Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкий спектр функций нуклеиновых кислот в живых системах определяется структурным разнообразием этого класса природных соединений. Помимо канонической антипараллельной двойной спирали Уотсона-Крика природные полинуклеотидные цепи образуют трех- и четырехцепочечные структуры различных типов, параллельные дуплексы, рибозимы и ДНК-зимы. В качестве отдельного структурного семейства можно выделить сложные синтетические надмолекулярные олигонуклеотидные конструкции, в которых могут быть реализованы различные типы взаимодействий.
Из всех вышеперечисленных форм организации нуклеиновых кислот, вне всякого сомнения, наиболее важной является двойная спираль ДНК. Огромное значение исследований дуплексов ДНК обусловлено тем, что комплементарное узнавание в двойной спирали является основой современной молекулярной биологии и таких ее методов и приложений как полимеразная цепная реакция, биологические микрочипы, гибридизационный анализ, молекулярная диагностика.
Единственной структурой, сопоставимой с дуплексами ДНК по количеству посвященных ей исследований, является тройная спираль или триплексы. Открытые лишь через три года после опубликования структуры двойной спирали, трехцепочечные комплексы до настоящего времени являются объектом повышенного интереса, что обусловлено главным образом потенциальной возможностью использования синтетических олигонуклеотидов для контроля экпрессии генов на уровне транскрипции за счет связывания с дву спиральной ДНК. Другим важным аспектом в исследованиях этих структур является изучение роли и функций параллельных триплексов ДНК в генетической рекомбинации. Настоящая работа включает литературный обзор, полностью посвященный рассмотрению триплексов ДНК.
Доступность синтетических олигонуклеотидов вывела как биологические, так и физико-химические исследования дуплексов и триплексов ДНК на новый уровень. С середины 80-х появилась возможность детально исследовать поведение этих структур различными методами. Однако, уже скоро стало очевидно, что исследования только природных олигонуклеотидных цепей не позволяют в полной мере оценить влияние различных факторов на стабильность и специфичность образования дуплексов и триплексов ДНК. Кроме того, образование триплексов ДНК из природных цепей ограничено полипуриновыми и полипиримидиновыми участками, а также требованием протонирования цитидинов в пиримидиновых антипараллельных триплексах.
Возможности синтетической олигонуклеотидной химии в настоящее время позволяют в широких пределах варьировать состав и свойства олигонуклеотидов. Огромное количество методов модификации олигонуклеотидов предоставляет возможности для целенаправленного изменения свойств взаимодействующих цепей. Появилась уникальная возможность селективной трансформации цепей для оценки влияния тех или иных факторов на свойства образующихся комплексов. Модифицированные олигонуклеотиды предоставляют недоступную ранее возможность моделирования новых типов взаимодействиий нуклеиновых кислот. Методы современной олигонуклеотидной химии позволяют модифицировать или полностью замещать сахарофосфат и нуклеиновые основания, синтезировать самые разнообразные конъюгаты олигонуклеотидов, проводить их иммобилизацию на поверхности или в объеме полимера, вводить в цепь ненуклеотидые фрагменты.
Целью настоящей работы являлось комплексное физико-химическое исследование дуплексов и триплексов ДНК с привлечением синтетических методов к построению олигонуклеотидных моделей и при разработке платформы анализа.
В ходе выполнения работы были решены следующие задачи:
-
Разработаны синтетические подходы к иммобилизации олигонуклеотидов и ДНК в объеме гидрофильного полимера. Предложена синтетическая платформа для параллельного анализа взаимодействий нуклеотидных цепей на гидрогелевых микрочипах.
-
Осуществлен параллельный анализ образования модифицированных дуплексов с использованием полной матрицы иммобилизованных гексануклеотидов (4096 элементов). Исследовано влияние типа модификаций на стабильность образующихся коротких дуплексов ДНК и специфичность их образования.
-
Проведено исследование влияния гидрофобных и ионных модификаций олигонуклеотидных цепей на стабильность и структуру дуплексов ДНК.
-
Проведен выбор адекватных олигонуклеотидных моделей, содержащих модифицированные цепи, для исследования новых и известных типов триплексов ДНК. Реализован новый принцип построения триплексов ДНК, позволяющий адресовать неприродные синтетические олигонуклеотиды к произвольной последовательности ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Рассмотренные в работе подходы к разработке уникальной платформы анализа и построению моделей в физико-химических исследованиях нуклеиновых кислот и полученные результаты имеют приоритетный характер и открывают новое направление исследований.
Физико-химические исследования модифицированных дуплексов ДНК осуществлены как традиционными методами, так и с привлечением новых подходов, основанных на использовании параллельных методов анализа. Разработка синтетических платформ для реализации этих новых подходов представляется одним из наиболее значимых результатов настоящего исследования. Предложенные в настоящей работе методы иммобилизации олигонуклеотидов в сшитых гидрофильных полимерах являются базовыми для нескольких поколений олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов. Три принципиально различных подхода к иммобилизации предоставляют возможность выбора технологического решения при изготовлении гидрогелевых трехмерных микрочипов -традиционная иммобилизация, фотонаправленный синтез или сополимеризация модифицированных олигонуклеотидов с акриловыми мономерами. Параллельный анализ образования дуплексов на олигонуклеотидных микрочипах широко используется в настоящее время для решения широкого круга биологических и диагностических задач. Однако, возможности этого метода как инструмента физико-химических исследований все еще остаются вне поля зрения исследователей. В настоящей работе впервые представлен параллельный физико-химический анализ образования модифицированных дуплексов ДНК на матрице 4096 иммобилизованных гексануклеотидов.
Проведен синтез и физико-химические исследования дуплексов ДНК, содержащих неприродные цепи, с целью проследить влияние гидрофобных или ионных модификаций на стабильность двойной спирали. Полученные результаты представляют безусловный интерес при конструировании олигонуклеотидных проб для гибридизационного анализа.
В ходе выполнения работы впервые было экспериментально доказано образование нового типа триплексов ДНК с химерной а,Р-третьей цепью. Новый подход к построению третьей цепи - с использованием неприродных аномеров нуклеозидов - позволяет адресовать триплекс-образующие олигонуклеотиды к произвольной последовательности ДНК и не ограничивается полипуриновыми и полипиримидиновыми участками. В работе рассмотрены свойства различных типов триплексов, исследованных с использованием универсальных синтетических конструкций. Предложенный подход к построению внутримолекулярных моделей триплексов ДНК был реализован впервые и обеспечивает заметное повышение стабильности, задает взаимную ориентацию цепей, упрощает термодинамический анализ и сводит к минимуму влияние петли. Благодаря использованию таких моделей удалось экпериментально получить и охарактеризовать параллельный триплекс рекомбинантного типа или R-форму ДНК. Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных и
российских конференциях: DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV,
VII, VIII (США, 1994, 1999 и 2000), XIII Internationa Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications» (Франция, 1998), XV международная конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 8
патентов.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 265 страницах
