Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Вязкие нефти: запасы в мировом масштабе, физико-химические свойства, методы добычи,биодеградации и рекультивации 10
1.1 Запасы вязких нефтей в мировом масштабе и Монголии 10
1.2 Особенности физико-химических свойства вязких нефтей 11
1.3 Методы добычи высоковязких нефтей 13
1.3.1 Физико-химические методы увеличения нефтеотдачи 15
1.3.2 Микробиологические методы увеличения нефтеотдачи 16
1.4 Изменение состава и свойств углеводородов нефти при биодеградации -20
1.4.1 Особенности биодеградации УВ нефти в жидкой среде 20
1.4.2 Особенности биодеградации УВ нефти в пластовых условиях 22
1.4.3 Особенности биодеградации УВ нефти в почве 23
1.4.4 Восстановление нефтезагрязненных почв 27
1.5 Биохимическое окисление индивидуальных углеводородов 30
1.5.1 Биоокисление алифатических (н-алканов) углеводородов 30
1.5.2 Биоокисление алициклических и ароматических углеводородов 32
1.6. Пластовый биоценоз нефтяных месторождений, разрабатываемых с помощью заводнения 36
1.6.1 Углеводородокисляющая пластовая микрофлора (УОМ) 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования. 40
2.1 Физико-химические и геологические характеристики вязких нефтей Монголии 40
2.2 Методы исследования пластовой и почвенной микрофлоры 42
2.3 Методы определения ферментативной активности углеводородокисляющих микроорганизмов 44
2.4 Методы исследования процессов биодеструкции нефти в воде и почве 44
2.5 Моделирование процесса вытеснения нефти с применением комплексного микробиологического и физико-химического метода 46
2.6 Методы исследования остаточной нефти после биодеструкции и вытеснения из моделей пласта 50
ГЛАВА 3. Физико-химическая и микробиологическая характеристика нефтяных пластов месторождений монголии 53
3.1 Физико-химическая и микробиологическая характеристика месторождений Монголии: Тамсагбулаг и Цагаан-Элс 53
3.2 Составление и выбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов вязких нефтей 55
3.3 Влияние азотистых субстратов - компонентов композиции НИНКА на рост и активность углеводородокисляющих микроорганизмов 58
ГЛАВА 4. Деструктивные изменения углеводородов вязкой нефти при биодеструкции в жидкой среде 62
4.1 Биодеструкция углеводородов нефти 62
4.2 Изменение состава насыщенных углеводородов 64
4.3 Изменение би- и трициклических алкилароматических углеводородов 72
ГЛАВА 5. Вытеснение вязких нефтей монголии комплексным микробиологическим и физико-химическим методом 76
5.1 Вытеснение нефти месторождения Тамсагбулаг 76
5.2 Вытеснение нефти месторождения Цагаан-Элс 80
5.3 Изменение состава углеводородов вязкой нефти в процессе вытеснения комплексным методом 84
ГЛАВА 6. Ремедиация почв монголии, загрязнённых вязкой нефтью, в лабораторных условиях и в полевом эксперименте 89
6.1 Влияние нефтяных загрязнений на активность почвенной микрофлоры 89
6.2 Стимуляция оксигеназной активности биоценоза нефтезагрязненных почв раствором композиции НИНКА, содержащей ПАВ и карбамид 91
6.3 Изменение углеводородного состава нефти, загрязняющей почву, при моделировании процессов биодеструкции в лабораторных условиях 94
6.4 Полевые испытания очистки почв Монголии от загрязнений нефтью и нефтепродуктами 99
Выводы
Список использованной литературы
- Особенности физико-химических свойства вязких нефтей
- Пластовый биоценоз нефтяных месторождений, разрабатываемых с помощью заводнения
- Методы исследования процессов биодеструкции нефти в воде и почве
- Составление и выбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов вязких нефтей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Высоковязкие нефти в настоящее время рассматриваются как основой резерв мировой добычи нефти. Их запасы примерно в 5 раз превышают извлекаемые запасы нефтей малой и средней вязкости. Разработка месторождений высоковязких нефтей ведется, как правило, с применением методов теплового воздействия.
В последние годы в Монголии введены в эксплуатацию нефтяные месторождения -Тамсагбулаг, Зуунбаян и Цагаан-Элс, где запасы вязкой нефти составляют 1.5 млрд. баррелей. Их добыча осуществляется методом теплового воздействия на залежь. Этот метод является эффективным, но технологически сложным и высоко затратным. Для повышения нефтеотдачи ведутся поиски и разрабатываются комплексные физико-химические и микробиологические методы увеличения нефтеотдачи. В основе этих методов лежит способность микроорганизмов к ферментативному окислению углеводородов нефти с образованием продуктов метаболизма, изменяющих реологические свойства нефти и способствующих ее вытеснению из пласта.
Способность микроорганизмов к деструкции углеводородов (УВ) нефти и нефтепродуктов лежит в основе многих биотехнологий, направленных на улучшение экологических условий, в том числе, биотехнологии восстановления нефтезагрязненных почв и водных акваторий. Считается, что наиболее распространенными в загрязненных местах обитания являются бактерии родов: Rhodococcus, Pseudomonas, Arthrobacter и Acinetobacter. Именно этим организмам, принадлежащим к углеводородокисляющей группе, отводится основная роль в процессах естественного самоочищения почв от нефтяных загрязнений. Углеводородокисляющие микроорганизмы способны окислять алканы, ароматические углеводороды, смолы и асфальтены в условиях широкого диапазона температур - от минус 5 до +75 С. Микробному воздействию подвергаются практически все известные углеводороды. Кроме того, важную роль в деградации углеводородов играют вещества с поверхностно-активными свойствами, которые превращают нефтяную пленку в мелкодисперсную эмульсию, что приводит к увеличению площади контакта нефтяных капелек с бактериями и улучшает аэрацию. Процесс биодеструкции углеводородов нефти сопровождается изменением физико-химических свойств, группового и индивидуального углеводородного состава нефтей. Следует отметить, что нефть - многокомпонентная система, поэтому процесс ее биодеградации носит сложный характер и зависит от ее физико-химического состава.
Для вязких нефтей Монголии достаточно хорошо изучен состав углеводородов. Но их трансформация в процессе биодеструкции пластовой микрофлорой ранее не исследовалась. В этом отношении особый интерес представляет изучение процесса ферментативного окисления углеводородов вязких нефтей Монголии пластовой микрофлорой и почвенным биоценозом.
Цель данной работы: исследование процессов биодеградации вязких нефтей, изменение их группового состава и разработка экологически безопасного комплексного физико-химического и микробиологического метода увеличения нефтеотдачи высоковязких нефтей Монголии и метода рекультивации нефтезагрязненных почв.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
изучить физико-химические и микробиологические характеристики пластовых флюидов месторождений Монголии;
исследовать активность пластовой микрофлоры в процессах биодеструкции углеводородов вязких нефтей;
изучить стимулирующее действие азотистых компонентов нефтевытесняющей композиции ПАВ на численность и окислительную активность микроорганизмов;
исследовать изменение состава индивидуальных углеводородов вязких нефтей при биодеградации в почве и жидкой среде (н-алканы и алкиларены нафталинового и фенантренового рядов);
исследовать закономерность вытеснения вязкой нефти и компонентов композиции комплексным микробиологическим и физико-химическим методом на насыпных моделях пласта;
провести лабораторные и полевые испытания по очистке почв от нефтяных загрязнений.
На защиту выносятся:
- Изменение состава индивидуальных углеводородов при биодеградации
высоковязких нефтей Монголии в присутствии композиции НИНКА, содержащей ПАВ и
азотистые субстраты.
- Комплексный физико-химический и микробиологический метод увеличения
нефтеотдачи месторождений высоковязких нефтей Монголии.
- Метод рекультивации почв Монголии, загрязненных вязкой нефтью, на основе
биодеструкции углеводородов.
Научная новизна работы.
Установлено активное окисление углеводородов ассоциацией
углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефти изучаемых месторождений.
Изучено стимулирующее влияние компонентов композиции на оксигеназную активность пластовой микрофлоры с накоплением продуктов метаболизма, способствующих вытеснению нефти из пласта.
Впервые изучены изменения состава насыщенных и ароматических углеводородов высоковязких нефтей Монголии в процессе их биодеградации. Показано, что в процессе биодеградации параллельно с н-алканами окисляются би- и триалкилароматические углеводороды.
Впервые разработан комплексный микробиологический и физико-химический метод вытеснения вязких нефтей месторождений Монголии.
Впервые показано, что вытеснение нефти комплексным методом на основе композиций ПАВ и углеводородокисляющей микрофлоры сопровождается изменениями состава н-алканов, алкилароматических углеводородов.
Впервые проведен комплекс рекультивационных мероприятий, направленных на активизацию деструктивных процессов в нефтезагрязненной почве на территории Монголии.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования являются научной основой разработанного комплексного микробиологического и физико-химического метода увеличения нефтеотдачи залежей вязких нефтей Монголии без применения теплового воздействия и микробиологического метода ремедиации нефтезагрязненных почв.
Апробация работы: Основные разделы работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской научно-практической конференции «Добыча, подготовка, транспорт нефти и газа» (Томск, 2007 г.), VII Международной конференции «Химия нефти и газа» (Томск, 2009 г.), The 3rd International Conference on Chemical Investigation and Utilization of Natural Resources (Ulaanbaatar, Mongolia 2008, г.).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести разделов, выводов, списка литературы из 181 наименований. Работа изложена на 121 страницах, содержит 28 таблиц и 34 рисунка.
Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям доктору техн. наук, профессору Л.К. Алтуниной и к.б.н., доценту Л.И. Сваровской, коллективу лаборатории коллоидной химии нефти, заведующему лабораторией углеводородов и
высокомолекулярных соединений нефти доктору хим. наук А.К. Головко за помощь при проведении исследований и написании диссертации.
Особенности физико-химических свойства вязких нефтей
По физико-химическим свойствам нефти весьма разнообразны, поэтому существует классификация, позволяющая различать их по составу, плотности и вязкости. По вязкости нефти подразделяются на маловязкие, вязкие и высоковязкие. К высоковязким нефтям принято относить нефти с вязкостью 30 мПа-с и выше [6,7,10]. Каждый вид нефти отличается уникальным молекулярным составом, определяющим ее физические и химические свойства. Известно, что физические свойства нефти зависят от преобладания в них отдельных углеводородов (УВ) или различных их групп. Например, большое содержание в нефти парафинов, смол и асфальтенов повышает ее вязкость, особенно при пониженных температурах. Высоковязкие нефти Евразии и Африки в среднем являются тяжелыми (0,88-0,92 r/cMJ), сернистыми (1-3 %), малопарафинистыми ( 5 %), высокосмолистыми ( 13 %), с высоким содержанием асфальтенов (3-10%) и низким содержанием фракции н.к. 200 С ( 20 %). Высоковязкие нефти России в среднем являются тяжелыми и сернистыми, высоко смолистыми и высокоасфальтеновыми, малопарафинистыми, с низким содержанием фракций, выкипающих до 200 С.
Данные свойства ВВН России в среднем совпадают со свойствами высоковязких нефтей Евразии и Африки [И]. Однако, по сравнению с последними содержание низкокипящих фракций, выкипающих до 200 и 300 С для российских вязких нефтей является повышенным [12, 13]. Нефти Усинского месторождения Тимано-Печорского бассейна относятся к тяжелым (плотность 0.932-1.008 г/см"3), высоковязким (вязкость - 649 мПа-с), с содержанием асфальтенов 7,6-8,7 % мае, концентрация смол 18,4-22,1 % мае. Низкие температуры застывания нефтей (-14 ч- -20 С) обусловлены высоким содержанием асфальтенов и смол. Содержание твердого парафина не превышает 1,4% масс. [14]. По общему содержанию сернистых соединений Усинские нефти близки к тяжелым высокосернистым нефтям Урало-Повольжя (2,04 % масс.) [15]. Вязкие нефти Монголии малосернистые. Нефти Тамсагбулагского месторождения содержат смолисто-асфальтеновых веществ 5-7 % мае, месторождений Зуунбаян и Цагаан-Элс (Восточно-Гобийский бассейн) 9-12% мае. Физико-химическая характеристика этих нефтей приведена в таблице 1. По содержанию н-алканов нефти Монголии относятся к высокопарафинистым, содержащим не менее 11% мае. твердых УВ [16,17]. Тяжелых фракций, выкипающих выше 450 С, содержится почти 50 % мае. [18]. Нефти относятся к нафтеноароматическому типу, за исключением нефти скважины 142 месторождения Цагаан-Элс, которая принадлежит к более сложному - нафтено-арено-метановому типу.
Содержание алкилмоноцикланов в этих нефтях выше долей н-алканов, несмотря на высокую парафинистость объектов [19]. Из-за высокого содержания н-парафинов Монгольские нефти застывают при 20 и 29 С, что существенно осложняет и удорожает процессы ее добычи, транспортировки и переработки [18]. При добыче вязких высокопарафинистых нефтей снижается и даже пол ностью прекращается дебит скважин из-за закупорки асфальто-смолисто-парафиновыми отложениями (АСПО). Добыча таких нефтей требует применения специальных дорогостоящих технологий. В настоящее время во многих странах ведется поиск новых технологий и оборудования для добычи парафинистых, тяжелых, высоковязких нефтей. Характерной особенностью современной нефтедобычи является увеличение в мировой структуре сырьевых ресурсов доли трудноизвлекаемых запасов, к которым, в первую очередь, относятся тяжелые и высоковязкие парафинистые нефти. Основными методами освоения вязких нефтей являются: термические, химические и физические. В настоящее время добыча высоковязкой нефти за счет термических методов, как безальтернативной технологии, составляет около 2 % от общей мировой нефтедобычи [20-24]. В последние годы глубокие прикладные задачи в области термической добычи высоковязкой нефти были решены рядом известных ученых России, Украины, Азербайджана [25-27]. Ряд авторов [28-30] внесли существенный вклад в решение практических проблем (технологических и технических) развития термических методов добычи высоковязкой нефти. На сегодняшний день освоены и используются в промышленных масштабах четыре основные группы методов: паротепловое воздействие на пласт, внутрипластовое горение, вытеснение нефти горячей водой, пароциклическая обработка скважин, а также комбинированное использование этих технологий. Из них наиболее действенным является метод паротеплового воздействия на залежь путем стационарной или циклической закачки пара, который применяется на месторождениях Венесуэлы, Нидерландов, США, Казахстана и России [21]. Метод внутрипластового горения - в США, Норвегии, Канаде и в других странах [31-34]. На месторождениях
Башкортостана применяется метод закачки горячей воды для карбонатных коллекторов с нефтями повышенной вязкости, что позволило на Знаменском месторождении дополнительно получить 38,8 тыс. т нефти при введении в пласт 377 тыс м воды повышенной температуры [35]. На месторождениях Монголии добыча высоковязкой нефти осуществляется также методом теплового воздействия на залежь горячей воды. Закачка горячей воды с достаточно высокими теплоэнергетическими параметрами в глубокозалегающие пласты с хорошими коллекторскими свойствами, как правило, приводит к положительным результатам. Паротепловое воздействие является эффективной, но технологически сложной и высоко затратной системой эксплуатации залежи. Поэтому для повышения нефтеотдачи ведутся поиски и разрабатываются химические методы в комплексе с паротепловыми или биологическими методами [36]. В настоящее время в мире промышленные технологии извлечения высоковязких нефтей химическими методами без теплового воздействия отсутствуют.
Пластовый биоценоз нефтяных месторождений, разрабатываемых с помощью заводнения
Нефтяные бассейны вместе с пластовой водой и растворимыми в ней минеральными и органическими соединениями составляют особую геологическую экосистему с разными физико-химическими in situ условиями (медленные массообмены, постоянные температуры) для развития аборигенного биоценоза [137, 138]. В условиях нефтяной залежи аборигенная микрофлора (70-90 %) находится в сорбированном состоянии на пористой поверхности породы в форме биоплёнки и лишь небольшой ее процент находится в свободном состоянии в пластовой воде [139]. Источником поступления микроорганизмов является вода открытых водоемов или сеноманская вода, нагнетаемая в пласт для поддержания давления внутри пласта. С нагнетаемой водой в пласт поступает растворимый кислород и обеспечивает развитие аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов [140, 141]. Жизнедеятельность микроорганизмов в условиях нефтяной залежи зависит от температурного фактора, рН и окислительно-восстановительного потенциала среды, присутствия растворимого кислорода и наличия растворенных органических и минеральных соединений [142]. Для пластов с низкой температурой, до 50 С, преобладает мезофильная микрофлора. К аэробной мезофильной группе относятся микроорганизмы, сохраняющие активность при температуре до 45 С. К ним относится представители родов Psendomonas, Rhodococcns, Brevibacterium, Mycobacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Flavobacteruim, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacillus, Acinetobacter [143]. Из высокотемпературных нефтяных пластов выделен ряд уникальных термофильных бактерий [141, 144].
Соленость и рН пластовых вод, содержащих минеральные соединения, ограничивают активность бактерий. В пластовой воде концентрация солей может изменяться от 0.2 (почти пресная) до 200-300 г/л (высокоминерализованная). Величина рН в основном находится в интервале от 3 до 7.5 [142]. В пластовых водах нефтяных месторождений выявлены аэробные и анаэробные группы микроорганизмов [145]. Микроорганизмы, способные к ферментативному окислению углеводородов нефти, составляют многочисленную широко распространенную группу углеводородокисляющих (УОМ). В настоящее время известно более 100 видов микроорганизмов различных таксономических групп, использующих в качестве источника углерода и энергии углеводороды нефти и газа [146]. Углеводород окисляющие микроорганизмы (УОМ), представители родов Pseudomonads, Rhodococcns, Acinetobacter и Micrococcus, являются постоянными компонентами биоценоза нефтяных залежей и открытых водоемов, но их относительное количество непостоянно [147, 148]. По данным различных авторов, наибольшая численность этих микроорганизмов отмечена в призабойной зоне нагнетательных скважин (до Ір-К кл/см"1). В нефти также существует большое количество микроорганизмов, имеющих особое строение бактериальной клетки. Из высокотемпературных нефтяных пластов были выделены термотолерантные и термофильные бактерии родов Bacillus (B.licheniformus) и Geobacillus [149-151]. УОМ имеют широкое распространение в нефтезагрязненных почвах.
Селективное действие нефти на почвенный биоценоз, в первую очередь, выражается в том, что в загрязненных почвах значительно увеличивается число микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды. В загрязненных почвах обнаружены узкоспециализированные формы микроорганизмов, окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические углеводороды. Среди них выявлены представители бактерий родов Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Micrococcus и дрожжевые культуры [152]. Авторы выделяли более 20 родов бактерий и более 10 родов грибковых культур из нефтезагрязненных почв, способных к утилизации тяжелых фракций нефти [153]. Наиболее активными и широко распространенными деструкторами нефтепродуктов оказались бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Actinomyces, Rhodococcus, Micrococcus и многочисленная грибковая микрофлора [154]. Наряду с бактериями, некоторые мицелиальные грибы (роды Aspergillus, Fusarium, Mucor и др.) способны к утилизации нефти и нефтепродуктов.
Следовательно, углеводородокисляющие микроорганизмы являются постоянными компонентами пластовых вод месторождений и почвенных биоценозов, их катаболическая активность используется для разработки экологически безопасных методов повышения нефтеотдачи и восстановления нефтезагрязненных почв. Таким образом, приведенный обзор литературы указывает на принципиальную возможность разработки метода повышения нефтеотдачи высоковязких парафинистых нефтей месторождений Монголии и метода восстановления нефтезагрязненных почв Монголии. В связи с этим возникает необходимость изучения процессов биодеградации высоковязких нефтей Монголии в условиях, близких к пластовым. микробиологических исследований являлись пробы вязких нефтей и пластовой воды, отобранные на месторождениях Тамсагбулаг и Цагаан-Элс. Основные характеристики изучаемых нефтей приведены в таблице 2. Месторождение Тамсагбулаг расположено в восточной части Монголии в Тамсагбулагской провинции, Цагаан-Элс - в юго-восточной части страны, в провинции Восточное Гоби. Продуктивные горизонты Восточно-Гобийской провинции приурочены к нижнемеловым отложениям, Тамсагбулагской - к верхнеюрским. В состав породы нижнемеловых слоев входят песчаники, которые содержат цеолитовые частицы, что приводит к уменьшению их проницаемости [4, 9, 17].
Методы исследования процессов биодеструкции нефти в воде и почве
При исследовании процессов биодеструкции нефти углеводородокисляющей группой микроорганизмов большое значение имеет их каталазная, дегидрогеназная, полифенолоксидазная и пероксидазная активность. Каталазная активность. Каталазную группу ферментов в жидкой среде и почве определяли газометрическим методом, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода. Активность каталазы выражают в мл кислорода, выделившегося на 1 грамм пробы [161]. Дегидрогеназная активность. Основным методом исследования дегидрогеназнои активности является восстановление индикаторов с низким редокс-потенциалом типа метиленовои сини за счет дегидрирования соответствующих субстратов. Для этого в качестве акцептора водорода применяли бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый - ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан - ТФФ). Активность дегидрогеназ выражают в мг ТФФ на 1 грамм почвы за сутки. Ошибка определения -до6%[161]. Полифенолоксидазную и пероксидазную активность ферментов определяли колориметрическим методом по скорости разложения гидрохинона и перекиси в жидкой среде и почве. Активность полифенолоксидаз и пероксидаз выражают в мг хинона, полученного при окислении гидрохинона [161]. Биодеструкция нефти в жидкой среде. Эксперименты проводили в лабораторных условиях при периодическом культивировании изолированной углеводородокисляющей группы микроорганизмов в контакте с нефтью. Для этого в колбы объемом 500 мл, содержащих 100 мл минеральной среды, вносили микробную взвесь и 0.5-1 % нефти от объема среды. Термостатирование проводили на термокачалке в течение 14 суток при температуре, близкой к пластовой. Для контроля, одновременно закладывали опыт, без внесения микроорганизмов. Для опытных и контрольных процессов биодеструкции использовали среду Раймонда, которая по своему составу моделирует пластовую воду.
После термостатирования нефть из культуральной среды трижды извлекали хлороформом, экстракты объединяли. Хлороформ удаляли на роторном испарителе, массу остаточной нефти доводили до постоянного веса. Процент биодеструкции нефти рассчитывают по формуле: (пъ /mi)-100 %, где mi — масса исходной нефти, г; пъ — масса нефти после биодеструкции, г. В процессе биодеструкции изучали динамику численности микроорганизмов, их ферментативную активность. В конце эксперимента определяли поверхностное натяжение, индекс эмульгирования культуральной жидкости и накопление альдегидов, как продуктов метаболизма при биоокислении УВ нефти [162-164]. Эмульгирующая активность (Э ) культуральной жидкости, содержащей бактериальные клетки и продукты метаболизма, определяли по формуле: где h - высота слоя культуральной жидкости+гексадекан, см ht - высота эмульгирующего слоя, см. Опыт проводили в 2-3-х повторностях с гексадеканом и с легкой нефтью. Процесс биодеструкции прекращали на 14 и 21-ые сутки при значительных визуальных изменениях нефтяной пленки, при образовании эмульсии. Биодеструкция нефти в почве. Биодеструкцию нефти в почве проводили также в лабораторных условиях. Для этого в специальные емкости вносили по 300 г почвы и загрязняли нефтью месторождений Тамсагбулаг и Цагаан-Элс в концентрации 5 и 10 % по отношению к весу почвы. Содержимое тщательно перемешивали, отбирали пробы и методом посева на селективные агаровые среды определяли исходную численность микроорганизмов и в течение всего эксперимента. В конце эксперимента остаточную нефть из загрязненных образцов почвы экстрагировали хлороформом на аппарате Сокслета, освобождали от хлороформа на роторном испарителе, выдерживали до постоянной массы, взвешивали на аналитических весах, после чего рассчитывали процент остаточного загрязнения [165-167]. Качественные и количественные изменения группового, углеводородного состава нефти, биодеградированной в почве и жидкой среде, исследовали методами ИК-спектрометрии, ЯМР Н, ВЭЖХ, ГЖХ и ГХ/МС. Для исследования процессов нефтевытеснения из насыпных моделей пласта применяли взвесь углеводородокисляющей микрофлоры с высокой оксигеназной активностью. В качестве стимулирующих подкормок при вытеснении вязких нефтей Монголии применяли раствор композиции НИНКА в концентрации 5 %. Нефтевытеснение проводили на установке, состоящей из четырех стеклянных термостатируемых колонок (1) с различной проницаемостью. Схема установки приведена на рисунке 8. Каждая колонка подключается отдельно к коллектору (2) для создания градиента давления. Используется принцип поршневого взаимного вытеснение жидкостей. Для подачи исходных жидкостей и замера вытесняемых из колонок воды и нефти применяли делительные воронки (3) и мерные цилиндры (4). Заданную температуру поддерживали с помощью
Составление и выбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов вязких нефтей
Воздействие УВ-окисляющих бактерий является первым звеном цепи процессов, приводящих к разрушению нефти. Способ воздействия микроорганизмов на углеводороды зависит от рода микроорганизмов и их численности. Ассоциация разнообразных микроорганизмов в значительной степени могут вызывать деструкцию УВ нефти. В процессе работы из нефтей Монголии были отобраны и изучены 12 штаммов-деструкторов углеводородов нефти. Их выбор был проведён по способности к росту и размножению на минеральной жидкой среде с добавлением гексадекана или нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили при температуре 32 С. Из 12-ти штаммов, для дальнейшей работы, отобрали пять, проявляющих высокую оксигеназную активность при утилизации нефти. Их родовую принадлежность изучали методом секвенирования (в Институте Цитологии и Генетики СО РАН, г. Новосибирск). Филогенетическое дерево изучаемых штаммов, построенное на основании нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК методом UPGMA представлено на рисунке 9. Шкала соответствует 0,1 нуклеотидных замен на сайт.
Штаммы значительно отличались друг от друга по морфологическим критериям и по филогенетическому положению, вследствие чего каждый из штаммов совместно с гомологами образовывал отдельный кластер. Выделенные штаммы по всем признакам отнесены к родам: Pseudomonas (Pseudomonas stutzeri и Pseudomonas putida), Acinetobacter johnsoni, Dietzia sp W5026 (Rhodococcus), Brevibacterium luteolum. Углеводородокисляющую активность выделенных 5-ти штаммов, объединенных в ассоциацию, исследовали в процессах биодеструкции нефти. За 30 суток культивирования их численность увеличилась от 3,9 до 273-370,4 млн клеток/мл с накоплением продуктов метаболизма, в том числе биоПАВ и биоэмульгаторов [173]. Для оценки способности микроорганизмов продуцировать биоПАВ измеряли поверхностное натяжение культуральной среды, которое при утилизации нефти снижалось от 72 до 54 мН/м. Деструктивная активность каждого штамма при культивировании в жидкой среде с добавлением нефти представлена в таблице 6. Из данных таблицы следует, что наименьшую деструктивную активность проявил штамм Brevibacterium luteolum, но и другие штаммы очень медленно осуществляли процессы деструкции, которая за две недели не превышала 12 % для вязкой нефти месторождения Тамсагбулаг. Утилизация вязкой нефти месторождения Цагаан-Элс изучаемыми штаммами была незначительной и не превышала 3 %. Для стимуляции процессов биодеструкции применяли питательные субстраты, увеличивающие численность и ферментативную активность углеводородокисляющих микроорганизмов. В дальнейшем, эксперименты по деструктивной активности стимулированных микроорганизмов проводили ассоциацией, состоящей из четырех штаммов: Pseudomonas putida, Dietzia sp W5026, Acinetobacter johnsoni, Pseudomonas stutzeri.
Степень деструкция вязких парафинистых нефтей находится в зависимости от скорости размножения и численности бактерий, их ферментативной активности и выбора питательных субстратов, продолжительности экспоненциальной фазы роста, поддерживающей высокую численность микроорганизмов. Для стимуляции процессов жизнедеятельности УОМ применяли азотистые минеральные субстраты и растворы нефтевытесняющей композиции НИНКА, содержащей азотистые компоненты. В качестве азотистых субстратов применяли 0,05 %-ные растворы азотнокислого калия - KNO3, аммиачной селитры - NH4NO3 и карбамида -(ЖЬЪСО. Эффективными питательными свойствами, увеличивающими численность микрофлоры на 3 порядка, обладают 0,05 %-ные растворы аммиачной селитры и азотнокислого калия. При этом, за 14 суток, биодеструкция ассоциацией УОМ, стимулированной 0,05 %-ным раствором селитры, не превышала 22 % для нефти месторождения Тамсагбулаг, для Цагаан-Элс - 6,4 % (табл. 7). Результаты экспериментов показали, что применение 0,05 %-ного раствора селитры оказывает стимулирующее влияние на ферментативную активность микрофлоры при биодеструкции высокопарафинистых нефтей. При этом потеря массы нефти Цагаан-Элс была незначительной. Причиной может быть повышенное содержание н-парафинов и более высокая вязкость, чем нефти месторождения Тамсагбулаг. Нефть застывает при 20 и 29 С, что существенно осложняет процесс биодеструкции. Для решения этой проблемы в качестве питательного субстрата для микроорганизмов использовали раствор нефтевытесняющей композиции, содержащей ПАВ и азотистые компоненты. При применении ПАВ снижается вязкость нефти и изменяется поверхностное натяжение нефтяной пленки, что способствует ее диспергированию и ускоряет процессы биодеструкции. В качестве стимулирующего питательного субстрата для ассоциации УОМ применяли 0,05-10 %-ные растворы композиции НИНКА (рис. 10а).
