Введение к работе
Актуальность проблемы Семейство Poxvindae состоит из подсемейств вирусов позвоночных (Chordopoxvirtnae) и вирусов насекомых (Entomopoxvirtnae) В составе Chordopoxvinnae известны восемь родов и некоторые неклассифицированные вирусы, в род Avtpoxvirus входят вирусы птиц, а остальные, за исключением вируса оспы крокодилов, являются вирусами млекопитающих Среди последних наиболее хорошо изучены вирусы рода Orthopoxvirus Это обусловлено тем, что в состав данного рода входят такие патогенные для человека вирусы, как вирус натуральной оспы (ВНО), вирус оспы обезьян, вирус оспы коров, а также вирус осповакцины, являющийся живой вакциной против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций Кроме вышеперечисленных в род Orthopoxvirus входят вирус оспы верблюдов, вирус эктромелиии, татерапоксвирус и поксвирусы полевок и енотов
Ортопоксвирусы представляют собой большую группу близкородственных вирусов, демонстрирующих различия по тяжести вызываемых ими заболеваний, и имеют различающийся круг чувствительных к ним животных Эволюционная связь разных видов ортопоксвирусов пока не ясна.
В природе циркулируют такие близкие родственники вируса натуральной оспы, как патогенные для человека вирусы оспы обезьян, оспы коров и некоторые другие непатогеніше для человека ортопоксвирусы Вирус оспы обезьян обусловливает оспоподобное заболевание людей, которое в ряде случаев завершается летальным исходом Вирус оспы коров у иммунодефицитных людей также может вызывать генерализованную инфекцию с летальным исходом Оба этих вируса отличаются от ВНО тем, что вызываемые ими инфекции не приводят к масштабным эпидемическим вспышкам среди людей (малоконтагиозны) Однако в процессе эволюционных изменений в природе данные вирусы могут приобрести такие свойства В свете этого важно провести сравнительное изучение организации отдельных генов ортопоксвирусов для выяснения того, происходит эволюция генов независимо друг от друга, или имеются общие закономерности их изменений, определить границы изменчивости этих генов, а также изучить эволюционные взаимосвязи протяженных районов геномов ортопоксвирусов и оценить скорость их эволюции
В современных исследованиях временная шкала эволюции животных основывается на палеонтологических данных и, проводя сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей консервативных генов животных разных таксонов, можно вычислить удельную частоту замен, произошедших в изучаемых локусах в процессе дивергенции этих таксонов от прародителя В то же время, изучение молекулярной эволюции ДНК-содержащих вирусов является сложной задачей В отличие от быстро эволюционирующих РНК-содержащих вирусов, объективная оценка скорости изменчивости геномов ДНК-содержащих вирусов, как правило, отсутствует Анализ эволюционных взаимосвязей ДНК-содержащих вирусов разных таксонов приводит в большинстве случаев к построению филогенетических деревьев, которые не имеют масштаба времени Однако, существует уникальная ситуация с известным датированием заноса вируса натуральной оспы из Западной Африки в Южную Америку в XVI веке что может позволить рассчитать скорость накопления мутаций в геноме ВНО и в целом временную шкалу эволюции ортопоксвирусов
Анализ особенностей молекулярной эволюции ортопоксвирусов позволяет прогнозировать появление новых ортопоксвирусов и дальнейшее эволюционное изменение ныне существующих видов ортопоксвирусов
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение закономерностей молекулярной эволюции ортопоксвирусов В ходе работы решались следующие задачи 1 Определение нуклеотидной последовательности генов гемагглютинина и белка слияния для большого набора штаммов различных ортопоксвирусов
Филогенетический и структурный сравнительный анализ последовательностей гемагглютинина и вирионного белка слияния ортопоксвирусов
Исследование эволюционных взаимосвязей членов рода Orthopoxvirus на основе нуклеотидных последовательностей протяженной центральной консервативной области генома 42 штаммов ортопоксвирусов
Оценка скорости молекулярной эволюции ортопоксвирусов на основе Байесовского метода датирования
Определение нуклеотидных последовательностей двух протяженных сегментов концевых вариабельных районов генома 22 штаммов вируса натуральной оспы Российской коллекции
Филогенетический и структурный анализ генетического разнообразия штаммов ВНО на основе полученных и ранее опубликованных данных о нуклеотидных последовательностях двух изучаемых сегментов генома вируса натуральной оспы
Научная новизна и практическая значимость работы. Определена нуклеотидная последовательность генов гемагглютинина и белка слияния различных штаммов ортопоксвирусов При анализе схемы филогенетических связей изученных нами штаммов ортопоксвирусов по нуклеотидным последовательностям этих генов выявлено, что они распадаются на естественные группы вирусов по видовому признаку, за исключением изолятов вируса оспы коров, что позволило нам впервые указать на наличие подтипов у данного вида ортопоксвируса. Важным результатом выполненного исследования является то, что при сравнении разных генов могут обнаруживаться различающиеся филогенетические связи между одними и теми же ортопоксвирусами Это указывает на то, что разные виды ортопоксвирусов в процессе своей эволюции могли обмениваться между собой как фрагментами генов, так и более крупными областями своих геномов
На базе выполненного подробного анализа первичных структур двух генов ортопоксвирусов предложено использовать последовательность гена A27L, кодирующего консервативный вирионный белок, для разработки молекулярных методов диагностики и дифференциации ортопоксвирусов
На основе нуклеотидных последовательностей центральной консервативной области генома, содержащей 102 гена, 42 штаммов ортопоксвирусов проведено изучение эволюционной истории рода Orthopoxvirus С использованием этих данных впервые проведена Байесова оценка времени происхождения различных видов ортопоксвирусов Впервые оценена скорость накопления мутаций в геноме ортопоксвирусов, которая составила 1 7-4 вхЮ"6 замен нуклеотидов на сайт в год
Осуществлено определение нуклеотидной последовательности двух вариабельных сегментов генома набора штаммов ВНО Российской коллекции Проанализировано более 540 т п н для 22 штаммов ВНО, что позволили провести детальное изучение структурной организации этих локусов вирусного генома.
Полученные нами и опубликованные данные были использованы для проведения расширенного филогенетического исследования 70 штаммов ВНО, относящихся к разным подтипам вируса и выделенных в разное время в различных географических районах мира. Определены наиболее гетерогенные локусы в двух изученных сегментах генома ВНО Впервые обнаружено, что они, в основном, расположены в районах мутационно разрушенных открытых рамок трансляции вируса-предшественника Впервые обнаружено эволюционное родство географически далеко разнесенных азиатских дальневосточных и западноафриканских вариантов ВНО
Апробация работы. По материалы диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых изданиях Результаты работы были представлены на международных конференциях и опубликованы в их материалах «The Third International Conference on Biomformatics of Genome Regulation and Structure» (Россия, Новосибирск, 2002), «Fifth
International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (Россия, Новосибирск, 2006), и на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика-2007» (Россия, Москва, 2007), а также на Совещаниях Консультативного комитета ВОЗ по изучению вируса натуральной оспы (2006,2007)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» Работа изложена на 164 страницах, содержит 37 рисунков и 17 таблиц Библиография включает 243 литературных источника
