостаткам оптической схемы регистрации, показанной на рис. 3.1, также можно отнести: - зависимость сигнала от положения частицы в области анализируемого объема при наличии неоднородной чувствительности приемной площадки ФЭУ; - невозможность регистрации пространственного распределения частицы.
Так как в рассмотренной схеме угол наклона пучка лучей после коллимирующей линзы зависит от положения частицы в области анализируемого объема, то из-за неоднородной чувствительности приемной площадки ФЭУ, а также из-за виньетирования пучка краями входного окна при нахождении частицы у края АО, возникает зависимость величины регистрируемого сигнала от положения частицы внутри АО. Аналогичный эффект наблюдается в системе, в которой передний фокус объектива регистрации оптически сопряжен с приемной площадкой приемника [6,7,8]. Использование в подобной системе объектива регистрации с высокой числовой апертурой, например, эллиптических зеркал [8], приводит к дополнительному вкладу в разброс данных из-за присутствия оптических аберраций изображения частицы, смещенной из переднего фокуса объектива (размер аберрации растет при увеличении смещения из фокуса). Кроме того, наличие значительных аберраций в плоскости приемной площадки определяет необходимость использования приемника с большим размером окна приемной площадки, что увеличивает Щ - долю фоновой оптической подсветки, а следовательно, уменьшает величину СШ(см. 3.1).
Указанные проблемы зависимости сигнала от положения частицы могут решаться введением дополнительных технически сложных систем для определения точного положения частицы внутри АО для последующей калибровки зарегистрированного сигнала. Например, в [9] описана подобная система, которая позволяет определять скорость частицы и ее положение в плоскости ортогональной потоку. Система состоит из четырех узких лазерных пучков, сфокусированных в разных точках и под разными углами наклона на поток аэрозоля выше АО. Однако, в полевом варианте устройства ПОМ применение таких систем нежелательного из-за чрезмерного усложнения конструкции.
Анализ полученных результатов. Оценка избирательности информативных признаков ПОМ
Из полученных в п. 4.1.2 результатов (рис. 4.10 и табл. 4.1) по измерению характеристик индикатрисы флуоресценции следует:
1) в диапазоне Х.і=300-ь400 нм для всех веществ, кроме белка Ovalbumin второго типа, максимумы распределений р(х) признаков аир находятся вблизи 1 либо незначительно меньше 1 (Мах(ра, /?р)=0.8-1), тогда как для белка Ovalbumin второго типа Мах(/ а)=0.5, Мах(/)р)=0.7. Средние значения а незначительно превышают 1 (Med(a)=l .2-1.4), средние значения Р с точностью до одного знака после запятой равны 1;
2) в диапазоне Х.і=400- 500 нм максимумы распределений р(х) и средние значения аир всех веществ оказываются смещенными в сторону больших значений. Для а наибольшее смещение наблюдается у спор бактерий Bacillus subtilis (кривая 1 рис. 4.11, Мах(/эа)=2), для Р - у спор бактерий Bacillus subtilis и суспензий Ovalbumin (кривые 1 и 4 рис 4.11, Мах(/)р)=1.7/
Таким образом, в диапазоне А.]=300 400 нм индикатриса флуоресценции всех веществ преимущественно изотропна (исключением является белок Ovalbumin второго типа, для которого Мах(ра, рр) 1), тогда как в диапазоне Аг=400-=-500 нм максимум индикатрисы оказывается смещенным в направлении источника возбуждающего излучения. Сравнение данных эксперимента с теоретическим моделированием показывает, что индикатриса флуоресценции исследуемых частиц определяется одновременным действием трех эффектов, описанных во второй главе: геометрическим эффектом преломления излучения поверхностью частицы и эффектами поглощения излучения на длинах волн возбуждения и флуоресценции. Так, нахождение максимумов р(х) в области а, в \ обусловлено доминирующим действием геометрического эффекта, тогда как влияние эффектов поглощения возбуждающего излучения и излучения флуоресценции проявляется в совместном ослаблении геометрического эффекта. При этом, наиболее ослабленным эффект оказывается для белка Ovalbumin второго типа в диапазоне регистрации Х\ (Мах(ра,/?р) 1).
Смещение максимумов распределений р(х) при переходе от X,i к Х.2 означает, что для всех веществ в диапазоне Х\, наряду с геометрическим эффектом и эффектом поглощения возбуждающего излучения, на форму индикатрисы оказывает существенное влияние эффект поглощения излучения флуоресценции. При этом, поглощение флуоресцентного излучения наиболее велико для спор Bacillus subtilis, для которых величина смещения максимальна, и менее значительно у остальных веществ. Полученные результаты в целом согласуются с данными работ [66,67], на основе которых частицы Ovalbumin являются слабо поглощающими в диапазонах длин волн флуоресценции Х\ и %і (Аі=збо=0.013н-О.ІЗ, Дх=430)=О.0О8-гО.08), а частицы спор - оптически плотными (1\=зб5-0.56-г5.69, А.=430=0.52-ь5.2). Вместе с тем, данные [66,67] показывают, что как для белка Ovalbumin, так и для спор Bacillus subtilis ввиду близости значений оптической плотности Z\ в диапазонах измеряемых длин волн флуоресценции, угловое распределение флуоресцентного излучения не должно существенно изменяться при переходе от диапазона Л.і=300-ь400 нм к диапазону A.2=400-j-500 нм. Однако для всех исследуемых веществ в эксперименте наблюдалось смещение положения максимумов распределений р(х) при переходе от Xi к Х2- Отмеченное расхождение свидетельствует о возможном различии оптических свойств веществ, исследуемых в работах [66,67] и в настоящем эксперименте. Такие различия могут быть связаны с разными условиями изготовления образцов веществ и их хранения [50,90].
Чтобы разрешить указанное противоречие, в продолжении экспериментальных Исследований были произведены ОЦеНКИ изменения ОПТИЧеСКОЙ ПЛОТНОСТИ Dc(K) используемых образцов веществ в диапазоне длин волн ,=250-500 нм. Для уменьшения эффекта рассеяния порошки сухого белка Ovalbumin и частиц спор были помещены в среду с близким показателем преломления (вода). Суспензии Ovalbumin были разбавлены водой с целью уменьшения оптической плотности и, как следствие, снижения влияния эффекта самозатенения частиц на результаты измерения величин DCQJ- Эксперимент проводился на спектрофотометре СФ-46.
По данным измерений отношение оптических плотностей на длинах волн возбуждения и флуоресценции составляет для частиц Ovalbumin первого типа -Ocp.=265/ cpi=450)=7.2, Dc(k=265-/DcQ,=350)=3, Для Ovalbumin второго типа DCQ. 265)/DcQ.=450r6J, DC(k=26S)/Dc 350r4.0, ДЛЯ ЧаСТИЦ СуСПеНЗИЙ ср.=265/)С(Х=450)=6.6, Ос0 265)/Ос(),=350)=2Л, ДЛЯ СПОр баКТерИЙ BacilhlS SllbtiliS -Ос(Х=265)/- С(?.=450)=2.7, C(x=265/.Oc(x=350)-l-7. Таким образом, оптическая плотность всех исследуемых веществ монотонно уменьшается с ростом длины волны флуоресценции, что качественно объясняет полученные экспериментальные результаты, показывающие ослабление эффекта поглощения флуоресцентного излучения с ростом длины волны. Кроме того, для частиц спор оптические плотности в диапазоне возбуждения и флуоресценции имеют более близкие значения, чем для белка Ovalbumin, что совпадает с данными [66] и косвенно указывает на большую величину оптической плотности частиц спор в сравнении с остальными веществами. Отметим, что увеличение асимметрии индикатрисы всех исследуемых веществ при переходе от диапазона регистрации флуоресцентного излучения 1=300-400 нм к Х.2=400-500 нм соответствует на рис. 2.4 переходу а от кривой 5 к 3 при DB 2.3, и Р от кривой 6 к 4 при DB 3.3.
Полученные экспериментальные данные подтверждают наличие эффекта анизотропии флуоресценции, который зависит от оптической плотности частиц аэрозоля на длинах волн возбуждения и флуоресценции. Следует отметить, что эффекты поглощения и преломления, определяющие индикатрису флуоресценции аэрозолей, проявляются схожим образом для суспензий Ovalbumin, близких по свойствам к расчетной модели, и для порошковых проб Ovalbumin, что подтверждает применимость методики численного моделирования индикатрисы флуоресценценци к сухим частицам аэрозолей.
Таким образом, измерение признаков а, В позволяет исследовать поглощающие свойства аэрозолей и, в частности, по величине смещения максимума индикатрисы при смене спектральных диапазонов измерения флуоресценции сравнивать поглощающие свойства различных аэрозолей. Так, частицы спор Bacillus subtilis, для которых смещение максимума наиболее существенно, являются более оптически плотными на длинах волн флуоресценции в сравнении с частицами белка Ovalbumin.
