Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Теоретические основы создания корпускулярных магнитоуправляемых сорбентов 12
1.2. Применение метода иммуномагнитной сепарации в научно-исследовательской и клинической практике 22
1.2.1. Выделение субпопуляций лимфоцитов и других видов клеток для последующего изучения их морфологии и функций в культурах in vitro
1.2.2. Иммуномагнитная селекция минорных клеточных популяций 28
1.2.3. Комбинирование иммуномагнитной сепарации с другими методами молекулярной и клеточной биологии ... 28
1.2.3.1. ИМС как дополнение иммунофлуоресцентного метода 29
1.2.3.2. Иммуномагнитная сепарация образцов для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции и другими методами молекулярной генетики 30
1.2.3.3. Новый ускоренный метод селекции и клонирования гибридом-продуцентов моноклоналъных антител с исполъзовнием иммуномагнитных сорбентов
1.2.4. Иммуномагнитные сорбенты в онкологии 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Синтез магнитных полистироловых микросфер (МПМ) 43
2.1.1. Получение коллоида магнетита 43
2.1.2. Получение магнитных микросфер на основе мономеров и магнетита 43
2.1.3. Получение магнитных микросфер с поверхностными карбоксильными группами на основе мономеров, сополимера (малеинового ангидрида) и магнетита 43
2.2. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер 45
2.2.1. Измерение магнитных свойств МПМ 45
2.2.2. Структурный анализ МПМ на основе мономеров и магнетита методом инфракрасной спектроскопии 46
2.2.3. Определение диаметров и характера распределения МПМ по размерам 47
2.3. Получение иммуномагнитных коньюгатов 49
2.3.1. Получение препаратов очищенных моноклональных антител (МКА) 49
2.3.1.1. Выделение иммуноглобулинов путем осаждения сульфатом аммония 49
2.3.1.2. Выделение иммуноглобулинов методом аффинной хроматографии на колонке с протеином А на сефарозе CL-4B 50
2.3.2. Активирование поверхностных гидроксильных групп МПМ/7-Ts-Cl 50
2.3.3. Конъюгирование иммуноглобулинов с МПМ 52
2.3.3.1. Получение иммуномагнитных коньюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания после активацииp-Ts-Cl 52
2.3.3.2. Получение иммуномагнитных коньюгатов МКА с карбоксилированными магнитными микросферами 53
2.3.3.3. Количественное определение содержания МКА в растворах методом простой радиальной иммунодиффузии 53
2.3.4. Иммуномагнитная сепарация 54
2.3.4.1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови 54
2.3.4.2. Иммунофлуоресцентный анализ 55
Непрямой метод иммуноресцентного анализа 55
Прямой метод иммуноресцентного анализа 56
2.3.4.3. Иммуномагнитная селекция клеток 57
2.3.4.4. Оценка выживаемости клеток после обработки разными концентрациями химопапаина с помощью МТТ-теста 57
Проведение исследования 58
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер 59
3.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов 69
3.2.1. Оптимизация условий ковалентного связывания IgG с магнитными микросферами, активированными TsCl 70
3.2.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом иммобилизации моноклональных антител 74
3.2.3. Создание иммуномагнитных сорбентов путем ковалентного связывания 77 МКА с магнитными микросферами, активированными p-TsCl
3.3. Иммуномагнитная сепарация гемопоэтических клеток человека 85
3.3.1. Оценка влияния сорбционной емкости иммуномагнитных конъюгатов на эффективность селекции клеток 85
3.3.1.1. Негативная селекция Т-лимфоцитов 85
3.3.1.2. Негативная селекция В-лимфоцитов 90
3.3.2. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом связывания МКА 94
3.3.3. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, полученных путем ковалентного связывания МКА с магнитными микросферами, активированнымиp-Ts-Cl.. 101
3.3.4. Ферментативное отщепление клеток позитивной фракции от частиц сорбента 111
Выводы 118
Список литературы 120
- Применение метода иммуномагнитной сепарации в научно-исследовательской и клинической практике
- Иммуномагнитная сепарация образцов для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции и другими методами молекулярной генетики
- Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер
- Негативная селекция Т-лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность
Одним из направлений повышения эффективности терапии злокачественных новообразований является поиск путей преодоления побочных эффектов, связанных с отсутствием строгой избирательности действия противоопухолевых препаратов. Использование этих препаратов в высоких дозах не только позволяет остановить прогрессию опухоли, но и вызывает значительную регрессию новообразования, а также предотвращает возможность развития рецидивов заболевания. Однако цитотоксичность, которая обуславливает противоопухолевое действие подавляющего большинства химиотерапевтических средств, применяемых в онкологии, одновременно является и основным ограничением их применения. Терапия мощными цитостатиками не может проходить бесследно для нормальных клеток организма. Наиболее серьезные осложнения связаны с гибелью стволовых гемопоэтических клеток костного мозга, приводящей к нарушению естественных процессов обновления крови, анемии, прогрессирующей потере иммунитета.
Эффективным подходом к преодолению данного естественного ограничения терапии цитотоксическими агентами является трансплантация аллогенных или аутологичных клеток периферической крови или костного мозга. При этом, однако, проведению аутологичной трансплантации, вследствие высокой вероятности наличия в костном мозге и кровотоке опухолевых клеток, сопутствует риск рецидивов основного заболевания. Пересадка аллогенных гемопоэтических клеток может сопровождаться развитием реакции «трансплантат-против-хозяина» (РТПХ).
Одно из возможных решений перечисленных проблем заключается в предварительной сепарация трансплантатов, целью которой может являться
удаление нежелательных клеток (опухолевых, аллореактивных) или выделение из исходно гетерогенного материала определенных типов клеток.
Среди многочисленных методов направленного разделения клеток наиболее эффективным является иммуномагнитная сепарация (ИМС). Этот подход основан на одновременном использовании строгой избирательности взаимодействия моноклональных антител с антигенными детерминантами клеток-мишеней и магнитоуправляемости корпускулярных носителей -магнитных микросфер.
От других способов селекции биологического материала технологию ИМС выгодно отличает уникальное сочетание специфичности и чувствительности с высокой скоростью разделения исходных клеток. Эти качества обеспечивают преимущественное использование именно иммуномагнитной сепарации для предтрансплантационной обработки гемопоэтических клеток.
Данные научных исследований и результаты клинических испытаний, проведенных за рубежом, свидетельствуют об эффективности использования позитивной иммуномагнитной селекции при изоляции стволовых кроветворных клеток для дальнейшего культивирования и манипуляций in vitro и, что особенно важно, для дальнейшей трансплантации онкологическим больным. Магнитоуправляемые сорбенты широко используются для полной или частичной деплеции Т-лимфоцитов из костного мозга и периферической крови доноров, а также для удаления опухолевых клеток из аутологичных трансплантатов. Вместе с тем, на сегодняшний день нет единого мнения относительно характеристик сорбента, сепарирующих устройств и условий осуществления селекции. Хотя преимущества метода ИМС делают его использование наиболее предпочтительным, прочное внедрение метода в научно-исследовательскую и клиническую практику все еще требует решения ряда вопросов. Дальнейшее развитие и широкое использование этого перспективного
подхода в нашей стране ограничивается высокой стоимостью расходных материалов и сепарирующих устройств зарубежных фирм-производителей. Таким образом, создание на основе отечественных материалов и оборудования системы иммуномагнитной сепарации и внедрение ее в практику являются очень актуальными задачами.
Цель исследования
Целью данного исследования явилось создание системы иммуномагнитной сепарации, обеспечивающей возможность эффективного разделения гемопоэтических клеток человека.
Задачи исследования
Разработать комплекс аналитических методов исследования и стандартизации магнитных микроносителей и иммуномагнитных сорбентов.
Получить опытную партию магнетитовых полистироловых микросфер (МПМ) и охарактеризовать их физико-химические свойства.
Выявить оптимальную технологию создания иммуномагнитных сорбентов на основе синтезированных микроносителей и моноклональных антител.
Создать панель иммуноспецифических магнитоуправляемых конъюгатов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека.
Оценить эффективность селекции гемопоэтических клеток человека с использованием полученных конъюгатов.
Научная новизна
Получены экспериментальные подтверждения соответствия магнитных свойств синтезированных магнетитовых полистироловых микросфер всем требованиям, предъявляемым к магнитоуправляемым микроносителям для создания биомагнитных сорбентов.
Выявлены оптимальные условия иммобилизации векторных молекул на поверхности магнитных микросфер. Продемонстрирована возможность получения иммуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания моноклональных антител с магнитным носителем.
Показано, что наиболее оптимальным подходом к созданию иммуномагнитных конъюгатов является ковалентное присоединение моноклональных антител к поверхностным гидроксильным группам, активированным избытком р-толуолсульфонилхлорида.
Получены иммуномагнитные сорбенты на основе магнитных микроносителей и моноклональных антител против мембранных антигенов лимфоцитов человека CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34. Экспериментально показано, что использование созданных конъюгатов обеспечивает высокую эффективность иммуномагнитного разделения гемопоэтических клеток человека.
Разработан комплекс физико-химических методов, адаптированных в соответствии с особенностями используемого материала, который позволяет осуществлять качественный и
количественный контроль за свойствами иммуномагнитных конъюгатов на каждом этапе получения.
Научно-практическая значимость
Предполагаемое клиническое применение полученных сорбентов, в первую очередь, связано с сепарацией клеток костного мозга, предназначенного для трансплантации онкологическим больным.
Экспериментально показанная эффективность сепарации CD34+-клеток с помощью МПМ-ІСО-115 открывает перспективу дальнейшего применения этого конъюгата для получения чистых популяций стволовых кроветворных клеток методом позитивной селекции. Негативная иммуномагнитная селекция с использованием ИМС на основе МКА ICO-90, ICO-31, ICO-86 и ICO-180 может быть использована для элиминации опухолевых клеток из костного мозга больных Т- и В-клеточными лимфомами перед аутологичной трансплантацией. Иммуномагнитное истощение Т-клеточной популяции донорского костного мозга может стать способом предотвращения развития реакции "трансплантат-против-хозяина". Созданные сорбенты могут использоваться и при получении дендритных клеток для создания противоопухолевых вакцин.
Предлагаемый комплекс аналитических методов, модифицированных с учетом специфики исследуемого материала, и определенные оптимальные физико-химические критерии могут стать основой для стандартизации биомагнитных сорбентов.
Применение метода иммуномагнитной сепарации в научно-исследовательской и клинической практике
Возможность получения чистых клеточных популяций из различных тканей и смешанных культур позволяет исследователям непосредственно изучать морфологию, функции, динамику жизнедеятельности тех или иных клеток, а также межклеточные взаимодействия.
Многочисленные литературные данные свидетельствуют об эффективности иммуномагнитной селекции форменных элементов крови: эозинофилов [82], базофилов [97], нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитов и мегакариоцитов разных стадий дифференцировки [81]. Метод хорошо зарекомендовал себя при изоляции для последующего культивирования и изучения эндотелиальных клеток [30; 36], глиальных элементов [107]. Авторами особо отмечено сохранение жизнеспособности и функциональной активности выделяемого материала. Так, например, исследования последовательных изменений в антигенном составе клеточной мембраны при созревании тимоцитов и влияния факторов микроокружения на дифференцировку Т-клеток существенно осложнялись невозможностью получения чистых популяций ранних Т-лимфоцитов и составляющих стромы тимуса: кортикальных и медуллярных эпителиальных клеток и мезенхимных клеток. Данная проблема была успешно решена G. Anderson и соавт. (1993), разработавшими метод получения реаггрегированных культур клеток тимуса, включающий иммуномагнитное разделение исходного материала. Суспензию клеток тимуса, освобожденную от МНСП+-дендритных клеток и лимфоцитов, подвергали трехкратному иммуномагнитному истощению по мембранному антигену CD45 для удаления остаточных лимфоидных элементов. Из оставшейся клеточной популяции, также методом негативной ИМС, элиминировали МНСИ-положительные клетки. Полученная на этом этапе фракция представляла собой чистую популяцию медуллярных элементов - эпителиальных клеток с фенотипом А2В5+. Для выделения клеток кортикального эпителия, экспрессирующих на поверхности комплекс гистосовместимости второго класса, с помощью негативной селекции последовательно удаляли CD45- и А2В5-положительные клетки. Далее осуществляли позитивную сепарацию по антигену МНСП. Комплексы клеток с микросферами, выделенные на последнем этапе этой многостадийной процедуры, инкубировали в растворе проназы с целью отщепления магнитных микрочастиц. Ранние тимоциты изолировали непосредственно из суспензии клеток эмбрионального тимуса прямым иммуномагнитным обогащением по мембранному антигену CD45. Как показал иммунофлуоресцентный анализ, полученная популяция более чем на 97 % состояла из CD45+CD4 CD8_TCRloieTOK. Впоследствии описанная методика разделения стромальных элементов и выделения Т-клеток была использована теми же авторами при создании модели для изучения в системе in vitro созревания промежуточных тимоцитов, характеризующихся фенотипом CD4+CD8+TCR [12]. Т-клетки, находящиеся на этой стадии дифференцировки, были выделены из тканей эмбриональных тимусов с помощью селекции по мембранному антигену CD8. Полученная позитивная фракция на 98 % состояла из клеток с требуемым фенотипом.
Необходимо отметить, что клетки, изолированные методом магнитной сепарации, сохраняли жизнеспособность, характерную морфологию и способность к дальнейшему росту и дифференцировке. Подтверждением этому служили многочисленные тесты, в том числе микроскопия, иммунофлуоресцентный анализ и RT-PCR-анализ.
Метод иммуномагнитной сепарации был использован W.F. Pickl и соавт. (1996) для выделения моноцитов из фракции мононуклеарных клеток периферической крови. Исходные клетки периферической крови здорового донора предварительно метили биотинилированными МКА против мембранного рецептора моноцитов/макрофагов CD14 (VIM13 и МЕМ18). На следующем этапе клеточную суспензию инкубировали с магнитными наносферами, конъюгированными со стрептавидином. Разделение смеси производили в сепарирующем устройстве колоночного типа VarioMACS. По данным цитофлуориметрического анализа, во фракции, элюированной из колонки сепаратора по окончании разделения, содержание CD14+-KFieTOK составляло более 98 % (97,13 - 99,99 %). Изолированные клетки также анализировали методом полимеразной цепной реакции, основанной на обратной транскрипции мРНК (RT-PCR). Исследования, проведенные на молекулярно-генетическом уровне, выявили экспрессию M-CSF-mRNA, GM-CSFR-mRNA,TNFRI(p55)-mRNA, CD14-mRNA и LZ-mRNA при отсутствии типичного для клеток-предшественников миелоидного ряда маркера МРО-mRNA, подтвердив тем самым их принадлежность к субпопуляции зрелых моноцитов периферической крови. Жизнеспособность выделенных клеток сразу после сепарации и на 3 - 7-е сутки культивирования составляла, в среднем, 98 %. В соответствии с большинством описанных методов иммуномагнитного разделения, клетки определенного фенотипа изолируют из исходной смеси либо позитивной селекцией на основе одного поверхностного маркера, либо по более сложной многоэтапной схеме сепарации [11; 12; 74]. В последнем случае на начальной стадии производят либо деплецию, либо обогащение клеточной смеси антиген-положительными клетками. Пре-селекция требует дополнительного времени, усложняет эксперимент и негативно влияет на свойства биологического материала. Группой исследователей Бермингемского университета был предложен новый усовершенствованный метод магнитной сепарации по двум маркерам [71]. Новизна подхода заключается в использовании магнитных микросфер разного размера и, соответственно, различной магниточувствительности. Данный факт исключает необходимость удаления микросфер после первого этапа сепарации.
Первый этап состоял в предварительной позитивной селекции исходных клеток с помощью магнитных наносфер диаметром 50нм (Mitenyi Biotech) и колоночного сепарирующего устройства MiniMACS (Miltenyi Biotech). Дальнейшую обработку проводили с использованием микросфер с диаметрами 2,8 и 4,5 мкм (М280 и М450 (Dynal)). На второй стадии разделение смеси осуществляли в более слабом, по сравнению с MiniMACS, поле постоянного магнита сепаратора МРС (Dynal).
Эффективность нового подхода была продемонстрирована на примерах иммуномагнитной сепарации тимоцитов разной степени зрелости и минорной популяции стволовых кроветворных клеток [71].
Двустадийная процедура выделения зрелых Т-клеток с фенотипом Thyl.2+CD4 из тканей мышиных лимфатических узлов включала позитивную селекцию клеток по антигену Thy 1.2 и последующую деплецию С04+-лимфоцитов. Обогащение суспензии Тпу1.2-положительными клетками проводили в системе MiniMACS с использованием наносфер диаметром 50 нм. В результате селекции была изолирована популяция клеток со 100 %-ной экспрессией антигена Thy 1.2, гетерогенная по экспрессии CD4 и CD8. Непосредственно следующая за первым этапом обработка позитивной по Thy 1.2 фракции заключалась в нескольких циклах деплеции CD4-положительных клеток с использованием магнитных частиц анти-СО4-М450 на сепараторе МРС. Конечная клеточная популяция содержала, преимущественно, С04 С08+-лимфофиты (92 %) и была абсолютно негативна по экспрессии клеточного маркера CD4.
Иммуномагнитная сепарация образцов для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции и другими методами молекулярной генетики
Метод полимеразнои цепной реакции амплификации ДНК (PCR-анализ) и его модификации позволяют выявлять определенные последовательности нуклеотидов в составе хромосом. Этот подход широко используется при диагностике заболеваний (аутоиммунных, опухолевых, вирусных), связанных с изменениями на уровне генома клетки, а также для обнаружения патогенных микроорганизмов. Высокая достоверность получаемых результатов обеспечивает широкое применение PCR-анализа в научной и клинической практике. Тем не менее, эта современная технология имеет ряд существенных недостатков и ограничений. При исследованиях методом PCR существует вероятность получения ложноотрицательных результатов в случаях, когда выявляемый объект присутствует в пробе в незначительных количествах. Такие ситуации недопустимы при выявлении патогенных микроорганизмов в диагностических и эпидемиологических целях или при детекции микрометастазов злокачественных новообразований. Для предварительной селекции образцов, проверяемых на наличие патогенных микроорганизмов, обычно используется выращивание на селективных средах. Той же цели, но с несравнимо меньшими временными затратами, можно достичь иммуномагнитной сепарацией исследуемого образца [75; 108]. Для дальнейшего культивирования и идентификации выделенных клеток могут быть использованы любые биохимические, иммунологические и молекулярные методы. Предваряющая PCR-анализ иммуномагнитная селекция образцов позволяет сократить общую продолжительность исследования до нескольких часов и одновременно способствует увеличению чувствительности и специфичности определения. Кроме того, амплифицированные фрагменты ДНК после включения специфической сигнальной метки и биотинилирования также могут быть изолированы с использованием покрытых стрептавидином магнитных микросфер. Дальнейший анализ такого образца может быть осуществлен методами, более простыми, чем традиционно применяемый гель-электрофорез. Амплифицированные последовательности нуклеотидов, связавшиеся с частицами сорбента, могут быть определены методом автоматического секвенирования ДНК. Последний подход дает возможность в течение 12-24 часов проанализировать до 30 фрагментов ДНК длиной в 300 - 600 нуклеотидов в течение 12-24 часов, считая от момента получения клинического материала [68].
Анализ экспрессии генома опухолевых клеток путем определения содержания мРНК методом RT-PCR имеет большое значение для экспериментальной и клинической онкологии. Получаемые результаты являются важными критериями при диагностике опухолевого процесса, прогнозировании его развития, а также могут быть использованы при выборе оптимальной терапии. Затруднения, возникающие при проведении такого анализа, связаны с гетерогенностью тканей опухоли. Примером удачного решения этой проблемы является работа группы датских исследователей [55]. Авторы продемонстрировали высокую результативность применения иммуномагнитной селекции на стадии подготовки образцов к исследованию методом RT-PCR. С помощью моноклональных антител против мембранного антигена эпителиальных клеток MUC1/MAM6 (клон 115D8) и магнитных микросфер, покрытых антивидовыми антителами, была проведена селекция пунктатов из метастатических очагов в подмышечных лимфоузлах больных раком молочной железы. Исследователи отмечают высокую степень обогащения материала опухолевыми клетками, достигаемую в результате селекции, и гомогенность выделяемых клеток (99,8 %). Конечной целью исследования являлось определение уровня экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости 1 (MDR1). Предварительные исследования были проведены на модельной смеси клеток линий T47D (115D8+MDR1_-клетки карциномы молочной железы) COLO320 (линия клеток того же происхождения, но с фенотипом 115D8TVTDR1 ). Было показано 250-кратное увеличение оцениваемого содержания MDRl-мРНК в образцах после селекции по сравнению с необработанным материалом. В случае образцов пункционных биопсий ситуация была несколько иной. Экспрессия гена MDR1 была выявлена при анализе необработанного материала и не обнаруживалась при RT-PCR-исследовании МиС1/МАМ6+-опухолевых клеток, изолированных иммуномагнитной селекцией. Это позволило сделать вывод о доминирующем вкладе лимфоцитов в результат анализа образцов до селекции. Таким образом, иммуномагнитное обогащение позволило исключить возможность получения ложно-положительных результатов при анализе экспрессии генома клетками метастазирующей карциномы молочной железы.
Предварительная иммуномагнитная сепарация костного мозга при FISH-выявлении и анализе микрометастазов рака молочной железы успешно использована Forus и соавт. (1999). В экспериментах на искусственно созданных смесях клеток авторам работы удалось с помощью позитивной иммуномагнитной селекции выделить и затем идентифицировать методом FISH неопластические клетки из образца, в котором соотношение опухолевых и нормальных клеток составляло 1:106.
Разработанная в 70-х годах гибридомная технология и сегодня является основным подходом к получению моноклональных антител. Процесс получения чистых линий клеток-продуцентов моноклональных антител включает селекцию, скрининг и клонирование образовавшихся гибридов. Эти процедуры являются достаточно трудоемкими и длительными. Проверка нескольких сотен образовавшихся клонов для выявления продуцирующих специфические антитела гибридом не может быть осуществлена на практике. Кроме того, клетки с требуемыми качествами сложно идентифицировать ввиду их крайней немногочисленности.
Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер
Комплексное исследование физико-химических свойств микросфер, синтезированных по разработанной технологии, включало анализ магнитных свойств, размеров и формы частиц, а также функциональных качеств поверхности.
Световая микроскопия показала, что метод эмульсионной полимеризации позволяет получать микрочастицы сферической формы (рис. 6).
Снимок получен с помощью системы видеомикроскопии на базе микроскопа Axioscop 2 (Zeiss) с цветной 3CCD камерой Sony. Общее увеличение хЮОО.
Анализ образцов на магнетометре выявил быстрый рост намагничения материала по мере увеличения напряженности магнитного поля (рис. 7). Уровень насыщения намагничения достигался уже при 1500 - 2000 эрстед. Практически это означает, что концентрирование как самих микросфер, так и комплексов микросфер с клетками-мишенями возможно в неоднородных магнитных полях доступной напряженности. Невысокое значение остаточной индукции (соответственно, слабое остаточное намагничение) предупреждает спонтанное агрегирование микросфер после извлечения из магнитного поля.
Сравнение с коммерчески доступными аналогами показывает, что по наиболее важным магнетометрическим характеристикам МПМ, синтезированные по разработанной технологии, не уступают продукции ведущих мировых производителей (табл. 1). микросфер выявила полиноминальный характер распределения частиц по размерам. В водных суспензиях содержались фракции частиц с диаметрами от 100 до 10 мкм (рис. 8). Сопоставление результатов ДЛС с данными микроскопии показало, что эти включения представляют собой агрегаты отдельных частиц. Следует отметить, что доминирующий вклад частиц большего размера в измеряемый сигнал интенсивности рассеянного света, вероятно, способствовал искажению реальных размеров более мелких частиц. Гетерогенность и агрегативная неустойчивость, недопустимые с точки зрения использования магнитных микросфер как основы иммуномагнитных сорбентов, поставили нас перед необходимостью поиска возможных причин и способов преодоления коагуляции частиц и разработки метода их фракционирования.
Пытаясь установить причину образования агломератов, мы исследовали влияние на стабильность суспензий поверхностно-активных веществ. Оказалось, что добавление неионогенных детергентов (Tween-20, 50 %-ный изопропиловый спирт), приводит к диссоциации агрегатов и позволяет получать стабильные коллоидные растворы (рис. 9). Это подтвердило предположение о том, что спонтанное агрегирование микросфер происходит в результате взаимодействия гидрофобных участков поверхности МПМ. При сравнении результатов измерений, представленных на рисунках 8 и 9 видно, что образцы, содержащие ПАВ, характеризуются, помимо отсутствия крупных агломератов, несколько большими значениями средних диаметров частиц остальных фракций. Это явление может быть объяснено недостаточной точностью измерений в случае слишком широкого распределения (рис. 8), обусловленной доминированием вклада частиц большего размера в измеряемый сигнал светорассеяния. Другая возможная причина заключается в набухании МПМ в растворе с ПАВ [2]. Важно, что полученные результаты позволили исключить вероятность необратимого агрегирования за счет образования «сшивок» между формирующимися частицами в процессе полимеризации. Кроме того, частичная гидрофобность поверхности частиц обеспечивает возможность иммобилизации протеинов путем пассивной адсорбции. Позднее было обнаружено, что иммобилизация протеинов на поверхности микросфер также приводит к разобщению конгломератов (рис. 10).
Для фракционирования микросфер использовали центрифугирование и осаждение в магнитном поле. Такой подход обеспечивал разделение по двум параметрам: по размеру и по магнитной восприимчивости.
Условия центрифугирования подбирали экспериментально, изменяя время и силу центрифужного поля. Для оценки эффективности разделения, образцы получаемых фракций анализировали методом ДЛС. Экспериментально показано, что при центрифугировании при 2000 g в течение 15 мин в супернатанте остаются частицы диаметром менее 500 нм (рис. 11). При той же продолжительности центрифугирования, но в центрифужном поле 1000 g, происходит осаждение микросфер диаметром более 1 мкм.
Негативная селекция Т-лимфоцитов
Для проведения этой серии экспериментов были использованы иммуномагнитные конъюгаты ИМК-ІСО-90 и ИМК-ІСО-180, полученные при разной продолжительности конъюгирования МКА с магнитным носителем (3.2.1.) и, следовательно, характеризующиеся различными значениями сорбционной емкости.
Чтобы оценить уровень неспецифичёского связывания суспензию мононуклеарных клеток периферической крови инкубировали с магнитными микросферами, покрытыми БСА (2.3.3.1.). Оказалось, что интенсивность неспецифических взаимодействий зависит, главным образом, от продолжительности инкубации частиц с клетками. Так, в случае часовой инкубации в условия комнатной температуры (22 - 25 С) до 20 % клеток образовывало комплексы с частицами негативного контроля. Уменьшение времени взаимодействия до 30 мин приводило к снижению уровня неспецифического связывания до 3 - 7 %. В соответствии с полученными результатами в дальнейшем ИМК инкубировали с исходными клетками в течение 30 мин.
Для негативной селекции Т-лимфоцитов по мембранному антигену CD3 использовали ИМК-ІСО-90 с сорбционной емкостью 4,4, 11,6 и 16,8 мкг/мг. Количественная оценка разделения путем подсчета клеток под микроскопом и качественный анализ результатов методом проточной цитофлуорометрии показали, что количество МКА, связанных с магнитными частицами, оказывает существенное влияние на эффективность деплеции.
Результаты проведенных экспериментов отражены на рис. 18, 19 и 20. После сепарации с использованием ИМК-ІСО-90 с сорбционной емкостью 4,4 мкг/мг количество клеток в образце уменьшилось на 30 %. Иммунофлуоресцетный анализ клеток в исходного образца и негативной фракции выявил сокращение CD3+- и С05+-популяций, соответственно, на 27 % (от 83,7 % до 60,2 %) и 30 % (от 89,6 % до 62,4 %) (рис. 18). Таким образом, эффективность специфической деплеции при использовании иммуномагнитного конъюгата с сорбционной емкостью 4,4 мкг/мг была крайне низкой (рис. 19), что, вероятнее всего, объясняется недостатком сорбированных на поверхности магнитных микросфер МКА. Кроме того, при сопоставлении результатов микроскопического подсчета клеток и цитофлуориметрического анализа был выявлен достаточно высокий уровень неспецифического связывания - 6,5 % (специфической деплецией обусловлена элиминация лишь 23,5 % клеток при общем сокращении популяции на 30 %).
Эффективность деплеции при использовании конъюгата со значением сорбционной емкости 16,8 мкг/мг показана на рис. 20. В результате проведенной сепарации количество СОЗ+-клеток, окрашиваемых МКА ICO-90-FITC, сократилось на 98,6 %. Контроль качества селекции по Т-клеточному антигену CD5, однако, выявил присутствие в негативной фракции значительного количества CD5-положительных клеток (15,6 %). Возможно, полученный результат объясняется тем, что при чрезмерно высокой концентрации МКА на поверхности микросфер в ходе сепарации часть молекул иммуноглобулинов теряет связь с сорбентом и, специфически взаимодействуя с рецепторами клеток-мишеней, препятствуют связыванию клеток с магнитными частицами и с прямомеченными МКА. В результате различными значениями сорбционной емкости
На всех графиках: по оси X - интенсивность флуоресценции, по оси Y — количество окрашенных клеток. эффективность разделения падает, а данные цитофлуориметрического анализа оказываются недостоверными.
Наибольшую эффективность негативной селекции Т-клеток мы выявили при использовании ИМК-ІСО-90 с сорбционной емкостью 11,6 мкг/мг (рис. 18, 19). Анализ экспрессии мембранных антигенов клетками негативной фракции выявил, соответственно, 1,9 % CD3+- и 2,0 % CD5+-лимфоцитов. Таким образом, проведенная сепарация привела к элиминации из исходного образца 98 % Т-лимфоцитов, что в равной степени подтверждалось оценкой экспрессии как CD3, так и CD5. При этом неспецифическое связывание составляло 3 %, т.е. находилось в пределах ошибки метода подсчета в камере Горяева.
В результате проделанных экспериментов было показано, что наиболее полная деплеция Т-лимфоцитов обеспечивается использованием ИМК-ІСО-90 с сорбционной емкостью 11,6 мкг/мг. Такая величина S соответствует иммобилизации IgG в количестве, необходимом и достаточном для формирования протеинового монослоя на поверхности частиц носителя. Эффективность сепарации заметно снижается при уменьшении или увеличении количества поверхностно-связанных МКА.