Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1: Этиология и патофизиология рака предстательной железы 11
1.2. Прогностические факторы рака предстательной железы 14
1.3. Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы ... 17
1.3.1. Хромосомные перестройки 19
1.3.2. Потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность 24
1.3.3. Аномальное метилирование 27
1.3.4. Обнаружение опухольспецифичной ДНК в биологических жидкостях.. 32
1.4. Опухолевое микроокружение 35
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Клинический материал 44
2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала 44
2.3. Лазерная микродиссекция 44
2.4. Выделение геномной ДНК 45
2.5. Выделение РНК 46
2.6. Синтез кДНК 46
2.7. Полимеразно-цепная реакция для определения химерных генов 47
2. 8. Рестрикционный анализ 47
2. 9. Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР) 48
2. 10. Обработка ДНК бисульфитом натрия 49
2.11. Секвенирование 51
2.12. Микросателлитный анализ 52
2. 13. Электрофорез в ПААГ 53
2. 14. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра 53
2.15. Программное обеспечение 54
2.16. Статистическая обработка данных 54
Глава 3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Анализ хромосомных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV1 55
3.1.1. Анализ хромосомных перестроек в образцах ДГПЖ 55
3.1.2. Анализ хромосомных перестроек в образцах РПЖ 55
3.1.3. Клинические ассоциации перестройки TMPRSS2/ERG4 57
3.2.Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности...59
3.2.1. Анализ ПГ/МН в биоптатах РПЖ 60
3.2.2. Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах РПЖ 61
3.2.3. Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах ПИН 63
3.2.4. Ассоциации частот ПГ/МН с клиническими параметрами 64
3.3. Анализ аномального метилирования 64
3.3.1. Метилирование генов в микродиссекционных образцах 65
3.3.2. Метилирование генов в биопсийных и послеоперационных образцах. 68
3.3.3. Ассоциации частот метилирования исследуемых генов в
образцах биоптатов с клиническими параметрами 72
3.4. Анализ аномального метилирования в плазме крови пациентов с РПЖ...72
3.5. Анализ частоты генетических и эпигенетических нарушений в строме РПЖ 73
Заключение 80
Выводы 83
Список литературы 85
- Этиология и патофизиология рака предстательной железы
- Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы
- Забор крови, операционного и биопсийного материала
- Анализ хромосомных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV1
Введение к работе
Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста.
В настоящий момент основным диагностическим критерием РПЖ является патологоанатомическое исследование. Молекулярно-генетические же маркеры в клинической практике применяются в исключительных случаях или находятся в стадии научных разработок. В опухолевых тканях обнаруживается большое количество структурных перестроек, прежде всего транслокаций и делеций, количество которых заметно нарастает по мере прогрессирования злокачественного роста. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 с последующей гиперэкспрессией химерных онкогенов. Гомозиготные и гетерозиготные делеций, являются одними их самых частых генетических патологий РПЖ. Также одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза РПЖ является аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста. Учитывая, что молекулярные изменения являются наиболее ранними в канцерогенезе, применение подобных маркеров в клинике могло бы расширить возможности ранней диагностики и увеличить ее прогностический потенциал. Таким образом, приоритетным направлением в диагностике РПЖ является поиск и характеристика новых молекулярно-генетических маркеров с достаточной чувствительностью и специфичностью для применения в клинической практике.
За последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получено большое число убедительных данных, свидетельствующих о критической роли стромы в канцерогенезе. Опухолевая прогрессия зависит не только от молекулярных изменений эпителиальных клеток, но и от многочисленных изменений смежной стромы, обеспечивающей необходимое окружение для пролиферации, миграции, инвазии опухолевого эпителия в процессе неопластического роста. Изменения, происходящие в строме, включают изменения в профиле экспрессии ростовых факторов, цитокинов, преобразования в цитоскелете фибробластов и экстрацеллюлярном матриксе. Показано, что микроокружение способно стимулировать опухолевый рост эпителия, но и сама строма подвергается значительной модификации: изменению профиля экспрессии белков и различным генетическим перестройкам. Молекулярные повреждения генома стромальных клеток, такие как гиперметилирование генов-супрессоров, изменение длины теломер, потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МН) на различных хромосомах, мутации, имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия. Однако сведения об эпигенетических и генетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения для идентификации новых маркеров, терапевтических мишеней и понимания механизмов возникновения опухоли в целом.
Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и ее микроокружении, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров РПЖ.
Цель работы — изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих на разных этапах канцерогенеза РПЖ в ткани опухоли, в опухолевом эпителии и смежной с ним строме.
Задачи исследования.
1. Определить частоту химерных онкогенов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в ткани РПЖ и оценить их диагностическую значимость.
2. Оценить частоту ПГ/МН локусов 8р22, 13ql4 и 16q23 в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, а также при предраковых состояниях ПИН.
3. Охарактеризовать частоту метилирования генов Р16, ШС1, N33 и GSTP1 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Провести сравнение частот метилирования изученных генов в микродиссекционных и биопсийньгх образцах предстательной железы.
4. Провести сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме.
5. Выявить возможные ассоциации между изученными генетическими и эпигенетическими изменениями и клиническими параметрами РПЖ.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования изучены генетические и эпигенетические изменения РПЖ на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез с применением метода лазерной микродиссекции. Впервые охарактеризованы молекулярно-генетические изменения стромального опухолевого микроокружения. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме намного превышает таковую в эпителии.
Впервые на российской выборке охарактеризована частота химерных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 и показана специфичность этих нарушений для РПЖ.
Практическая значимость.
Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения РПЖ. В работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверное различие по частотам образования химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РГОК.
В результате исследования обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 обнаружены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 обнаружено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Обнаруженные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.
Полученные результаты могут служить для разработки диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений, что позволит проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять риск метастазирования в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.
Апробация работы.
Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2008 г.г., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г., на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2006-2007 г., на I и II онкоурологических конгрессах в 2006-2007 г.
Работа удостоена золотой медали Российской академии медицинских наук на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 году. Работа заняла 1 место в конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) в номинации «медицинская наука» в 2007 г.
По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 тезисов и 2 медицинских технологии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Экспрессия TMPRSS2/ERG4 является частым, специфическим для РПЖ, событием и может быть использована как маркер РПЖ, а также маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию.
2. Высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам и метилирования изученных генов характерна как для эпителия РПЖ, так и для смежной с ним стромы. На ранних этапах канцерогенеза аллельные нарушения в строме преобладают над таковыми в эпителии.
3. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны.
4. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса 16q23 и метилирование генов GSTP1 и N33 ассоциированы с прогресией РПЖ и могут использоваться в качестве диагностических маркеров.
Этиология и патофизиология рака предстательной железы
Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин (Jemal et al., 2006), которому с каждым годом уделяется все больше внимания. Это обусловлено тем, что быстрыми темпами увеличивается заболеваемость, особенно у мужчин пожилого возраста. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран рак предстательной железы выходит на 2-3 место после рака легких и желудка, а в США - на первое место. Если принять во внимание, что в экономически развитых странах продолжительность жизни увеличивается и имеется общемировая тенденция к старению населения, соответственно вырастает и заболеваемость. Вместе с тем смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. По результатам аутопсий обнаруживается значительное число клинически недиагностированных патологических изменений предстательной железы (ПЖ). В США, клинически неопределяемые очаги злокачественного перерождения ПЖ выявляются у 15-30% мужчин старше 50 лет и у 80% мужчин старше 80 лет (Хансон и др., 2001). Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста (Хансон и др., 2001).
В этиологии рака предстательной железы большую роль играют многие факторы -возраст больного, гормональный статус организма, диета, половое поведение, факторы внешней среды и генетические особенности, что, возможно, лежит в основе различий в уровне заболеваемости в различных странах и регионах. Эпидемиологические исследования показывают, что уровень заболеваемости в отдельных странах существенно различается. Самая высокая заболеваемость РПЖ описана в популяции афроамериканцев США (116 на 100000 человек в год), в то время как среди белых мужчин она составляет 71 на 100000 человек в год. Средняя заболеваемость характерна для Южной Америки и европейских стран, а наиболее низкая заболеваемость РПЖ регистрируется в Японии, Китае и Индии (Watanabe et al., 2000). Возраст - это один из главных факторов, оказывающих большое влияние на развитие рака предстательной железы. Общеизвестно, что заболевание с клиническими проявлениями редко возникает у мужчин до 50 лет, и вместе с увеличением возраста резко возрастает заболеваемость. При тщательном микроскопическом изучении предстательной железы мужчин, умерших не от рака в возрасте старше 50 лет, в 40% случаев были выявлены очаги злокачественных новообразований и в 90% случаев эти очаги присутствовали в железе у мужчин в возрасте от 85 до 90 лет. Следует иметь в виду, что длительность латентного периода от начала развития рака предстательной железы до клинических его проявлений может исчисляться месяцами, а иногда и годами.
Предраковые изменения наблюдаются значительно чаще (примерно у 1 из 3 мужчин), чем РПЖ (у 1 из 9 мужчин). Следовательно, морфологические изменения, свидетельствующие об инициации, проявляются в молодом возрасте, а прогрессия в стадию инвазивной карциномы наступает значительно позже, и далеко не у всех индивидуумов. Возможным предшественником инвазивного РПЖ является простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН), которую разделяют на ПИН высокой степени и ПИН низкой степени. ПИН имеет много общих иммунофенотипических и цитологических черт с карциномой (исчезновение виментина, коллагена IV типа, экспрессия коллагеназы IV типа, c-erbB2, bcl 2, мутации р53 и RB, увеличение содержания металлопротеиназы и матрилизина, увеличение числа митозов, пролиферативных маркеров - PCNA, Ki 67, МІВ 1, увеличение ангиогенеза, изменения морфологии клеточных ядер, высокая частота анеуплоидии, хромосомных нарушений) (Пожарисский и др., 2001). Кроме того, изменения ПИН преимущественно локализованы в периферической зоне ПЖ, где в 70% случаев также развивается РПЖ. Приблизительно у 50% больных с высокой степенью ПИН без сопутствующей карциномы при игольной биопсии рак обнаруживается при последующих биопсиях. Вышеприведенные сведения показывают тесное взаимоотношение между этими двумя состояниями, но окончательно не доказывают, что высокая степень ПИН является предшественником развития рака. Высказывается мнение, что они оба вызываются одними этиологическими факторами, но наличие ПИН недостаточно и необязательно для возникновения карциномы.
Доброкачественная гиперплазия ПЖ (ДГПЖ) локализована премущественно в центральной зоне ПЖ и не является пренеопластическим изменением. Рис.1. Схематическое изображение различных степеней простатической интраэпителиальной неоилазии (PIN) и ее предполагаемой связи с развитием аденокарциномы. Международная классификация рака предстательной железы по системе TNM (1997 год).
По системе TNM различают четыре стадии местного распространения опухоли - от ТІ (случайная находка) до Т4 (прорастание в соседние органы).
Стадия ТІ означает заболевание, случайно выявленное после трансуретральной резекции предстательной железы (вследствие других заболеваний) или определения уровней ПСА, которое не обнаруживается при пальпации и УЗИ. Рак стадии Т1а - это небольшая высокодифференцироваиная опухоль, занимающая менее 5% резецированной ткани. Рак предстательной железы стадии Tib - это более крупная опухоль, занимающая более 5% резекционной ткани и менее дифференцированная. Tic - непальпируемый рак предстательной железы, который выявляется при биопсии под контролем трансректального УЗИ. При стадии Т2 опухоль ограничена предстательной железой, причем поражение одной доли означает стадию Т2а, двух долей - Т2Ь. Экстракапсулярное распространение опухоли свидетельствует о стадии ТЗа, переход опухоли на семенные пузырьки - о стадии ТЗЬ. Стадия Т4 - опухоль прорастает в соседние органы (рис. 2).
Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы
Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин (Jemal et al., 2006), которому с каждым годом уделяется все больше внимания. Это обусловлено тем, что быстрыми темпами увеличивается заболеваемость, особенно у мужчин пожилого возраста. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран рак предстательной железы выходит на 2-3 место после рака легких и желудка, а в США - на первое место. Если принять во внимание, что в экономически развитых странах продолжительность жизни увеличивается и имеется общемировая тенденция к старению населения, соответственно вырастает и заболеваемость. Вместе с тем смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. По результатам аутопсий обнаруживается значительное число клинически недиагностированных патологических изменений предстательной железы (ПЖ). В США, клинически неопределяемые очаги злокачественного перерождения ПЖ выявляются у 15-30% мужчин старше 50 лет и у 80% мужчин старше 80 лет (Хансон и др., 2001). Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста (Хансон и др., 2001).
В этиологии рака предстательной железы большую роль играют многие факторы -возраст больного, гормональный статус организма, диета, половое поведение, факторы внешней среды и генетические особенности, что, возможно, лежит в основе различий в уровне заболеваемости в различных странах и регионах. Эпидемиологические исследования показывают, что уровень заболеваемости в отдельных странах существенно различается. Самая высокая заболеваемость РПЖ описана в популяции афроамериканцев США (116 на 100000 человек в год), в то время как среди белых мужчин она составляет 71 на 100000 человек в год. Средняя заболеваемость характерна для Южной Америки и европейских стран, а наиболее низкая заболеваемость РПЖ регистрируется в Японии, Китае и Индии (Watanabe et al., 2000). Возраст - это один из главных факторов, оказывающих большое влияние на развитие рака предстательной железы. Общеизвестно, что заболевание с клиническими проявлениями редко возникает у мужчин до 50 лет, и вместе с увеличением возраста резко возрастает заболеваемость. При тщательном микроскопическом изучении предстательной железы мужчин, умерших не от рака в возрасте старше 50 лет, в 40% случаев были выявлены очаги злокачественных новообразований и в 90% случаев эти очаги присутствовали в железе у мужчин в возрасте от 85 до 90 лет. Следует иметь в виду, что длительность латентного периода от начала развития рака предстательной железы до клинических его проявлений может исчисляться месяцами, а иногда и годами.
Предраковые изменения наблюдаются значительно чаще (примерно у 1 из 3 мужчин), чем РПЖ (у 1 из 9 мужчин). Следовательно, морфологические изменения, свидетельствующие об инициации, проявляются в молодом возрасте, а прогрессия в стадию инвазивной карциномы наступает значительно позже, и далеко не у всех индивидуумов. Возможным предшественником инвазивного РПЖ является простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН), которую разделяют на ПИН высокой степени и ПИН низкой степени. ПИН имеет много общих иммунофенотипических и цитологических черт с карциномой (исчезновение виментина, коллагена IV типа, экспрессия коллагеназы IV типа, c-erbB2, bcl 2, мутации р53 и RB, увеличение содержания металлопротеиназы и матрилизина, увеличение числа митозов, пролиферативных маркеров - PCNA, Ki 67, МІВ 1, увеличение ангиогенеза, изменения морфологии клеточных ядер, высокая частота анеуплоидии, хромосомных нарушений) (Пожарисский и др., 2001). Кроме того, изменения ПИН преимущественно локализованы в периферической зоне ПЖ, где в 70% случаев также развивается РПЖ. Приблизительно у 50% больных с высокой степенью ПИН без сопутствующей карциномы при игольной биопсии рак обнаруживается при последующих биопсиях. Вышеприведенные сведения показывают тесное взаимоотношение между этими двумя состояниями, но окончательно не доказывают, что высокая степень ПИН является предшественником развития рака. Высказывается мнение, что они оба вызываются одними этиологическими факторами, но наличие ПИН недостаточно и необязательно для возникновения карциномы.
Доброкачественная гиперплазия ПЖ (ДГПЖ) локализована премущественно в центральной зоне ПЖ и не является пренеопластическим изменением. Рис.1. Схематическое изображение различных степеней простатической интраэпителиальной неоилазии (PIN) и ее предполагаемой связи с развитием аденокарциномы. Международная классификация рака предстательной железы по системе TNM (1997 год).
По системе TNM различают четыре стадии местного распространения опухоли - от ТІ (случайная находка) до Т4 (прорастание в соседние органы).
Стадия ТІ означает заболевание, случайно выявленное после трансуретральной резекции предстательной железы (вследствие других заболеваний) или определения уровней ПСА, которое не обнаруживается при пальпации и УЗИ. Рак стадии Т1а - это небольшая высокодифференцироваиная опухоль, занимающая менее 5% резецированной ткани. Рак предстательной железы стадии Tib - это более крупная опухоль, занимающая более 5% резекционной ткани и менее дифференцированная. Tic - непальпируемый рак предстательной железы, который выявляется при биопсии под контролем трансректального УЗИ. При стадии Т2 опухоль ограничена предстательной железой, причем поражение одной доли означает стадию Т2а, двух долей - Т2Ь. Экстракапсулярное распространение опухоли свидетельствует о стадии ТЗа, переход опухоли на семенные пузырьки - о стадии ТЗЬ. Стадия Т4 - опухоль прорастает в соседние органы (рис. 2).
Забор крови, операционного и биопсийного материала
Микродиссекция выполнялась на 5 р.т срезах, фиксированных формалином и окрашенных гематоксилином-эозином, с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Под контролем патолога материал железистых структур, содержащий более 80% исследуемых неопластических клеток (аденокарциномы, ПИН, а также близлежащей стромы), вырезали лазером со срезов и собирали в отдельные пробирки. Клетки, полученные с помощью микродиссекции, растворяли в буфере следующего состава: ЮмМ трис-HCl рН 8,0, 0.1ЭДТА, 1% Tween 20, 2 мг/мл протеиназы К. Инкубировали ночь при 55С.
Для получения ДНК из лимфоцитов периферической крови и ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК (Sambrook et al. 1989): 1. Ткань опухоли отмывали 1ml PBS, измельчали глазными ножницами и затем гомогенизировали, растирая со стеклом. 2. Гомогенизат или клетки крови переносили в пробирку и добавляли экстракционный буфер (ЮмМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 4мМ NaCl, рН=8,0). 3. Добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0.5 %. Образец тщательно перемешивали. 4. Инкубировали 2 часа при 37С. 5. Доводили объем образца до 5 мл раствором ТЕ, рН 8.0 и последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом. 6. К образцу добавляли 1/10 объема 5М ацетата натрия, рН 5,3, перемешивали и осаждали ДНК 2,5 объемами холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин. при температуре - 70С. 7. Пробу центрифугировали при 0С 15 мин. с ускорением 12000g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8.0.
Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 мл крови или 1г ткани. После полного растворения ДНК, измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы "Hoefer" и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм 0.5, 260 нм /280 нм 1.8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.
Выделение РНК проводили методом кислофенольной экстракции с использованием набора "РИБО-золь-А" (фирма АмплиСенс, Россия) по следующему протоколу:
1. Образец ткани гомогенизировали в 100 мкл рибозоля.
2. В пробирку, содержащую 650 мкл рибозоля, добавляли гомогенизат, перемешивали на вортексе и инкубировали в термостате при 60С 5 минут. Затем перемешивали и центрифугировали при 5 тыс. об./мин. в течение 5 секунд.
3. В пробирки добавляли по ПО мкл смеси хлороформ:изоамил, перемешивали в течение 1 минуты и оставляли на 5 минут при 2-8 С.
4. Пробирки центрифугировали 10 минут при 12-14 тыс. об./мин., водную фазу отбирали в чистую пробирку и добавляли к ней равный объем изопропапола, перемешивали и оставляли на 20 минут при -20 С.
5. Пробирки центрифугировали 10 минут при 12-14 тыс. об./мин. Супернатант отбирали и добавляли к осадку 1мл 70% этанола, перемешивали и снова цетрифугировали.
6. Супернатант отбирали и помещали пробирки в термостат при 60 С на 5 минут для подсушивания осадка. Осадок, содержащий очищенную РНК, растворяли в 50 мкл РНК-элюента. Готовые образцы РНК хранили при температуре -70 С.
Анализ хромосомных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV1
Образцы ткани предстательной железы были получены от 66 пациентов с диагнозом РПЖ, подвергшихся радикальной простатэктомии. Частота перестройки TMPRSS2/ERG4 составила 50% (33/66) (рис.14). Подлинность химерного гена TMPRSS2/ERG4 подтверждена секвенированием исследуемого фрагмента кДНК (рис.15).
По данным литературы частота встречаемости данной перестройки при РПЖ составляет 60-78% по результатам fish-гибридизации (Mosquera et al., 2007; Perner et al., 2006; Soller et al, 2006) и 36-59% по результатам ОТ-ПЦР (Tomlins et al., 2005; .Wang et al., 2006; Iljin et al., 2006). Основным механизмом образования TMPRSS2/ERG4 являются различные варианты делеций локуса 21q22 . I TMPRSS2/ERG4 — ш B2M 1 2 3 4 5 К Рис.14. Анализ экспрессии TMPRSS2/ERG4 в образцах РПЖ. М-маркер молекулярного веса, К - отрицательный контроль, дорожки 2, 3, 4, 5 — наличие химерного транскрипта, дорожки 1, 2, 3,4, 5 - наличие транскрипта В2М.
При исследовании наших пациентов мы не обнаружили химерных генов TMPRSS2/ETVI и TMPRSS2/ETV4 в образцах РПЖ, т.к. по данным литературы частота TMPRSS2/ETV1 не превышает 2% (Iljin et al., 2006; Hermans et al., 2006; Tomlins et al., 2007; Mehra el al., 2007), а частота TMPRSS2/ETV4 составляет не более 1% (Tomlins et al., 2006; Iljin et a!., 2006). Вероятно, размер нашей выборки не позволил выявить данные минорные перестройки, которые, однако, хотя и не могут применяться в качестве маркеров, объясняют механизмы гиперэкспресии онкогенов при РПЖ.
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что перестройка TMPRSS2/ERG4 является одним из самых частых молекулярных изменений, описанных для РПЖ. Действительно, по данным, полученным в результате анализа экспрессионных чипов фактор транкрипции ERG4 гиперэкспрессируется намного чаще остальных факторов ETS (Iljin et al., 2006), что характерно для клинически распространенного РПЖ. Данные количественной ОТ-ПЦР показывают, что в некоторых клеточных линиях РПЖ экспрессия ERG увеличивается по сравнению с нормой до 6000 раз (Mertz et al., 2007). Хотя экспрессия андрогенового рецептора при гормоннезавимом РПЖ остается, связи между уровнем экспрессии ERG и AR не обнаружено. В работе Tomlins (2007) анализ экспрессии на чипах при различных стадиях РПЖ показал, что экспрессия генов андрогеновых сигнальных путей увеличена в ПИН по сравнению с гиперплазией и уменьшена на стадии I-II по сравнению с ПИН. По мере прогрессирования РПЖ происходит дальнейшее подавление экспрессии этих сигнальных путей, и в гормоннезависимом раке она минимальна. Stanbrough с соавт. (2006) получил схожие результаты, показав при этом, что опухолевые клетки имеют большинство транскриптов этих генов. Показано, что андрогенчувствительные клеточные линии экспрессируют химерный ген, а андрогенрезистентные ксенографты имеют данную перестройку, но не экспрессируют его, увеличивая экспрессию других факторов ETS - ETV4 и FLI1 (Hermans et al., 2006). Возможно, на стадии гормонрезистентного РПЖ активаторами для факторов транкрипции становятся другие андрогеннечувствительные промоторные и энхансерные элементы.
Для анализа клинических ассоциаций перестройки TMPRSS2/ERG4 с прогрессией РПЖ, были выбраны следующие критерии: степень дифференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие гормонального лечения перед пр о статэктомией.
Гормональная депривация приводит к блокированию андрогеновой регуляции гормонзависимых опухолевых клеток и прекращению их пролиферации. При делении пациентов на 2 группы, проходящих гормональное лечение и не проходящих, мы предположили, что после лечения в ткани РПЖ не должно быть гормончувствительных опухолевых клеток, экспрессирующих TMPRSS2/ERG4. Действительно, частота перестройки у пациентов без гормонального лечения составила 56% (25/45), а после него - 17% (2/12), что статистически достоверно различается (р=0.023). К сожалению, в нашей выборке не было гормоннезависимых опухолей, чтобы оценить частоту TMPRSS2/ERG4 в ткани андрогенрезистентных опухолевых клеток.
Также нами обнаружено достоверное различие в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ГОК, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь. В группе пациентов с локализацией РПЖ в одной доле химерных перестроек не обнаружено 0/10, у пациентов с поражением обеих долей - 48% (14/27),/ =0,005. В целом, частота химерного гена увеличивается с прогрессированием заболевания (табл. 13). Также как и в других работах (Perner et al., 2006, Wang et al., 2006, Demichelis et al., 2007, Mosquera et al., 2007) мы не обнаружили достоверных ассоциаций между наличием химерного транскрипта и степенью дифференцировки опухоли по Глисону. Mosquera с соавт. однако нашли ассоциации с другими морфологическими параметрами - макроядрами, внутрипротоковым опухолевым ростом. По литературным данным химерный транскрипт TMPRSS2/ERG4 ассоциирован с инвазией в семенные пузырьки, ранним рецидивом, агрессивным течением (Wang et al., 2006), поздними стадиями заболевания и метастазированием (Perner et al., 2006) и с летальным исходом вследствие РПЖ (Demichelis et al., 2007).
![Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс]](/i/i/4431/177751.png "Роль СВЧ-гипертермии в паллиативном лечении больных раком предстательной железы и рецидивами рака мочевого пузыря [Электронный ресурс] Козлов Андрей Александрович")
![Сравнение двух режимов химиотерапии в лечении гормонорезистентного рака предстательной железы [Электронный ресурс]](/i/i/4480/179272.png "Сравнение двух режимов химиотерапии в лечении гормонорезистентного рака предстательной железы [Электронный ресурс] Бирюков Виталий Александрович")
![Клиническое течение и отдаленные результаты хирургического лечения рака щитовидной железы у детей и подростков [Электронный ресурс]](/i/i/4276/176336.png "Клиническое течение и отдаленные результаты хирургического лечения рака щитовидной железы у детей и подростков [Электронный ресурс] Осипов Сергей Викторович")