Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы исследования деформируемости эритроцитов 16
1.1 Строение эритроцита. Оптические и физические свойства эритроцита и их измерение 16
1.2 Влияние оптических и физических характеристик эритроцита на рассеяние излучения 22
1.3 Измерение показателя преломления эритроцитов 28
1.4 Лазерная дифрактометрия эритроцитов (дифракционные приближения, относительный и абсолютный размер дифракционных колец) 38
Выводы к главе 1 45
Глава 2. Лазерная дифрактометрия показателя преломления эритроцита 47
2.1 Особенности использования теории Ми для дифрактометрии эритроцитов 47
2.1.1. Приближение теории Ми 47
2.1.2. Анализ чувствительности метода измерения, основанного на регистрации размера дифракционных колец 49
2.2. Связь дифракционной картины с длиной волны и параметрами эритроцитов 55
2.2.1. Влияние дисперсности эритроцитов на вид дифракционной картины 55
2.2.2. Контраст дифракционной картины от совокупности эритроцитов 57
2.2.3. Связь длины волны и параметров дифракционной картины 62
2.2.4. Связь длины волны и контраста дифракционной картины от совокупности эритроцитов 66
2.3. Лазерная дифрактометрия эритроцитов при использовании излучения с различными длинами волн 68
Выводы к главе 2 74
Глава 3. Лазерная дифрактометрия показателя преломления при гипоосмотическом набухании эритроцита 76
3.1 Модель изменения показателя преломления эритроцита в гипоосмотической среде 76
Выводы к главе 3 85
Глава 4. Экспериментальное исследование показателя преломления эритроцитов 87
4.1 Описание экспериментальной установки и анализ точности измерения показателя преломления 87
4.2 Методика проведения эксперимента и обработки экспериментальных результатов 93
4.3 Дифрактометрия показателя преломления эритроцита при использовании излучения одной длины волны 98
4.4. Влияние плотности мощности излучения на показатель преломления 107
4.5. Дифрактометрия показателя преломления эритроцита при использовании излучения двух длин волн 117
4.6. Экспериментальное исследование изменения показателя преломления эритроцита при "скачке" 123
4.7. Экспериментальное исследование воздействия постоянного магнитного поля на процесс гипоосмотического набухания 129
Выводы к главе 4 133
Заключение 135
Список литературы
- Влияние оптических и физических характеристик эритроцита на рассеяние излучения
- Анализ чувствительности метода измерения, основанного на регистрации размера дифракционных колец
- Модель изменения показателя преломления эритроцита в гипоосмотической среде
- Методика проведения эксперимента и обработки экспериментальных результатов
Введение к работе
Актуальность работы.
В науке и технике измерения занимают центральное место. Необходимость объективной оценки измеряемых величин требует продуманного подхода к проблеме измерений и обеспечения единства способов измерений. Данная проблема не является специфической задачей только метрологов. Обоснованный выбор подлежащих количественной оценке показателей и свойств различных явлений и объектов измерений, получение достоверной измерительной информации о состоянии исследуемых объектов и другие вопросы обеспечения единства измерений представляют интерес для широкого круга специалистов. При этом положение усугубляется появившимися высокоточными средствами измерений, обладающими высоким потенциалом ожидаемой точности измерений.
В общем виде измерение, как процесс человеческой деятельности, образует некоторый мост между реальной действительностью и её количественным познанием. При описании этого процесса необходимо использовать понятия, относящиеся к материальному миру (объекты измерения, объекты исследования), к его отражению в нашем сознании (модели) и к механизму образования этого отражения (методы и средства измерений, единицы физических величин, способы обработки результатов наблюдений).
Оптическим методам измерения присущ целый ряд особенностей: высокая точность измерения, неконтактность, инвариантность, возможность автоматизации измерения. Изобретение лазеров в 60-е годы прошлого столетия расширило возможности оптических методов измерения в силу их основных преимуществ: неконтактности, высокого пространственного разрешения, высокой точности. Особенно высок интерес к применению оптических и, в частности, когерентно-оптических методов измерения в
биологии и медицине. Среди этих методов наиболее перспективна лазерная
иГГ-1
дифрактометрия. Основные достоинства лазерной дифрактометрии инвариантность к смещениям исследуемого образца, неконтактность, высокая точность (до сотых долей мкм), возможность автоматизации измерения — способствуют широкому ее применению, и, в частности, для измерения механических и оптических параметров эритроцитов.
Одна из функций эритроцитов — перенос кислорода в организме благодаря наличию в них молекул гемоглобина. Изменение концентрации гемоглобина в эритроцитах является одним из признаков ухудшения снабжения тканей кислородом. При ряде заболеваний системы крови, например, при множественной миеломе, нередко наблюдаются осложнения, в основе которых лежит нарушение реологических свойств крови с расстройством микроциркуляции, что существенно ухудшает течение заболевания. Очевидно, что их раннее выявление и проведение своевременных лечебных мероприятий будет способствовать предупреждению (и даже ликвидации) осложнений, стабилизации основного патологического процесса. Так как показатель преломления эритроцита является одним из основных оптических параметров, характеризующих концентрацию гемоглобина в клетке, и взаимосвязан с деформируемостью эритроцитов, то его изучение представляется достаточно актуальным.
К настоящему времени предложено много методов оценки показателя преломления взвеси биологических частиц (и в том числе эритроцитов), недостатками которых являются низкая точность и трудоемкость измерений, что затрудняет их использование в практической медицине. Применение оптического метода измерения показателя преломления эритроцитов зависит от многих факторов: структуры частицы, плотности упаковки (концентрации или гематокрита), дисперсности частиц, характера зондирующего излучения и, в общем случае, является достаточно сложной задачей.
В работе предложено использовать для измерения показателя преломления эритроцитов метод лазерной дифрактометрии. Измерения проводились в условиях гипоосмотического набухания клеток. Высокая
5 пространственная когерентность и монохроматичность лазерного излучения позволяют с большей точностью проводить измерение показателя преломления.
Цель и задачи работы
Цель работы: разработка способа измерения показателя преломления эритроцитов методом лазерной дифрактометрии и исследование возможности его использования в практической медицине.
Поставленные задачи:
1. Рассмотреть применимость метода лазерной дифрактометрии для
измерения показателя преломления эритроцитов и исследовать:
У связь показателя преломления эритроцитов и параметров дифракционной
картины; У влияние дисперсности эритроцитов на вид дифракционной картины; У связь длины волны и параметров дифракционной картины при
дифрактометрии эритроцитов; У влияние пространственной фильтрации на контраст дифракционной
картины при дифрактометрии эритроцитов.
2. Экспериментально исследовать возможность измерения показателя
преломления эритроцитов в условиях гипоосмотического набухания
методом лазерной дифрактометрии:
У оценить влияние плотности мощности лазерного излучения на показатель
преломления эритроцитов; У определить взаимосвязь показателя преломления эритроцитов с данными
лабораторного обследования больных множественной миеломой; У исследовать связь изменения показателя преломления эритроцитов с
характером изменения гипоосмотической кривой; У изучить влияние in vitro постоянного магнитного поля на жесткость
эритроцитарной мембраны и показатель преломления эритроцитов.
Личный вклад автора.
Все представленные экспериментальные исследования и теоретические расчеты проведены при личном участии автора. Научная новизна работы.
Впервые для измерения показателя преломления эритроцитов применен метод лазерной дифрактометрии с использованием двух длин волн излучения (Х=0,53 мкм и А.=0,63 мкм).
Найдена оптимальная функция пространственной фильтрации, обеспечивающая максимальный контраст дифракционной картины при дифрактометрии эритроцитов. Данная функция изменяется по закону, обратному скорости спада интенсивности, и для длин волн Х=0,53 мкм и
А.=0,63 мкм имеет вид -*--г, где ф - угловой размер дифракционных
Ь + Сф
колец, а, Ь, с, d=const.
Выявлено, что уменьшение плотности мощности лазерного излучения в терапевтическом диапазоне (А^=0,53 мкм и Ая=0,63 мкм) приводит к повышению деформируемости и показателя преломления эритроцитов.
Подтверждено, что уровень общего белка и парапротеина в сыворотке крови больных множественной миеломой являются основными факторами, влияющими на жесткость эритроцитарной мембраны и показатель преломления эритроцитов.
Показано, что по показателю преломления эритроцитов можно косвенно судить о концентрации гемоглобина.
Обнаружена: а) связь жесткости эритроцитарной мембраны с показателем преломления и б) скачкообразный характер изменения показателя преломления эритроцитов при гипоосмотическом набухании.
Отмечено положительное действие постоянного магнитного поля на деформируемость эритроцитов, что позволяет рекомендовать этот метод для использования в клинической практике.
Практическая ценность.
Разработан способ измерения показателя преломления эритроцитов методом лазерной дифрактометрии, который является информативным и доступным клинической практике. Показана возможность дифракционного метода измерения показателя преломления эритроцитов; оценено влияние параметров эритроцитов и лазерного излучения на точность измерения показателя преломления. Разработанный способ, основанный на анализе поля рассеяния на двух длинах волн, подтвержден экспериментально при исследовании образцов крови больных множественной миеломой. Выявлена зависимость показателя преломления эритроцитов от степени патологического процесса. Рассмотрено воздействие плотности мощности лазерного излучения на показатель преломления и жесткость эритроцитарной мембраны. Методом лазерной дифрактометрии измерен показатель преломления эритроцитов при скачкообразном характере гипоосмотического набухания, а также жесткость эритроцитарной мембраны и показатель преломления эритроцитов при воздействии постоянного магнитного поля. Данный метод может быть применен с целью диагностики гипервискозного синдрома при множественной миеломе и тромбогеморрагических осложнений, наблюдаемых при других заболеваниях. Метод используется в клинике гематологии и клинической иммунологии Военно-медицинской академии Санкт-Петербурга с 2003 года и включен в план обследования больных. Метод также используется в гематологической клинике Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (г. Санкт-Петербург).
Положения, выносимые на защиту.
Метод лазерной дифрактометрии на двух длинах волн лазерного излучения Х=0,53 мкм и Х=0,63 мкм позволяет измерять показатель преломления эритроцитов.
Показатель преломления эритроцитов позволяет косвенно судить о концентрации гемоглобина в крови и поэтому может быть одним из маркеров гипервискозного синдрома.
3. Низкочастотное постоянное магнитное поле оказывает в целом положительное влияние на функциональные способности эритроцитов: омагничивание клеток постоянным магнитным полем 2,5 мТл в течение 30 минут приводит к повышению их деформируемости, а, следовательно, и к росту показателя преломления. Апробация работы.
Результаты работы обсуждались на семинарах кафедры КЭиБМО, ИТМО, СПб. Содержание докладывалось на XX научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, СПб ИТМО, 1999; третьем международном симпозиуме "Лазеры в медицине", СПб ГМУ, 1999; международной конференции молодых ученых и специалистов "Оптика-99", СПб, 1999; юбилейной научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава ИТМО, СПб, 2000; Российской научно-практической конференции Оптика - ФЦП "Интеграция", СПб ИТМО, 2000: научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", СПб НИИ гематологии и трансфузиологии, 2000 и 2004; III международном симпозиуме "Полупроводниковые и твердотельные лазеры в медицине 2000", СПб ГМУ, 2000; конференциях "Лазеры для медицины, биологии и экологии", СПб Балтийский государственный технический университет "Военмех", 2000 и 2001; конференции "Лазеры для медицины, биологии и экологии", СПб Государственный политехнический университет, 2004; конференциях "Лазеры. Измерение. Информация.", СПб Балтийский государственный технический университет "Военмех", 2000 и 2001; конференции "Лазеры. Измерение. Информация.", СПб Государственный политехнический университет 2003; конференции "Leukemia 2000 towards the cure", Houston, Texas, USA, 2000; 6-й и 8-й российской научно-технической конференции "Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов" ЭМС-2000, СПб Военный инженерно-технический университет, 2000.
9 Структура и объем работы.
Влияние оптических и физических характеристик эритроцита на рассеяние излучения
Оптические методы измерения, основанные на рассеянии излучения, достаточно широко используются в биологии и медицине для нахождения оптических и физических параметров эритроцитов [11]. Рассеяние излучения обусловлено разнообразными факторами, поэтому его трудно описать на основе единой теории.
Рассеянию излучения малыми частицами соответствует широкий класс явлений, которые можно описать на основе теории дифракции, используя различные ее приближения. Многие характерные особенности рассеяния излучения частицами удается проследить в рамках строгой теории, разработанной для сферических частиц немецким ученым Г. Ми [12; 13].
Сечение и интенсивность рассеянного излучения сильно зависят от размера частицы и разности диэлектрических проницаемостеи вещества частицы и окружающей среды. Если размер частицы много меньше длины волны излучения, то в результирующем светорассеянии преобладает обратное рассеяние. С увеличением размера частиц до величин, сопоставимых с длиной волны и больших длины волны, основную роль в рассеянии излучения играют классические дифракционные явления; в индикатрисе рассеяния появляются резкие максимумы и минимумы, прямое рассеяние усиливается, обратное -ослабевает.
На характер рассеяния излучения на микронных частицах также оказывают влияние их форма, показатель преломления, внутренняя структура, функция полидисперсности [12; 13].
Интенсивность рассеянного излучения согласно теории Ми является функцией параметра дифракции p=kaN, где k=2ii/X - волновое число, а -радиус частицы, N=n-ix - комплексный показатель преломления, п -вещественный показатель преломления, % — показатель поглощения.
Большинство работ по измерению показателя преломления биологических частиц основано на использовании теории Ми. Учитывая, что форма частиц отличается от идеальной, и они имеют неоднородный внутренний состав, использование теории Ми для рефрактометрического анализа во многих случаях оказывается затруднительным. Однако в ряде случаев, когда неоднородности биологических частиц вносят достаточно малый вклад в рассеяние излучения и ими можно пренебречь [14; 15], возможно использование теории Ми.
Получаемые в эксперименте картины рассеяния на суспензии биологических частиц заметно отличаются от картины рассеяния на модельных объектах, то есть на шарах, сферах, эллипсоидах и т.д. Поэтому при измерении показателя преломления говорят о так называемом «эффективном» показателе преломления частицы, размере и форме [14]. Основное влияние на показатель преломления частицы оказывает внутреннее содержимое клетки, его концентрация [16].
Комплексный показатель преломления эритроцита является его важной физической характеристикой. Показатели преломления и поглощения эритроцита характеризуются дисперсионной зависимостью от длины волны [17]. В практическом большинстве работ [17; 18; 19] измерения проводятся в спектральном интервале 0,5-1,1 мкм, соответствующим минимуму поглощения гемоглобина и его дериватов (рис. 2); показатель поглощения гемоглобина много меньше единицы, поэтому его можно не учитывать. Вещественная часть показателя преломления эритроцита в оптическом диапазоне длин волн близка к единице [20], и поэтому эритроцит можно отнести к разряду «мягких» частиц. Показатели преломления и поглощения связаны соотношением Крамерса-Кронига, которое часто используется для определения вещественной или мнимой части показателя преломления.
Мембрана эритроцита как самостоятельная структура также характеризуется показателем преломления и поглощения. С точки зрения оптики можно считать, что эритроцит состоит из двух фаз с разными показателями преломления: мембраны эритроцита, оптические свойства которой определяются прежде всего двойным липидным слоем (показатель преломления около 1,46 [22]) и цитоплазмы, оптически достаточно однородной, с показателем преломления 1,4. Результаты теоретического исследования влияния мембраны сфероцита на поглощение и рассеяние излучения [23] показывают, что она практически не оказывает влияния на рассеяние в прямом направлении, однако влияет на величину обратного рассеяния и приводит к уменьшению сечения обратного рассеяния. Авторы работы [23] приводят значения показателей преломления компонентов эритроцита относительно плазмы (табл. 1).
Если в первом приближении не учитывать дихроизма и двойного лучепреломления кристаллов гемоглобина, то в эритроцитах спектр гемоглобина такой же, как и в растворе [25]. Спектр характеризуется выраженной полосой поглощения 0,40-0,43 мкм (полоса Соре) с максимумом для окисленного гемоглобина 0,416 мкм (рис. 2). В свежих мазках на воздухе весь гемоглобин очень быстро переходит в оксигенированную форму. Наличие сопряженных двойных связей в структуре гема увеличивает молярную преломляющую способность, приводя к аномальной дисперсии в области поглощения. При использовании оптических методов измерения, основанных на рассеянии излучения, величина показателя преломления эритроцита оказывает влияние на точность определения функции распределения эритроцитов по размерам. С другой стороны, характеристики функции распределения, в частности, дисперсность, также влияют на точность измерения показателя преломления клетки оптическими методами. В работе [26] для восстановления функции распределения эритроцитов по размерам используется метод неопределенных коэффициентов. В работе [27] отмечается, что максимальное совпадение функции распределения эритроцитов по размерам, восстановленной методом малых углов и полученной стандартным методом путем подсчета эритроцитов в камере Горяева, обеспечивается при введении поправки на показатель преломления частицы.
В работе [28] проведен теоретический анализ и экспериментальное исследование образцов сферулированных эритроцитов при различных длинах волн. Анализ сечения рассеяния излучения на совокупности сфероцитов был проведен при принятии допущения о фиксированном значении показателя преломления и без учета поглощения. Были рассчитаны зависимости длины волны, на которую приходится максимум показателя рассеяния слоя (показатель рассеяния, умноженный на концентрацию частиц), от среднего радиуса совокупности эритроцитов. Экспериментально был измерен показатель рассеяния слоя методом спектральной прозрачности. Максимальное совпадение экспериментальной и теоретической зависимости длины волны, на которую приходится максимум показателя рассеяния слоя, от среднего радиуса совокупности эритроцитов приходится на значение показателя преломления 1,055. Отличие экспериментальных и теоретических результатов авторы работы объясняют дисперсией показателя преломления эритроцитов в спектральном диапазоне 0,4-1 мкм, что не было учтено при теоретических расчетах. Показатель преломления п=1,055 авторы предлагают рассматривать как среднестатистический параметр эритроцита. Авторы отмечают, что погрешность измерения дифракционного параметра, среднего радиуса совокупности эритроцитов и концентрации эритроцитов лежит в пределах 0-И 2%. Наименьшую погрешность обеспечивает показатель преломления совокупности эритроцитов 1,055.
В большинстве случаев изучение эритроцитов проводят путем исследования: 1) цельной крови (влажный препарат), когда гемоглобин находится в эритроцитах; 2) гемолизированной крови (влажный препарат), для получения которой нарушают мембрану эритроцита, что способствует переходу гемоглобина в раствор; 3) мазков крови (высушенный препарат).
Каждый из этих способов имеет свои достоинства и недостатки. При проведении измерений в гемолизированной крови возможно воздействие на форму эритроцита, что удобно для измерения его физических параметров. По мазкам крови целесообразнее наблюдать за динамикой развития заболевания в течение длительного времени, они удобны при хранении и проведении измерений и их приготовление не требует много времени.
Анализ чувствительности метода измерения, основанного на регистрации размера дифракционных колец
Теория Ми - это теория рассеяния (дифракции) плоской электромагнитной волны на однородной сфере произвольного размера. В рамках этой теории удается решить широкий круг задач, связанных с исследованием клеток. Сегодня теория Ми все чаще используется при исследованиях биологических объектов, так как многие клетки (в частности, и объект исследования - эритроциты при гипоосмотическом набухании) по форме представляют собой шары. Теория Ми применяется для определения размеров и оптических констант вещества внутриклеточных образований, в спектрофотометрии отдельных участков живой клетки, для определения толщин клеточных оболочек и мембран, исследования оптических свойств микроорганизмов [27; 28; 64].
Рассмотрим основные положения, лежащие в основе теории Ми дифракции плоской электромагнитной волны на однородной сфере произвольного размера.
Метод решения, основанный на использовании теории Ми, состоит в том [13], что падающее поле выражается через сферические волны с центрами на поверхности идеальной сферы. Решение Ми было получено в результате применения теории электромагнитного поля Максвелла к задаче рассеяния света однородной сферической частицей, на которую падает плоская волна. Каждая сферическая волна поляризует сферу и возбуждает в ней вторичные волны, которые и образуют рассеянный свет. Эти вторичные волны называются парциальными волнами Ми. Полная интенсивность рассеянного излучения определяется суммой бесконечного числа парциальных волн. При наличии соответствующих граничных условий решается дифференциальное уравнение для амплитуды вектора результирующего поля на поверхности сферы и на бесконечном расстоянии от нее в так называемой волновой зоне. Этот метод позволяет получить аналитическое решение данной проблемы самым строгим образом, поскольку использует формальную теорию и классический математический анализ.
При формулировке задачи Ми используются следующие основные параметры: размер частицы р=ка в относительных единицах, где к =2п/Х -волновое число в свободном пространстве (к - длина волны), а - радиус сферической частицы и комплексный показатель преломления ш, который по отношению к окружающей внешней среде записывается в виде m=n-i%, где п и X - действительная и мнимая части показателя преломления. Угол рассеяния определяется направлением падающих волн, точкой рассеяния 0 и направлением наблюдения.
При ка«1 и пка«1 существенен только первый член ряда (электрический диполь) и теория Ми приводит к формуле Рэлея (закон рассеяния на частицах, размер которых много меньше длины волны зондирующего излучения). Если ка«1, но пка не мало, то при пка=пш (т -целое число) сечение рассеяния резко возрастает до бтса (резонансы Ми). При увеличении размеров частицы интенсивность последующих парциальных электромагнитных волн возрастает, а интенсивности волн с меньшими номерами осциллируют, причем амплитуда осцилляции убывает с ростом номера волны. Для больших частиц (ка 1) число учитываемых парциальных волн ка.
Полный коэффициент рассеяния частицы в теории Ми представляется суммой коэффициентов для отдельных парциальных волн. Для больших частиц (ка»1) показатель ослабления излучения равен 2яа2, т.е. он не зависит от X и равен удвоенному поперечнику сферической частицы 2тга2. Это объясняется тем, что половина ослабления происходит за счет рассеяния и поглощения внутри частицы, а другая, тоже па , вызвана дифракцией света на контуре частицы [12].
Форма индикатрисы рассеяния излучения 1(a) (а - угол рассеяния) также зависит от ка и п. Для рэлеевских частиц I(a) (l+cos а), индикатриса имеет симметричную форму. С ростом ка индикатриса приобретает многолепестковую форму, вытягиваясь вперед. При ка—»оо вокруг частицы образуется дифракционный конус, угол раствора которого а 1/ка. В дифрагированном пучке наблюдается система постоянно убывающих темных и светлых колец, т.н. "венцы". Обычно в реальной дисперсной системе вместо венцов в области малых углов происходит постепенное уменьшение интенсивности рассеяния.
Значения основных функций рассеяния полностью определяются точностью вычисления коэффициентов Ми ап и bn [13].
Считается [13], что для исследования явления рассеяния как в коллоидных взвесях, так и в атмосфере решение Ми даёт наилучшие результаты.
Теория Ми позволяет определять параметры индикатрисы рассеяния, зная два параметра единичного объекта - показатель преломления и диаметр. Для измерения распределение интенсивности рассеянного (дифрагированного) лазерного излучения используются лазерные дифракционные измерители [60].
Лазерные дифракционные измерители позволяют проводить измерение размеров в диапазоне от единиц до сотен микрометров с точностью до десятых долей процента. При этом удовлетворяются следующие требования: бесконтактность, малое время и высокая локальность измерения, инвариантность к смещениям и отсутствие необходимости фиксации образца. Согласно [60] чувствительность метода измерения позволяет оценить его точностные возможности. Поэтому для решения вопроса повышения точности измерения показателя преломления эритроцита дифракционным методом необходимо провести сопоставительный анализ чувствительности данного метода к параметрам объекта, оказывающим влияние на регистрируемые параметры.
При использовании способов, основанных на измерении характерных размеров дифракционного распределения, для определения параметра объекта дифракции используется расстояние (угловое или линейное) между экстремальными точками. Чувствительность этого способа определяется соотношением приращения линейных (угловых) размеров дифракционных колец к изменению параметра, которое вызвало это приращение: S = , (5) где ф - угловой (линейный) размер дифракционных колец, h - характерный параметр эритроцита.
Так как в большинстве случаев зависимость углового размера дифракционного распределения от параметров эритроцитов является монотонной функцией, то диапазон контроля принципиально не ограничен и определяется только конкретной схемой измерения. Регистрируемый размер дифракционного распределения также не является линейной функцией измеряемого размера.
На практике чаще измерения проводят в фокальной плоскости объектива, и в качестве измеряемого размера используют линейный размер, соответствующий определенному числу дифракционных лепестков, однозначно связанный со средним размером дифрагирующих частиц. Также дифракционное распределение преобразовывается в электрический сигнал и для измерения используется временной интервал между экстремальными точками электрического сигнала. Так как скорость изменения временного интервала между экстремальными точками электрического сигнала в большинстве случаев соответствует скорости изменения искомого параметра эритроцита, то временной интервал будет определяться с той же точностью, что и искомый параметр эритроцита.
Часто для удобства аналитического расчета используют безразмерную величину относительной чувствительности S : S = . (6) dh ф Размер дифракционных колец зависит как от параметров объекта (размера, показателя преломления, функции распределения эритроцитов по размерам, формы клетки и т.д.), так и от параметров используемого источника излучения (длины волны излучения, плотности мощности излучения, времени излучения и т.д.). Так как измерение проводится при условии использования лазера с известными техническими характеристиками, то основными параметрами, оказывающими наибольшее влияние на размер дифракционных колец в процессе измерения, являются параметры эритроцита и, в частности, показатель преломления и диаметр. При использовании лазера с другой длиной волны или плотностью мощности чувствительность метода будет другой. Часто при проведении анализа чувствительности пользуются относительными параметрами эритроцита к длине волны излучения (напр., чувствительность к дифракционному отношению —) и проводят оценку спектральной d чувствительности.
Модель изменения показателя преломления эритроцита в гипоосмотической среде
Методика проведения эксперимента существенна для оценки точности измерения показателя преломления эритроцита, так как при проведении эксперимента могут возникать дополнительные погрешности.
Для измерения показателя преломления эритроцита нами использовалась венозная кровь человека, которую брали из локтевой вены с помощью инъекционной иглы в сухую центрифужную пробирку, при этом первые капли крови в момент ее взятия оставляли на тампоне для предотвращения попадания в пробирку тканевого тромбопластина, выделяющегося в момент прокола. В пробирку добавляли антикоагулянт (гепарин или цитрат натрия) для предотвращения свертывания крови. Под нашим наблюдением находился 35 больных ММ II и III стадии в возрасте 42-78 лет и с длительностью заболевания от 6 месяцев до 12 лет. Картина крови у больных ММ зависит от степени опухолевой инфильтрации костного мозга. У больных ММ II стадии средние показатели концентрации гемоглобина были умеренно понижены. Кроме того, у большинства больных в III стадии болезни дебютирует анемический синдром, что выражается в более выраженных пониженных значениях концентрации гемоглобина (менее 80 г/л, иногда доходил до 60 г/л). У всех больных был обнаружен высокий уровень общего белка в сыворотке крови (у преобладающего большинства более 90 г/л), а при электрофорезе - М-градиент (парапротеин). Концентрация патологического белка варьировала от 35 до 60 г/л. Диагноз ММ был подтвержден данными миелограммы (более 10% плазматических клеток), гистологического изучения трепаната подвздошной кости (миеломно-клеточные разрастания) и результатами рентгенографии костей скелета (остеопороз и очаги деструкции костной ткани в плоских костях). Все больные получали лечение по программам ПХТ [81]. Лечение осуществлялось на фоне лечебного плазмафереза, проводившегося методом центрифугирования крови в пластикатных контейнерах "Гемакон" (режим 3000 об/мин в течение 5 мин). Каждому пациенту проводилось 3 сеанса с изъятием за одну процедуру 600-1500 мл плазмы (за курс эвакуировалось от 1800 до 4500 мл плазмы). Общее количество удаляемого патологического белка равнялось 100 г. Плазмозамещение выполняли 5% раствором альбумина (100 мл) и реополиглюкином (400 мл) с дробной инфузией 2500-5000 ME гепарина (в зависимости от гемокоагуляционных нарушений, выявленных по данным биохимической коагулограммы) на 200,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Все больные находились на лечении в гематологической клинике Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Контрольную группу составили пять практически здоровых людей (доноры крови). Таким образом, всего было исследовано 35 образцов крови больных и 5 - доноров. Для исключения влияния на эритроциты веществ, находящихся в плазме, кровь подвергали центрифугированию со скоростью 5000 об/мин (1500 g). При такой скорости центрифугирования наблюдается наилучшее качество ДК, и полый гемолиз происходит достаточно медленно [69].
Полученный осадок помещали в физиологический раствор с концентрацией NaCl порядка 0,85% и еще один раз центрифугировали при тех же условиях с целью лучшего отмывания клеток от плазмы крови [84].
Обычно при работе с отмытыми эритроцитами используется физиологический раствор с концентрацией NaCl порядка 0,85%, который создает осмотическое давление на клетку, приблизительно равное тому, которое создает плазма крови (изотонический раствор). Na+ является основным осмотически активным ионом внеклеточного пространства. Концентрация ионов натрия в плазме крови приблизительно в 8 раз выше, чем в эритроцитах [6; 85]. Поэтому при уменьшении концентрации NaCl в растворе между клеткой и окружающей средой возникает градиент концентрации, и вода начинает проникать через мембрану внутрь эритроцита.
Растворы большинства чистых химических веществ имеют очень неустойчивый рН. Поэтому в тех случаях, когда надо работать в определенных интервалах рН, пользуются специальными буферными растворами, рН которых изменяется весьма несущественно. Особое значение имеют фосфорные ионы как источник неорганического фосфора в процессах фосфорилирования белковых компонентов мембран. По данным работы [86] даже незначительное снижение уровня фосфорилирования мембран сопровождается изменениями формы клеток и их механических свойств. Поэтому для стабилизации мембран эритроцитов мы добавляли в гипоосмотические суспензионные среды Na2HP04 в сочетании с NaH2P04 в конечной концентрации 0,01 М при рН=7,4 для более точных измерений зависимости размеров эритроцитов от осмотичности раствора.
Отмытые эритроциты помещали в гипоосмотические растворы (с концентрацией NaCl менее 0,85%), приготовленные путем разведения исходного изотонического раствора. Оптимальная концентрация эритроцитов порядка 0,03-0,04 мл осадка на 2 мл суспензии (раствора NaCl на фосфатном буфере) [69]. При такой концентрации качество ДК будет наилучшее. Оптимальное время для исследования осмотической резистентности и жесткости мембран эритроцитов наступает спустя 2 часа после приготовления суспензий [84; 67].
Далее выдержанные в гипоосмотических растворах эритроциты " помещали в камеру Горяева и наблюдали ДК, получаемую при прохождении лазерного излучения через образец крови. Для исследования суспензированных в растворах различной осмолярности эритроцитов методом лазерной дифрактометрии следует приготовить образец таким образом, чтобы оптическая толщина слоя была мала, что необходимо для обеспечения однократного рассеяния. Эритроциты на исследуемом образце должны иметь равномерное распределение по поверхности камеры Горяева, не должно наблюдаться областей перекрытия (эритроциты должны образовывать монослой), что позволяет не учитывать вклад переизлучения от областей перекрытия, и концентрация должна быть достаточна для наблюдения ДК высокой интенсивности. Эти условия соблюдаются при определенном соотношении объема эритроцитов и раствора.
Методика проведения эксперимента и обработки экспериментальных результатов
Обращал на себя внимание тот факт, что при анализе поля рассеяния с использованием одной длины волны была выявлена отрицательная корреляционная зависимость между жесткостью эритроцитарной мембраны и степенью изменения показателя преломления эритроцита при гипоосмотическом набухании. Это следует объяснить неспособностью эритроцита набухать в значительной степени за счет поступления воды при высокой жесткости. Плотность мощности лазерного излучения также влияет на изменение показателя преломления клетки и степень ее набухания (жесткость). Корреляция между жесткостью и степенью изменения показателя преломления эритроцита наблюдается только при определенных длинах волн и мощностях, и при анализе поля рассеяния на двух длинах волн она не была получена.
Процесс гипоосмотического набухания сферулированного эритроцита имеет скачкообразный характер, который можно наблюдать экспериментально [80]. Из рис. 31 и 36 видно, что "скачок" происходит примерно при концентрации NaCl 0,5%.
При исследовании процесса скачкообразного изменения диаметра сферулированного эритроцита образцы крови просматривались нами под микроскопом, определялся их средний размер и дисперсность по размерам, строилась кривая Прайс-Джонса.
Показатель преломления эритроцита определяется концентрацией его содержимого, то есть концентрацией гемоглобина. Считается, что в нормальном состоянии (изоосмотический раствор) в эритроците крови здорового человека содержится 27-31 пг гемоглобина, а для больных данная величина может быть несколько понижена [4]. При набухании эритроцита в гипотоническом растворе объем клетки увеличивается за счет поступления в нее воды, что приводит к уменьшению концентрации гемоглобина в эритроците и связанного с ней линейной зависимостью [15] показателя преломления клетки. При "скачке" показатель преломления эритроцита должен также изменяться скачкообразно. Однако, при таком изменении радиуса сферулированного эритроцита происходит смена дисперсности совокупности эритроцитов вследствие нарушения нормального состояния крови.
При исследовании скачкообразного характера процесса гипоосмотического набухания мы использовали кровь 35 больных ММ, находившихся на лечении в гематологической клинике Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии города Санкт-Петербурга, а также кровь 22 больных ДГПЖ. Больные с ДГПЖ находились на обследовании и лечении в урологическом отделении Дорожной клинической больницы города Санкт-Петербурга.
По результатам нашего исследования у больных с ДГПЖ жесткость эритроцитарной мембраны сравнительно низкая; гемолиз наблюдался при концентрациях 0,55- 0,45% NaCl и скачкообразный характер гипоосмотического набухания не наблюдался. Следовательно, показатель преломления сфероцита у больных с ДГПЖ не должен изменяться скачкообразным образом. На рис. 41-43 представлены типичные изменения среднего диаметра, показателя преломления и дисперсности совокупности эритроцитов у больного с ДГПЖ. Дисперсность определялась под микроскопом. Результаты получены путем использования дифракции излучения He-Ne-лазера. Показатель преломления рассчитывался, исходя из экспериментальных данных поля рассеяния для одной длины волны (Х,=0,63 мкм). В момент сферуляции (концентрация NaCl 0,65%) наблюдается увеличение дисперсности совокупности эритроцитов (рис. 43), что, по-видимому, вызвано первоначальным разбросом радиуса недеформированного эритроцита в изоосмотическом растворе (0,85% NaCl) и последующим увеличением ее величины по мере трансформации дискоцита в сферу [6]. Кроме того, на увеличение дисперсности в момент сферуляции влияет также и толщина (разброс по диаметру) эритроцита в недеформированном состоянии, что может приводить к разбросу момента сферуляции для различных клеток совокупности эритроцитов и, следовательно, вызывать увеличение дисперсности [6].
Наблюдаемое замедление скорости уменьшения показателя преломления эритроцита при концентрациях NaCl 0,7-0,6% (рис. 42) вероятно вызвано ошибкой измерения размера дифракционных колец, вносимой повышением дисперсности совокупности эритроцитов в момент сферуляции. Это предположение хорошо подтверждается при моделировании изменения показателя преломления эритроцита при различных дисперсностях.
Дисперсность совокупности эритроцитов у того же больного ДГПЖ дисперсностях. Построим график изменения размера ДК от концентрации NaCl в относительных единицах при наличии дисперсии совокупности эритроцитов 0% и 8% (рис. 44-45). Примем момент сферуляции эритроцита в точке 0,66% NaCl [76].
Проведенный анализ показал (рис. 44-45), что при набухании клетки (уменьшении концентрации NaCl) размер ДК уменьшается, причем увеличение жесткости приводит к уменьшению диапазона его изменения.
При повышенной жесткости эритроцитарной мембраны поверхностное напряжение достигает критической величины до момента наступления полного гемолиза, поэтому возможно наблюдение скачкообразного характера хода гипоосмотической кривой. Теоретический анализ влияния скачкообразного характера набухания сферулированного эритроцита на вид ДК был проведен с учетом корреляционной связи между жесткостью и относительной величиной скачка (0,9) [80], а также с учетом зависимости между жесткостью эритроцитарной мембраны и местоположением "скачка": при колебании величины жесткости эритроцитарной мембраны в пределах 0,7- 3 Н/м положение "скачка" на оси концентрации NaCl определяется в 0,15 % от точки сферуляции.
