Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Методы избирательной защиты первичных и вторичных аминогрупп в полиаминах. 9
2.2. Синтез полиаминов и их аналогов. 13
2.2.1. Методы алкилирования 13
2.2.2. Методы восстановления 18
2.2.3. Присоединение по Михаэлю 25
2.2.4. Реакция Мицунобу 27
2.2.5. Твердофазный синтез полиаминов 28
2.3. Регуляция активности ферментов катаболизма полиаминов . 31
2.3.1. Спермидин/спермин-УУ'-ацетилтрансфераза 32
2.3.2. Полиаминоксидаза 40
3. CLASS Результаты и обсуждение. CLASS 44
3.1. Метаболически устойчивые аналоги полиаминов. 44
3.1.1. Синтез рацемических а-метилполиаминов 48
3.1.2. Получение ^-ацетил-а-метилспермидина 51
3.1.3. Оптические изомеры а-метилполиаминов 53
3.2. Новый изостерный зарядодефщитный аналог спермина (SpmTrien) 58
3.2.1. Дизайн структуры SpmTrien и его биохимически значимых производных 58
3.2.2. Синтез SpmTrien 62
3.2.3. Синтез ацетильных производных SpmTrien 64
3.2.4. Синтез бис-этил SpmTrien 66
3.3. Исследование субстратных свойств а-метилполиаминов по отношению к ферментам катаболизма полиаминов in vitro. 67
3.4. Биологические эффекты и метаболизм а-метилполиаминов in vivo 69
3.5. Взаимодействие SpmTrien с ДНК в модельных системах. 74
3.5.1. Конденсация ДНК под действием SpmTrien 74
3.5.2. Комплексообразующие свойства SpmTrien 76
4. Экспериментальная часть. 82
4.1. Синтез аналогов полиаминов. 83
4.1.1. Синтезы рацемических ocMeSpd, ctMeSpm, a,a'-Me2Spm и Ac-aMeSpd 83
4.1.2. Синтезы оптических изомеров aMeSpd, aMeSpm и a,a'-Me2Spm 91
4.1.3. Синтезы SpmTrien, его бис-этильного и .ионо-ацетильных производных 99
4.2. Защита ДНК от свободно-радикальных повреждений при помощи SpmTrien. 112
4.3. Взаимодействие SpmTrien с молекулярными конструкциями ДНК. 112
4.4. Конденсация ДНК под действием SpmTrien в нейтральной и слабокислой среде. 113
5. Выводы ... ... 115
6. Список литературы...
- Методы алкилирования
- Регуляция активности ферментов катаболизма полиаминов
- Новый изостерный зарядодефщитный аналог спермина (SpmTrien)
- Синтезы SpmTrien, его бис-этильного и .ионо-ацетильных производных
Введение к работе
Биогенные полиамины -спермин, спермидин и их предшественник путресцин присутствуют в значительных количествах в животных клетках всех типов и необходимы для их нормального роста. При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатионов. Спермидин и спермин взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК, а спермидин, являясь субстратом дезоксигипузинсинтетазы, необходим для модификации фактора инициации трансляции eIF-5A, присутствующего у всех эукариот. Кроме того, полиамины участвуют в регуляции транспорта Са2+ митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта К+. Недавно было показано, что полиамины регулируют процесс полимеризации тубулина и участвуют в процессах апоптоза. Разнообразие и жизненная важность клеточных функций позволяют рассматривать спермин и спермидин в качестве низкомолекулярных регуляторов клеточного метаболизма. Вместе с тем, системы метаболизма и активного транспорта, а также функции полиаминов на молекулярном уровне изучены недостаточно.
Одной из отличительных особенностей опухолевых клеток по сравнению с нормальными, является повышенное содержание в них полиаминов. Соответственно, специфические ингибиторы биосинтеза спермидина и спермина и индукторы ферментов их катаболизма обладают выраженной противоопухолевой активностью [1,2]. Кроме того, истощение внутриклеточного пула полиаминов замедляет размножение паразитов, например, малярийного плазмодия и вирусов, в том числе и вируса иммунодефицита человека, что является ещё одним фактором, подчёркивающим актуальность исследований в этой области.
Исторически первые работы в области химического регулирования метаболизма полиаминов были направлены на создание ингибиторов ферментов биосинтеза спермидина и
спермина. Впоследствии оказалось, что этого недостаточно для полного истощения пула полиаминов в клетке, поскольку клетки оснащены системами активного транспорта путресцина, спермидина и спермина. Поэтому в последние годы центр тяжести исследований сместился в сторону активации катаболизма полиаминов, ключевым ферментом которого является спермидин/спермин-Л''1-ацетилтрансфераза (SSAT). Были найдены вещества (в основном, терминально бис-алкилированные производные спермидина, спермина и их гомологов), способные вызывать повышение клеточной активности SSAT в десятки и даже сотни раз, что приводит к резкому понижению внутриклеточной концентрации полиаминов. В этом случае транспортируемые в клетку из внешней среды спермидин и спермин быстро утилизируются и потому не способны поддерживать рост.
Однако является ли наблюдаемое замедление роста клеток следствием дефицита спермина и спермидина, либо оно вызвано отдаленными полиамин-независимыми последствиями индукции SSAT, до сих пор не было известно. Для решения этого вопроса необходимо найти способ поддержания жизнеспособности клеток с индуцированной SSAT, например, с помощью метаболически устойчивых аналогов полиаминов, способных выполнять основные клеточные функции спермидина и спермина. В общем смысле, значение подобных веществ велико еще и потому, что регуляция биохимических процессов подразумевает не только возможности вызывать необходимый ответ клетки или организма, но и наличие способо обращать эффект, в том числе и с помощью химических соединений. Это позволяет оценить избирательность исходного воздействия и свидетельствует об адекватности наших представлений о том или ином биохимическом процессе.
Все клетки оснащены системой активного транспорта полиаминов, которая, по всей видимости, играет важную роль в регуляции гомеостаза полиаминов in vivo. Однако её локализация, строение и механизм переноса путресцина, спермидина и спермина через
клеточную мембрану до сих пор окончательно не установлены. Возможности использования радиоактивно меченых полиаминов для изучения кинетических характеристик их транспорта, механизма ингибирования их переноса по принципу обратной связи, потоков обмена между внутри и внеклеточным пулами полиаминов, а также процессов распределения экзогенных полиаминов в отдельных органах и тканях сильно ограничены из-за их достаточно быстрого взаимопревращения в клетке. Данное ограничение может быть устранено с использованием метаболически устойчивых миметиков полиаминов, аналогично тому, как это было сделано при изучении систем активного транспорта глюкозы и а-аминокислот с введением в практику метаболически стабильных З-О-метил-О-глюкозы и а-метилаланина, соответственно. Таким образом, метаболически устойчивые миметики полиаминов могут стать полезным инструментом исследования системы активного транспорта путресцина, спермидина и спермина.
Соответственно, первой задачей данной работы была разработка удобных способов получения ранее малодоступных рацемических а-метилполиаминов, о которых известно, что они являются плохими субстратами SSAT и способны выполнять некоторые функции полиаминов in vitro. Синтез неизвестных ранее оптических изомеров а-метилполиаминов и изучение возможностей их использования в качестве метаболически устойчивых миметиков спермидина и спермина in vitro и in vivo являлся второй задачей настоящей работы.
Биологические эффекты полиаминов и их аналогов определяются геометрией молекулы и положительным зарядом протонированных аминогрупп. В то время как зависимость биологических эффектов аналогов спермина и спермидина от их строения исследовалась весьма подробно, вклад зарядовой составляющей остается малоизученным. Заряд о дефицитные аналоги полиаминов оказались полезным инструментом в подобных исследованиях.
Рациональным подходом к созданию веществ этого типа является понижение основности аминогрупп при минимальном искажении геометрии молекулы. Учитывая данное ограничение, существует не много способов конструирования таких структур. Поэтому третьей задачей настоящей работы являлся дизайн и синтез оригинального заря до дефицитного аналога Spm и его биохимически значимых производных.
2. Обзор литературы.
Полиамины и их аналоги имеют, как правило, достаточно простую структуру, тем не менее, их синтез весьма сложен и трудоёмок. Это связано с монотонностью структуры целевых соединений и с необходимостью избирательной функционализации первичных и вторичных аминогрупп в одной молекуле. Кроме того, высокая полярность конечных и многих промежуточных соединений создает дополнительные проблемы при их выделении и очистке. Однако в связи с перспективностью использования аналогов полиаминов для лечения различных заболеваний, в том числе и для химиотерапии рака, за последние 20 лет были разработаны эффективные подходы к получению разнообразных соединений полиаминной природы.
Методы алкилирования
Наиболее распространённым реагентом для восстановления амидов в синтезе полиаминов являются комплексы диборана с THF или диметилсульфидом. ЛГ-Замещённые амиды чаще всего получают взаимодействем аминов с активированными эфирами карбоновых кислот или с самими кислотами в присутствие конденсирующих агентов. Этот подход был использован, например, при получении метаболически устойчивых аналогов природных полиаминов- 1-метилспермидина (17) и 1,12-диметилспермина (18) (Схема 16) [17]. Схема CbzHN. - CbzHN. NHCbz гтон H,NN NHCbz" " H,N г/ NH, "М% H2N (17) NH, CbzHN CbzHN. NHCbz " v H,N NH2- " 2 NH, i- DCC/HOBt/DMF; //- H2/Pd-C/MeOH; /7/- BH3THFATIF; Л»- HCl/MeOH. A -Cbz-путресцин ацилировали iV-Cbz-3-аминобутановой кислотой в присутствие DCC и гидроксибензотриазола. Защитные группы удаляли каталитическим гидрированием и полученный амид восстанавливали BH3THF до 1-метилспермидина.
Диметилспермин был получен конденсацией путресцина с двумя эквивалентами N-Cbz-3-аминобутановой кислоты с последующим удалением защитных групп и восстановлением амидных функций BH3THF. Недостатками этой схемы синтеза являются низкие выходы на стадиях конденсации и восстановления амидных групп, а также сложные процедуры выделения продуктов на последних стадиях. Схема 17 OEt 0 0 OEt О О OEt /- EtjN/бензол; «- LiAlH/THF; Ш- Н /Н20 /v- (СООН)2/Н20; v- ВаС12/Н20.
Иногда для восстановления амидов используют алюмогидрид лития (Схема 17) [18]. Диамиды (19) были получены конденсацией диацилхлоридов с 3-амино-1,1-диэтоксипропаном в присутствие триэтиламина. Восстановление полученных диамидов LLAIH4 в THF и последующий гидролиз ацетальных групп привели к диаминодиальдегидам (20). Использование ІЛАІНд, как правило, не приводит к увеличению выхода по сравнению с восстановлением ВНз THF, но в некоторых случаях упрощает выделение и очистку продукта.
Восстановление нитрилов.
Другим классом соединений, восстановление которых широко используется в синтезе полиаминов, являются нитрилы. Чаще всего восстанавливают продукты присоединения аминов или //-анионов к акрилонитрилу и его производным. Этого подход был использован, например, при получении набора дибензилтетраминов (21), проявляющих высокую противомалярийную активность (Схема 18) [19]. Схема NH2 4HC1 H-.N NH2 L J n NC H 11,111 CN (22) /v v- Ph. „N. H . Ph 4HC1 (21) /- CH2CHCN/EtOH; /i- Н2/РЮ2/АсОН; «7- HC1/H20; /v- PhCHO/H2/Pt02; v- HCl/MeOH.
Присоединение двух эквивалентов акрилонитрила к диаминоалканам и восстановление цианогрупп Н2/РЮг приводило ктетрааминам (22), обработка которых бензальдегидом и "one-pot" восстановление образующихся оснований Шиффа Н2/РЮ2 давали целевые дибензилтетраамины.
Для восстановления нитрилов применяют также каталитическое гидрирование на Ni-Ренея [13]. В некоторых случаях используют LiAlKj/THF [20] или NaBFk в присутствие солей переходных металлов [4]. Выбор способа восстановления зависит, в основном, от присутствия в молекуле других функциональных групп и предпочтительных условий выделения продукта.
Восстановление азидов.
Амины также могут быть получены восстановлением азидов различными способами. Как правило, реакции проходит в мягких условиях и с высоким выходом, но недостатком этого метода является высокая токсичность неорганических азидов и азотистоводородной кислоты. Ниже приведены примеры, илюстрирующие возможности применения азидов в химии полиаминов.
Для получения неметаболизирующего аналога спермидина- 1,1-диметилспермидина (23), в работе [21] была предложена следующая последовательность реакций (Схема 19). Схема NH? соон " - H7N /- NaN3/AcOH/H20; ii- Et3 HF/ClCOOEt; ш- BH3THF/THF. З-Азидо-3-метилбутановая кислоту (24) получали присоединением HN3 к З-метил-2 бутеновой кислоте. Конденсация (24) с путресцином в присутствие Et3N и ClCOOEt приводила к азидоамиду (25), который был восстановлен до 1,1-диметилспермидина кипячением с BH3THF.
При наличии в молекуле других групп, способных к восстановлению, например, кратных связей, используют такие мягкие восстановители как трифенилфосфин (Схема 20) [22]. ІЛАІН4 не восстанавливает азид (26) селективно и конечным продуктом является аминоалкен (27). Восстановление трифенилфосфином в смеси THF/НгО с высоким выходом приводило к аминоалкину (28).
В некоторых случаях 1-алкилзамещённые полиамины целесообразно получать восстановлением оксимов (Схема 21) [23, 19]. Так, дикетон (29), полученный присоединением N JSI -дибензил-1,8-диаминоктана к двум эквивалентам метилвинилкетона, был переведён в диоксим, восстановление которого LiAlH» и последующее удаление бензильных групп каталитическим гидрированием приводило к соединению (30), для которого было показано наличие противомалярийной активности. Однако этот подход не получил широкого распространения в синтезе полиаминов из-за низких выходов на стадии восстановления
Регуляция активности ферментов катаболизма полиаминов
Система метаболизма полиаминов тесно связана с превращениями орнитина и метионина и включает в себя несколько ферментов (Рис. 1). Избирательная регуляция активности этих ферментов широко используется для изменения внутриклеточной концентрации полиаминов, что важно, в том числе, и для изучения функций полиаминов в клетке. Соответствующие химические соединения, как правило, обладают выраженной биологической активностью. Опухолевые клетки имеют повышенный уровень полиаминов, по сравнению с нормальными. Также, полиамины необходимы для размножения паразитов, например, малярийного плазмодия и вирусов, включая HIV, что подчеркивает актуальность исследований в данной области.
Наиболее перспективными мишенями сначала представлялись ферменты биосинтеза -орнитиндекарбоксилаза [34, 2], S-аденозилметиониндекарбоксилаза [35], а также Spd- и Spm-синтазы [36].Однако оказалось, что для полного истощения запаса полиаминов в клетке одного лишь ингибирования их биосинтеза недостаточно, так как клетки оснащены системами активного транспорта Put, Spd и Spm, которые способны в значительной степени компенсировать дефицит эндогенных полиаминов. Поэтому в последние годы центр тяжести исследований сместился в сторону регуляции активности ферментов катаболизма полиаминов -спермидин/спермин-./У -ацетилтрансферазы и полиаминоксидазы.
Спермидин/спермин-ЛЛацетилтрансфераза Спермидин/спермин-Л -ацетилтрансфераза (SSAT, К.Ф. 2.3.1.57) является цитозольным гомотетрамерным СоА-зависимым ферментом с молекулярным весом около 80 кДа [37, 38], который избирательно ацетилирует первичные аминогруппы Spd и Spm, причем предпочтительным субстратом является Spd.
Реакция, катализируемая SSAT, протекает по упорядоченному "пинг-понг" механизму -субстрат связывается первым, а ацетилированный продукт отщепляется в последнюю очередь [39]. Участок связывания Ас-СоА находится в консервативной области из 20 аминокислот, которая начинается с Arg 101 и содержит последовательность RGFGIGS [40]. Остатки Arg в положениях 142 и 143 также необходимы для связывания Ас-СоА [41].
Поскольку молекула Spd несимметрична, возможно образование как М1-, так и Л/8-ацетильных производных (Рис. 2).
SSAT избирательно ацетилирует лишь аминопропильный фрагмент Spd, в то время как Spd-iV8- специфичная ацетилтрансфераза отлична от SSAT и локализована в клеточном ядре, где участвует в ацетилировании гистонов [42]. Этот фермент, в отличие от SSAT, не является индуцируемым, aA -AcSpd не расщепляется РАО и по мере накопления деацетилируется, либо экскретируется.
-Ацетилполиамины являются предпочтительными субстратами РАО и, в то же время, составляют основную экскретируемую из клеток форму полиаминов [43]. Таким образом, существует конкуренция между окислением и экспортом, и преобладание одного или другого процесса, по всей видимости, регулируется статусом роста клеток. Если полиамины необходимы для роста, то происходит их реутилизация посредством окисления yv -AcSpm до Spd и N -AcSpd до Put. В том случае, если рост клеток ограничен, превалирующим процессом становится экскреция ацетилполиаминов, что приводит к понижению суммарного внутриклеточного пула полиаминов [44]. SSAT считается ключевым ферментом катаболизма полиаминов. Активность и биосинтез этого короткоживущего фермента (время полужизни составляет 20-40 мин) строго регулируются на нескольких уровнях и могут быстро изменяться под действием различных факторов. В отличие от многих короткоживущих белков, SSAT не содержит PEST- фрагмента [45], однако концевая последовательность МАТЕЕ, по всей видимости, является его эквивалентом [46]. SSAT деградирует в 26 S протеосомах и этот процесс является убихитин-зависимым [46]. До сих пор описана лишь одна изоформа SSAT, которая способна катализировать перенос ацетильного остатка на полиамины [47].
Гомеостаз полиаминов регулируется по принципу обратной связи. Одним из наиболее важных и хорошо изученных примеров этого является увеличение клеточной активности SSAT в ответ на повышение внутриклеточного содержания полиаминов. Однако не только полиамины способны оказывать такой эффект и первые данные об индуцируемости SSAT были получены с использованием четыреххлористого углерода [48] и метилглиоксаль-бис-гуанилгидразона (MGBG) [49, 50], причем было установлено, что индукция SSAT требует как синтеза белка, так и РНК de novo [51]. В случае MGBG, Spd и Spm повышение активности является следствием и стабилизации самого фермента [50, 52].
Было показано, что клеточная активность SSAT возрастает под действием терминально бмс-алкилированных аналогов Spd и Spm, причем иногда и в тысячи раз [12, 1]. В последнем случае говорят о «супериндукции» SSAT, которая является результатом суперпозиции нескольких факторов: активации транскрипции и трансляции, стабилизации молекул мРНК и самого фермента [53]. Ингибирование роста клеток, а в некоторых случаях и развитие апоптоза, наблюдаемые при супериндукции SSAT, происходят, по видимому, по нескольким независимым механизмам, причем в зависимости от условий доминирующие пути могут различаться. Один из них связан с окислением образующихся ацетилполиаминов под действием РАО, происходящим с выделением токсичных для клеток перекиси водорода и акролеина. Недавно в регуляторном фрагменте гена SSAT человека был обнаружен полиамин-чувствительный элемент (poiyamine response element, PRE) [54]. Он связан с фактором транскрипции Nrf-2, который до сих пор обнаружен лишь в клетках, способных к супериндукции SSAT. Таким образом, нельзя исключить, что в регуляции активности SSAT могут участвовать Nrf-2 или аналогичные белки [55].
Новый изостерный зарядодефщитный аналог спермина (SpmTrien)
Анализ данных по биологической активности аналогов полиаминов показывает, что клеточные полиамин-связывающие сайты высокочувствительны даже к незначительным изменениям структуры аналога, и биологические свойства оптических изомеров аналогов полиаминов сильно отличаются. Так, среди диастереомеров 2,10-дигидрокси-Лг1,Лг11-диэтилнорспермина и 2,10-дигидрокси-Лг1-циклопропилметил-Лг11-этилнорспермина лишь один изомер каждого из веществ обладает способностью к супериндукции SSAT [103]. Аналог перспективного иммунодепрессанта-дезоксиспергуалина- содержит хиральный а-метилспермидиновый фрагмент, причем биологическая активность энантиомеров этого соединения сильно различается [104].
Поскольку aMeSpd, aMeSpm и a.a -N Spm содержат хиральные центры, можно ожидать, что их оптические изомеры будут по-разному узнаваться клеточными полиамин-связывающими сайтами и проявлять разную биологическую активность. Соответственно, они будут полезны для изучения биологических мишеней и клеточных функций Spd и Spm.
Для адаптации схем синтеза рацемических a-метилполиаминов к получению оптически чистых продуктов необходимы энантиомеры 3-аминобутанола. Известно несколько способов построения 3-аминобутанольного фрагмента с определенной конфигурацией хирального центра. Довольно хорошо разработаны методы получения оптически чистых р-аминокислот и их производных, которые далее могут быть восстановлены до спиртов. Эти методы в основном базируются на стереоселективном присоединении по Михаэлю, причем возможно использование как хиральных доноров, например, присоединение (R)- или (5)-1 фенилэтиламинов или их литиевых амидов к а,Р-ненасышеным эфирам [105, 106, 107, 108], так и хиральных акцепторов Михаэля, например, присоединение аминов к оптически чистым а,Р-ненасыщеным ацильным производным [109, 110, 111, 112, 113]. Кроме того, описано ферментативное разделение рацемических эфиров, амидов и ацильных производных 3-аминомасляной кислоты на энантиомеры [114].
Существует также несколько методов прямого стереоселективного синтеза 1,3-аминоспиртов, минуя стадию восстановления 3-аминобутирата, однако ни один из них не позволяет достичь энантиомерного избытка более 95% [115, 116, 117, 118, 119, 120].
Принципиально иная стратегия заключается в использовании доступных энантиомерно чистых веществ. Несмотря на известную ограниченность этого подхода, он хорошо работает, если структура целевого соединения не слишком сложна, как, например, в случае о метилполиаминов. В качестве оптически чистых исходных веществ широко используются природные а-ам и но кислоты и соответствующие им а-аминоспирты, которые могут быть подвергнуты разнообразным трансформациям без рацемизации [121,122, 123].
Для создания требуемого 3-аминобутанольного фрагмента мы использовали легкодоступные энантиомеры 2-аминопропанола (аланинола). Углеродный скелет удлиняли на 1 атом путем алкилирования цианид-иона мезилатом N-Boc- аланинола в DMSO при 40-45С [104]. Следует отметить необходимость тщательного контроля температуры реакционной смеси, поскольку при ее понижении реакция сильно замедляется, а при повышении возрастает скорость конкурирующего процесса р-элиминирования. Циано-группу в соединениях (XIV) и (XV) восстанавливали алюмогидридом лития в эфире при 0С, что без рацемизации приводило к аминам (XVI) и (XVII), которые превращали в о-нитрофенилсульфонильные (Ns) производные (XVIII) и (XIX). Эти энантиомерно чистые сульфамиды служили универсальными хиральными блоками для синтеза всех оптических изомеров ос-метилполиаминов.
Энантиомеры aMeSpd были получены из соединений (XVIII) и (XIX), которые алкилировали Лг-(4-йодбутил)фталимидом в DMF в присутствие поташа (Схема 38). Использование для алкилирования мезилата ./V-Boc-4-аминобутанола не приводит к требуемому продукту, по всей видимости, из-за внутримолекулярной циклизации этого реагента с образованием iV-Boc-пирролидина. Последующее удаление Ns-групп "one pot" приводило к дизащищенным aMeSpd (XX) и (XXI), которые выделяли колоночной хроматографией. После удаления защитных групп целевые (/?)- и (S)- изомеры aMeSpd (XXII) и (XXIII) были выделены в виде тригидрохлоридов с суммарными выходами 43% и 45%, соответственно, считая на 2 аминопропанол.
Для получения (J?)- и (5)-aMeSpm в соединения (XVIII) и (XIX) последовательно вводили бутильный и диаминопропильный фрагменты в соответствии со схемой 39. Для этого сульфамиды (XVIII) и (XIX) обрабатывали избытком 1-бром-4-хлорбутана в DMF в присутствие поташа, затем растворитель и часть непрореагировавшего 1-бром-4-хлорбутана отгоняли в вакууме, остаток суспендировали в ЕЮАс и осадок отфильтровывали. Расторитель отгоняли в вакууме, а оставшееся масло выдерживали в вакууме при 95С в течение 2 часов, что позволяло практически полностью избавиться от 1-бром-4-хлорбутана. Кипячение остатка с избытком Nal в ацетоне с высоким выходом приводило к алкилиодидам (XXIV) и (XXV), загрязненным небольшим количеством дииодбутана, который легко отделялся хроматографией на силикагеле.
Соединения (XXIV) и (XXV) вводили в реакцию с избытком 1,3-д нами но про пана в THF и образовавшиеся диамины (XXVI) и (XXVII) выделяли хроматографией на силикагеле. При этом наблюдалось незначительное (около 2 %) образование о-нитрофенил-1,3-диаминопропана в результате активированного нуклеофильного замещения сульфамидной группы под действием диаминопропана. Кроме того, диамины (XXVI) и (XXVII) оказались неустойчивы при хранении, вероятно также из-за внутри- или межмолекулярного замещения сульфамидной группы. Эти наблюдения вполне согласуются с тем, что Ns-группа легко удаляется под действием алкил- и арилсульфид-анионов, нуклеофильность которых значительно выше чем у аминогруппы.
Следует отметить, что для получения (R)- и (S)-aMeSpm иодиды (XXIV) и (XXV) можно использовать после получения без дополнительной очистки, так как продукты реакции дииодбутана с диаминопропаном легко отделяются колоночной хроматографией от целевых аминов (XXVI) и (XXVII).
Синтезы SpmTrien, его бис-этильного и .ионо-ацетильных производных
Синтезы рацемических aMeSpd, aMeSpm, a,a -Me2Spm и Ac-aMeSpd. З-Аминобутанол-1 (I). К суспензии 8.0 г (0.21 моль) ІЛАІНд в 150 мл абс. THF при охлаждении и перемешивании прибавляли по каплям раствор 13.5 г (0.103 моль) свежеперегнанного этилового эфира 3-аминобутановой кислоты в 50 мл абс. THF с такой скоростью, чтобы растворитель слабо кипел. По окончании прибавления реакционную смесь кипятили при перемешивании еще 3 ч, оставляли на ночь при комнатной температуре, и затем разлагали, осторожно прибавляя последовательно 11.4 мл ЬЬО, 10.6 мл 20% NaOH, 29.0 мл ЬЬО и 34.2 мл 40% NaOH. Органический слой отделяли, осадок экстрагировали горячим СНСЬ (4x80 мл), объединённые органические вытяжки сушили MgS04, растворитель упаривали и остаток перегоняли в вакууме. Получали 7.3 г (80 %) спирта (I), nD20 1.4537, т. кип. 108-109С/42мм Hg (лит. [145]: nD20 1.4543, т.кип. 73С/7 мм Hg). 1Н-ЯМР (CDCb): 3.79-3.68 (м, 2 Н, СШОН); 3.12 3.03 (м, 1 Н, CHNH2); 2.58 (уш.с, 3 Н, NH2+OH); 1.62-1.54 (м, 1 Н, СШСН2ОН); 1.50-1.40 (м, 1 Н, CtbCH2OH); 1.09 (д, 3 Н, J 6.52, СН3).
ЛЦБензилоксикарбонил)-3-аминобутанол-1 (II). К охлаждённому до 0С раствору 2.7 г (30 ммоль) соединения (I) в смеси 30 мл THF, 5 мл Н20 и 3.81 г (45 ммоль) NaHC03 при перемешивании прибавляли 4.65 мл (33 ммоль) Cbz-Cl в 5 порций с интервалом в 20 мин. Затем перемешивали еще 2 ч при 0С и 3 ч при комнатной температуре, водную фазу отделяли, экстрагировали СНСЬ (2x5 мл) и объединённые органические вытяжки упаривали в вакууме досуха. Остаток растворяли в 60 мл СНСЬ, промывали последовательно 1 М НС1 (2x25 мл), Н20 (2x25 мл) и 1 М NaHC03 (3x20 мл), сушили MgS04 и растворитель упаривали в вакууме досуха. Остаток растирали со смесью эфир-гексан (1:1) (2x40 мл), осадок отфильтровывали и после высушивания в вакууме над P2Os получали 6.03 г (90 %) Л -СЬг-аминоспирта (II), т.пл. 60-61 С (этилацетат-гексан), Я/0.47 (СНС13-МеОН, 9:1). Н-ЯМР (CDC13): 7.37-7.28 (м, 5 Н, СбН5); 5.09 (с, 2 Н, CH2Ph); 4.75 (уш.с, 1 Н, NHCbz); 4.01-3.93 (м, 1 Н, СН3СН); 3.67-3.59 (м, 2 Н, СЦЮН); 2.98 (уш.с, 1 Н, ОН); 1.83-1.72 (м, 1 Н, CHj CH2OH); 1.45-1.35 (м, 1 Н, СШСН2ОН), 1.20 (д, З Н, У 6.52, СН3). -(Бензилоксикарбонилі-І -диамино-З-азанонан (III). К охлаждённому до 0С раствору 5.51 г (24.7 ммоль) соединения (II) и 5.22 мл (37.5 моль) Et3N в 60 мл абс. СН2С12 прибавляли в течение 10 мин при перемешивании раствор 2.14 мл (27.5 ммоль) MsCl в 18 мл абс. СН2С12, затем перемешивали ещё 1 ч при 0С и 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь выливали в 40 мл 1 М NaHC03, органическую фазу отделяли, промывали последовательно Н20 (2x10 мл), 0.5 М H2S04 (3x35 мл), Н20 (2x10 мл) и нас NaCl (10 мл), сушили MgS04 и упаривали в вакууме досуха. Остаток растворяли в 40 мл абс. THF, охлаждали до 0С и в одну порцию к охлажденному раствору прибавляли 35.1 г (400 ммоль) 1,4-диаминобутана в 40 мл абс THF. Реакционную смесь выдерживали 6 ч при 0С, затем 16 ч при комнатной температуре
и затем избыток 1,4-диаминобутана отгоняли в вакууме. Остаток растворяли в смеси диоксан-25% NH4OH (9:1), полученный раствор делили на 3 части и каждую (7 мл) очищали хроматографией на колонке с SiC 2 (135 г), элюируя смесью диоксан-25% NH4OH (9:1), что приводило к 5.3 г [72 %, считая на спирт (II)] -Cbz-aMeSpd (III) в виде густого масла, R/0.15 (диоксан-25% NH4OH, 9:1). Н-ЯМР (CDC13): 7.36-7.28 (м, 5 Н, С6Н5); 5.58 (уш.с, 1 Н, NHCbz); 5.08 (с, 2 Н, CH2Ph); 3.81 (м, 1 Н, CbzNHCfcD; 2.69 (м, 2 Н, CHzNH); 2.65 (м, 2 Н, CHaNH); 2.57 (м, 2 Н, QbNH); 1.67 (м, 1 Н, CH(NHCbz)CH2); 1-53 (м, 1 Н, CH(NHCbz)Cbb); 1-49 (м, 2 Н, СНгСЬЬСНгСНг); 1.46 (м, 2 Н, СН2СН2СН2СН2); 1.40 (уш.с, 3 Н, NH + NH2); 1.17 (д, З Н, ./6.52, СНз). 13С-ЯМР (CDC13): 156.04 с; 136.85 с; 128.49 с; 128.01 с (2С); 66.39 т; 49.77 т; 46.43 т; 45.96 д; 42.11 т; 36.64 т; 31.57 т; 27.43 т; 21.25 к.
Тригидрохлорид 1,8-диамино-5-азанонана, aMeSpd (IV). К раствору 5.2 г (17.7 ммоль) соединения (III) в 40 мл смеси АсОН-МеОН (1:1) прибавляли -1.0 мл суспензии Pd черни в МеОН и гидрировали при атмосферном давлении. Pd чернь отфильтровывали, промывали МеОН и объединённые фильтраты упаривали в вакууме досуха. Остаток растворяли в ЕЮН, прибавляли 6.6 мл 7.0 М НС1, упаривали полученный раствор в вакууме досуха и остаток кристаллизовали из смеси МеОН с ЕЮН. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали холодным ЕЮН, сушили в вакууме над Р205/КОН и получали 4.23 г (89 %) aMeSpd (IV), т.пл. 191-192С (лит. [17]: 283С, разл. для лиофилизованного образца), Я/0.35 (н-ВиОН-АсОН-Ру-Н20,4:2:1:2). Найдено, %: С 35.83, Н 9.08, N 15.76. Cg NjCb. Вычислено, %: С 35.76, Н 9.00, N 15.64. Н-ЯМР (D20): 3.53 (м, 1 Н, СН3СН); 3.21 (м, 2 Н, CH(NH2)CH2CH2); 3.15 (м, 2 Н, NHCH2(CH2)3NH2); 3.07 (м, 2 Н, NH(CH2)3CfcbNH2); 2.16 (м, 1 Н, CH(NH2)CH2); 2.02 (м, 1 Н, CH(NH2)CH2); 1-86-1.74 (м, 4 Н, СШСШСНгМ-Ь); 1.36 (д, 3 Н, J 6.52, СН3). 13С-ЯМР (D20): 50.03 т; 48.36 д; 46.89 т; 41.85 т: 33.34 т; 26.85 т; 25.69 т; 20.38 к.
Л -(Бензилоксикарбонил)-8-амино-5-азанонанол (V). К охлаждённому до 0С раствору 3.34 г (15 ммоль) Л -СЬг-З-аминобутанола (II) и 2.61 мл (19 ммоль) Et3N в 40 мл абс. СН2С12 прибавляли при перемешивании в течение 15 мин раствор 1.24 мл (16 ммоль) Ms-Cl в 10 мл абс. СН2С12 и оставляли перемешиваться ещё 1 ч при 0С и 1 ч при комнатной температуре. К реакционной смеси прибавляли 25 мл 1 М раствора ЫаНСОз, органическую фазу отделяли, промывали последовательно Н20 (10 мл), 0.5 М H2SO4 (3x25 мл), Н20 (10 мл), 1 М NaHCOj (20 мл), насыщ. NaCl (10 мл), сушили MgSCU и упаривали в вакууме досуха. К остатку в 20 мл абс. THF прибавляли в один прием раствор 8.9 г (100 ммоль) 4-аминобутанола в 10 мл абс. THF и оставляли на ночь при 50С. Избыток 4-аминобутанола отгоняли в вакууме, остаток растворяли в 20 мл 1 М NaOH, экстрагировали СНСЬ (25 мл), объединенные вытяжки упаривали в вакууме досуха, а остаток хроматографировали на колонке с Si02 (135 г), элюируя смесью диоксан-25% NH4OH, 94:6. Растворитель упаривали в вакууме, остаток высушивали в вакууме над Р2О5 и получали 3.22 г (73%) аминоспирта (V) в виде густого масла; R/0A5 (диоксан-25% NH4OH, 9:1). Н-ЯМР (CDC13): 7.40-7.29 (5 Н, м, С6Н5); 5.09 (2 Н, с, CHj-Ph); 5.03 (0.5 Н, с, NHCbz); 5.01 (с, 0.5Н, NHCbz); 3.85-3.77 (1 Н, м, СН3СН); 3.57 (2 Н, т, J6.32, СЬЬОН); 2.70-2.55 (4 Н, м, CH2NHCH2); 1.76-1.51 (8 Н, м, ЫН+ОН+СШСН(СНз)ШСЬ2+СН2СШСН2СН2); 1.18 (3 Н, д, J 6.54, СНз).
