Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Происхождение бобово-ризобиального симбиоза 13
1.2. Специфичность и механизм становления бобово-ризобиального симбиоза 14
1.3. Сигналлинг между ризобиями и бобовым растением 17
1.4. Лектины бобовых растений 26
1.4.1. Роль лектина в бобово-ризобиальном симбиозе 26
1.4.2. Структура и специфичность лектинов 35
1.5. Особенности организации генома клубеньковых бактерий 43
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований 47
2.2. Выделение и очистка ДНК растений 48
2.3. Выделение и очистка ДНК ризобий 49
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК 49
2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК... 51
2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 52
2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 53
2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 54
2.9. Элюция ДНК из агарозных гелей 54
2.10. Клонирование фрагментов генов лектина бобовых растений 55
2.11. Полимеразная цепная реакция 56
2.12. Подготовка компетентных клеток 57
2.13. Трансформация компетентных клеток Е.соН плазмиднои ДНК 58
2.14. Секвенирование ДНК ферментативным методом 58
2.15. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез) 60
2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 61
2.17. Бактериальные штаммы и фагмидные вектора 61
2.18. Экспрессия белка и его выделение 61
2.19 Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях 63
2.20. Реакции гемагглютинации 64
2.21. Реактивы и материалы 64
2.22. Составы использованных стандартных растворов 66
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Анализ углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений 67
3.1.1. Клонирование и секвенирование фрагментов гена лектина бобовых растений 67
3.1.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина козлятника восточного и лекарственного 69
3.1.3. Сравнительный анализ углеводсвязывающих аминокислотных последовательностей лектинов бобовых растений 78
3.1.4. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина клевера белого, лугового и волосистоголового 81
3.2. Создание гибридных белков лектина и анализ их углеводсвязывающих свойств 85
3.2.1. Создание гибридных конструкций гена лектина 87
3.2.2. Синтез лектинов в клетках E.coli и их выделение 91
3.2.3. Анализ специфичности лектинов 96
3.3. Анализ влияния природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями 103
3.3.1 Экзогенная обработка лектинами бактерий в ризосфере бобовых растений 104
3.3.2 Влияние лектинов PSL, GOL и PSL/MAL на симбиоз Astragalus cicer и Galega oriental is с ризобиями 107
3.3.3 Влияние лектинов PSL, PSL/AGL на симбиоз Medicago sativa с ризобиями 109
Заключение 119
Выводы 122
Список литературы 124
- Специфичность и механизм становления бобово-ризобиального симбиоза
- Особенности организации генома клубеньковых бактерий
- Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях
- Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина козлятника восточного и лекарственного
Введение к работе
высокому уровню азотфиксации, а, стало быть, и к увеличению урожайности сельскохозяйственных культур. Эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов позволяют оценивать роль этих белков, однако такого рода исследования довольно сложны. При этом в настоящее время сведения о полноразмерных генах бобовых лектинов весьма ограничены и, кроме того, процедура трансформации бобовых растений представляет собой достаточно трудоемкий процесс. Один из вариантов решения данной проблемы заключается в изучении симбиотической роли лектинов при экзогенной обработке ими растений и микроорганизмов. Так, удобным инструментом для подобных исследований являются бобовые лектины, полученные с применением прокариотических экспрессионных систем. При том что возможности использования этих систем таковы, что они позволяют нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами для исследования функционально значимых углеводсвязывающих областей, определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений.
Цели и задачи исследования. Целями данной работы являлось изучение структурных особенностей углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений, создание гибридных лектинов и исследование их углеводсвязывающих свойств, а также изучение влияния таких лектинов на становление симбиоза между бобовым растением и ризобиями.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
1. Клонировать и секвенировать углеводсвязывающие области генов лектинов
бобовых растений;
2. Провести сравнительный анализ как секвенированных нами так и
имеющихся в Международном банке данных нуклеотидных и аминокислотных
последовательностей углеводсвязывающих областей бобовых лектинов;
3. Исследовать значение лектина в существовании двух групп инокуляции
Galega officinalis - Rhizobium galegae bv. officinalis и Galega orientalis - Rizobiwn
galegae bv. orientalis;
4. Сконструировать гибридные лектины на основе полноразмерного гена
лектина гороха с измененной специфичностью к углеводам путем замещения
углеводсвязывающего участка этого белка гомологичными участками генов
лектинов других бобовых растений;
Подобрать условия экспрессии гибридных генов лектинов в клетках E.coli и получения функционально активных белков;
Исследовать углеводсвязывающие свойства гибридных лектинов;
7. Оценить влияние природных и гибридных лектинов на становление
симбиоза бобовых растений с различными ризобиями.
Научная новизна. Обнаружено, что лектины бобовых растений одной группы перекрестной инокуляции имеют формируемую их углеводсвязывающими последовательностями (УСП) сходную специфичность к простым сахаридам. Показано, что в УСП лектинов присутствуют консервативные аминокислоты, определяющие специфичность связывания лектина с ризобиальными рецепторами, что указывает на участие углеводсвязывающего участка лектина и в формировании специфичности к сложным сахаридам, из чего следует, что специфичность к моносахаридам является необходимым, но не достаточным условием, чтобы лектины специфично связывались с поверхностными полисахаридами ризобий.
Впервые показано, что лектин является одним из критических факторов, обусловливающих существование двух групп инокуляции G. officinalis - R. galegae bv. officinalis и G. orientalis - R. galegae bv. orientalis. Сходство в строении Nod-факторов биоваров R. galegae и различия в строении лектинов козлятника восточного и козлятника лекарственного можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза.
Впервые секвенированы фрагменты генов лектина Trifolium repens, Т. pratense и Т. trichocephalum. Обнаружено, что эти растения из одной группы перекрестной инокуляции имеют, тем не менее, совершенно разные углеводсвязывающие последовательности лектинов. На филогенетическом древе углеводсвязывающих
доменов лектинов, клевер белый образует компактный кластер с донниками белым и лекарственным, клевер же луговой далеко отстоит от представителей Trifoleae, тогда как сравнительный анализ УСП на нуклеотидном уровне и древо, основанное на последовательностях внутренних транскрибируемых спейсеров генов рРНК, свидетельствуют о том, что луговой клевер входит в группу Trifolium sp.
Впервые созданы уникальные гибридные конструкции, представляющие собой полноразмерный ген лектина гороха с замещенными углеводсвязывающими участками из генов Т. pratense, Onobrychis arenaria, М. albus (psl/mal), Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Синтезируемые в клетках E.coli гибридные лектины PSL/AGL и PSL/MAL связывали сахариды и вызывали агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и ассоциации субъединиц. Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов М. albus и A. glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам, что свидетельствует о формировании углеводе вязывающим пептидом лектинов аффинности к простым сахаридам.
Впервые показано, что лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, вызывающие специфические реакции симбиоза.
При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий из клубеньков Astragalus cicer (идентифицированных нами по генам 16S рРНК как микроорганизмы, близкие к Agrobacterium tumefaciens) в ризосфере люцерны впервые наблюдали нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков. Это свидетельствует о том, что лектин является одним из критических факторов в данной симбиотической системе.
Практическая значимость. Знания о закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами. Разработанная нами стратегия изменения углевосвязывающих свойств лектинов позволяет моделировать лектины с
разнообразной специфичностью, что может найти применение в биотехнологии и фармакологии.
Гибридные лектины можно использовать для исследований физиологических свойств этого белка в бобово-ризобиальных взаимодействиях, более того, они способны расширять специфичность растений к ризобиям, то есть увеличивать круг микросимбионтов, из которых растения могут выбрать наилучшего партнера для азотфиксации, что может привести к росту урожайности сельскохозяйственных культур.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001 г.); на 6-ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002 г.); на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002 г.); на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004 г.); «Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». Пущино, 2004.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны фантами РФФИ (№ 04-04-48884), РФФИ-Агидель (№ 02-04-97903), грантом Программы поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-2217.2003.4).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL, GenBank и DDBJ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 148 страницах, содержит 3 таблицы и 19 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 249 источника (15 отечественных и 234 зарубежных).
Специфичность и механизм становления бобово-ризобиального симбиоза
В формировании клубенька и развитии симбиоза можно выделить три основных этапа, состоящих из достаточно хорошо морфологически очерченных стадий. Первый этап - преинфекция, в ходе которой ризобий вступают в контакт с бобовым растением и вызывают у него специфические реакции узнавания. При этом происходит сложный обмен сигналами между симбионтами, наблюдается искривление корневых волосков растения-хозяина и закладка зачатка клубенька за счет деления клеток кортекса корня. На этом этапе выделяют стадии колонизации бактериями ризопланы растения-хозяина, в результате которой их численность в прикорневой зоне возрастает на 3 - 4 порядка, и прикрепления бактерий к определенным участкам корневого волоска (инфекционным сайтам) за счет взаимодействия поверхностных глюканов или липополисахаридов с растительными гликопротеинами (лектинами) (Dazzo, Truchet, 1983; Diaz et al., 1989; Kijne et al., 1992). Прикрепление бактерий к корневым волоскам представляет собой двустадийный процесс. На первой стадии единичные ризобии свободно прикрепляются к инфекционным сайтам; на второй стадии происходит аккумуляция бактериальных клеток и формирование «кэпа» за счет жесткого прикрепления ризобии с помощью целлюлозных фибрилл (R. legnminosarum) (Smit et al., 1987) или белковых фимбрий (В. japonicum) (Vesper, Bauer, 1986) к корневым волоскам. Именно на этой стадии развития симбиоза закладывается специфичность узнавания и взаимодействия между ризобией и растением-хозяином. (В следующем разделе этот этап будет рассмотрен более подробно).
На втором этапе бактерии проникают внутрь корневого волоска и инфицируют бобовое растение, вызывая формирование видимой морфологической структуры - клубенька. Он начинается с образования своеобразной полости внутри корневого волоска - инфекционной нити, возникающей за счет совместного действия гидролитических ферментов обоих партнеров симбиоза. На месте гидролиза клеточной стенки происходит своеобразное вдавливание плазматической мембраны, вследствие чего формируется полость, куда проникают бактерии (Callaham, Torrey, 1981). Растение реагирует на это построением новой клеточной стенки вокруг образовавшейся инфекционной нити. Таким образом, стенки этой полости имеют растительное происхождение, а ее содержимое (матрикс) состоит из полисахаридов, выделяемых интенсивно размножающимися бактериями (Turgeon, Bauer, 1985). Состав клеточной стенки инфекционной нити несколько отличается от таковых других органов растения. Так, в их состав входят пролин-богатые нодулиновые белки (Sheres et al., 1990). Инфекционная нить по типу верхушечного роста растет в сторону зачатка клубенька, образованного делением клеток картекса корня (Libbenga, Harkes, 1973; Wood, Newcomb, 1989).
Следует отметить, что далеко не все инфекционные нити ведут к образованию клубеньков. Так, например, у люцерны при инокуляции ризобиями искривляется около 40% корневых волосков, но лишь в незначительной части волосков (2,5%) происходит формирование инфекционной нити, и только 1,5% в конечном итоге дают начало развитию клубеньков. Основная часть нитей абортирует, в результате чего бактерии, содержащиеся в них, оказываются заключенными в специальную капсулу и перестают размножаться (Симаров и др., 1990). В случае нормального морфогенеза инфекционная нить за 2 - 3 сут достигает основания корневого волоска. Размножающиеся в инфекционной нити бактерии вызывают пролиферацию и последующую полиплоидизацию клеток растительной меристемы, что выражается в появлении видимых выростов на корнях бобовых растений. По мере разрастания меристемы происходит разветвление инфекционной нити, а выросты приобретают специфичные для разных бобовых формы - от палочковидных до шароподобных (Яковлев, 1991).
На следующей стадии бактерии переходят из инфекционной нити в цитоплазму растительной клетки. Здесь бактерии интенсивно размножаются и окружаются дополнительными мембранами, внутри которых у разных бобовых содержится различное число клеток микросимбионта (по одной у сои и вигны, по 5 -10 у люцерны, клевера). Ризобии при этом еще сохраняют свои размеры и палочковидную форму, но утрачивают жгутики (Симаров и др., 1990). Процесс инфицирования заканчивается примерно через 3-4 недели после инокуляции превращением ризобий в особые симбиотические формы — бактероиды. Эти клетки имеют значительно большие размеры, чем свободноживущие бактерии (в 3 - 5 раз), а их форма варьирует от шаро- и грушевидной (у клевера) до вильчатой и ветвистой (у гороха). У многих видов ризобий морфологические и биохимические изменения носят необратимый характер, что дает основание рассматривать бактероиды в качестве временных азотфиксирующих органелл растительных клеток (Мишустин, Шильникова, 1973). Однако в клубеньках всегда сохраняется значительное число недифференцированных бактерий, которые по мере гибели отработанных бактероидов, дают начало новым, а при отмирании клубеньков попадают в почву, где медленно размножаются, живя на положении сапрофитов. При следующем посеве бобовых растений эти бактерии вновь заражают их корни.
Несмотря на глубокую клеточную дифференцировку, бобово-ризобиальный симбиоз является для обоих партнеров чисто факультативным: ризобии способны неограниченно долго существовать ex planta в качестве одного из обычных компонентов сапрофитной почвенной микрофлоры, а бобовые растения могут нормально развиваться за счет ассимиляции минеральных или органических азотных соединений.
Эволюция бобово-ризобиального симбиоза проходила с повышением специфичности взаимодействия партнеров, обусловившая увеличение азотфиксирующей активности (Парийская, Клевенская, 1979).
Около 90% видам бобовых растений произрастающие в тропиках характерно малоспецифическое взаимодействие со своими партнерами. Например, были выявлены штаммы ризобий, способные вступать в эффективный симбиоз с видами из всех трех подсемейств семейства Legnminosae (Allen, Allen, 1981) или даже со многими бобовыми и также с небобовым растением Parasponia (Becking, 1992), однако азотфиксирующая активность таких симбиозов обычно невелика. Для бобовых же умеренных широт, где обитают наиболее специализированные и эволюционно молодые представители подсемейства мотыльковых, типично высокоспецифичное взаимодействие по типу «групп перекрестной инокуляции», при котором ризобий определенного вида или даже биотипа вступают в эффективный симбиоз с представителями лишь определенного рода или нескольких близких родов растений (Проворов, 1985). Сравнительный анализ ультраструктуры симбиотического аппарата у бобовых показал, что в ходе их эволюции происходило усложнение организации клубеньков и механизмов их инфицирования ризобиями, повышение степени дифференцированности бактероидов и усиление их контакта с растительной клеткой (Sprent, Raven, 1992).
Особенности организации генома клубеньковых бактерий
Множество данных последних лет свидетельствуют об эволюционной гетерогенности клубеньковых бактерий, которые возможно лишь отдаленно филогенетически связанны друг с другом (Young, 1992a,b; 1993). Очевидно, что организация генома оказывает существенное влияние на эволюцию этих микроорганизмов, имеющая для того ряд особенностей. Во-первых, присутствие в геноме значительного количества внехромосомной ДНК. Во-вторых, сцепленное расположение «симбиотических» генов клубеньковых бактерий, нередко на «симбиотической» (pSym) плазмиде. И в третьих, наличие большого числа повторяющихся последовательностей (Новикова, 1996).
Значительная часть генетического материала ризобий расположена на внехромосомных элементах. Выявлено, что число плазмид у быстрорастущих штаммов может варьировать от 0 до 10, а их молекулярная масса - от 100 до 2000 МДа (Симаров и др., 1990). Наиболее крупные плазмиды, так называемые мегаплазмиды, обнаружены у ризобий люцерны и козлятника. То есть, значительная доля генетического материала клубеньковых бактерий (до 30 - 50% в случае R. meliloti) локализована на довольно лабильных репликонах (Prakash et al., 1986; Selenskarajkova et al., 1990; Honeycutt et al., 1993). Большинство генов, ответственных за становление симбиотических взаимоотношений, у быстрорастущих штаммов расположены на pSym плазмидах, обмен которыми в лабораторных или природных условиях может приводить к появлению новых штаммов с измененными симбиотическими признаками (Zurkowski, 1982). Например при интродукции pSym 9 плазмиды R. phaseoli, несущей гены нодуляции (nod), азотфиксации (fix), меланина (met) и хозяин-специфические гены (hsp bean), в R. trifolii и A. tumefaciens, трансконьюганты были способны нодулировать фасоль (P. vidgaris) с образованием клубеньков (Hooykaas et al., 1985). Трасформация R. trifolii IncP плазмидой, несущей гены ризобий люцерны nodFE, nodG и nodH приводила к тому, что трансформант способен был вызывать формирование клубеньков на люцерне (Debelle et al., 1988). Введение плазмид pBRJAN или pJB5JI, несущие гены специфичной нодуляции и азотфиксации клевера и гороха соответственно в S. meliloti (Nod-, Нас-), восстанавливало его способность нодулировать люцерну (Djordjevic et al., 1983). Вообще pSym плазмиды бактерий R. leguminosarum характеризуются крайней своей подвижностью в природных условиях при чем не только среди штаммов одного вида но и, как экспериментально показано, S. meliloti может быть реципиентом этих плазмид. В отличие от быстрорастущих ризобий, sym гены у штаммов Bradyrhizobium и Azorhizobium расположены на хромосоме.
Симбиотические гены ответственные за «узнавание» растением микросимбионта (/гяи-гены), образование клубеньков (nod-rcwbi), синтез нитрогеназы («//HDK-гены), фиксацию азота в симбиотическом состоянии (nif- и fix-гены), расположены в геноме ризобий (как на плазмиде, так и на хромосоме) сцепленными кластерами. При этом характер взаимного расположения этих генов друг с другом значительно различается у быстро- и медленнорастущих ризобий, что очередной раз указывает на филогенетическую удаленность этих бактерий (Martinez-Romero et al, 1990). Некоторые структурные гены клубеньковых бактерий представлены в нескольких копиях или аллелях на геном. Так, у ризобий люцерны обнаружены 3 копии nodD регуляторов nod оперонов (Honma et al., 1987). У штамма BR816 Rhizobium sp. обнаружены 4 аллеля гена nodD, два из которых контролируют образование клубеньков у Leucaena leucocephala, а два других - у Phaseolus vulgaris (Rhijn et al., 1994). Также в нескольких копиях может быть представлен niJR ген, необходимый для синтеза нитрогеназы. Например, у бактерий A. caalinodans обнаружены 2 копии этого гена (Norel et al., 1985), первый из которых локализован в опероне nijHDK, а другой расположен отдельно и отвечает за азотфиксацию ех planta. У штамма CFN42 ризобий фасоли копия niftt локализована на pSym плазмиде (Quinto et al., 1982), а у штамма GR4 ризобий люцерны на криптической плазмиде (Того et al., 1994). Также в нескольких копиях встречаются fix гены, гены «шаперонов» (гены gro-оперонов), а также «перемещающиеся» последовательности IS-элементов, причем обнаружено, что именно симбиотические районы являются местом предпочтительного расположения IS-элементов (Новикова, 1996). Также геном ризобий характеризуется большим количеством разнообразных повторяющихся последовательностей. Так, у некоторых штаммов ризобий фасоли (R. etli) обнаружено более 200 семейств повторяющихся последовательностей ДНК на геном, каждое из которых представлено 2 - 10 копиями (Palacios et al., 1993), а у ризобий сои (В. japonicum) копийность некоторых повторов достигает 18-21 на геном (Rodrigues-Quinones et al., 1992). Обнаружено, что наибольшей рекомбинационной активностью обладают pSym плазмиды. Делеции и амплификации 120 тпн сегмента ДНК, ограниченного двумя копиями оперона nijHDK у штамма CFN42 R. etli могут приводить как к образованию гигантских pSym плазмид, содержащих до 15 копий амплифицированного сегмента, так и к возникновению резко уменьшенных нестабильных вариантов этой плазмиды (Romero etal., 1991).
Благодаря такой пластичности генома возможны относительно легкие перестройки и горизонтальный перенос генов между ризобиями. В природных условиях, в ризосфере и клубеньках бобовых растений создаются благоприятные условия, для переноса генов между различными штаммами ризобий. Так, при проникновении в клубенек люцерны нескольких штаммов R. meliloti между ними происходит перенос как собственных мегаплазмид (Pretorius-Guth et al., 1990) так и специально введенных плазмид (Чернова и др., 1986). В ризосфере люцерны также происходит довольно интенсивный перенос собственных плазмид между разными штаммами R. meliloti (Broughton et al., 1987). Более того, Zahran и др. исследовали клубеньковые бактерии Alhagi muraram, М. indicus и Trifolium resupinatum. Около ЗО % ризобиальных штаммов формировали более или менее эффективный симбиоз с Vicia /aba, Vigna sinensis, P. sativum и M. sativa. Вообще большинство ризобий дикорастущих бобовых крайне разнообразно (Zahran, 1999). Обнаружено, что перенос симбиотических плазмид у ризобий гороха может происходить с частотой 10" на реципиент при плотности популяции 107 клеток на 1 г почвы (Kinkle et al., 1991). В лабораторных же условиях частота утраты pSym плазмид ризобиями клевера достигает 10"2-10 3 на клетку (Zurkowski, 1982).
Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях
Ранее показано, что штаммы микроорганизмов Rhizobium gcilegcie делятся на две группы по их способности вступать в эффективный симбиоз с растениями Galega orientalis и Galega officinalis (Новикова и др. 1992). Этот симбиоз строго специфичен: штаммы ризобий других видов не способны формировать клубеньки на G. orientalis и G. officinalis и наоборот, штаммы R. galegae не способны нодулировать другие бобовые. Более того, штаммы R. galegae bv. officinalis и R. galegae bv. orientalis, названные соответственно по их растениям-хозяевам, не входят в одну группу перекрестной инокуляции.
Растение-хозяин является важным фактором, формирующим структуру ризобиальных популяций (Андронов и др. 2001). Следовательно, штаммы ризобий, нодулирующие морфологически близкие виды растений, но не образующие одну группу перекрестной инокуляции, должны отличаться определенной вариабельностью в организации симбиотических генов, которая определяет специфичность взаимоотношений между симбионтами. На основании сравнения филогении бактериальных генов nodABC и nodlJ генов с филогенией растений-хозяев, выстроенной, в свою очередь, на сравнении последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров рРНК и высокой гомологии аминокислотных последовательностей общих nod генов R. galegae, S. meliloti и R. legiiminosarum предполагают, что эти гены имеют один источник происхождения. Только горизонтальный перенос может объяснить столь высокую гомологию данных генов R. galegae с S. meliloti и R. legiiminosarum, поскольку последние два по положению на филогенетическом древе, основанном на сравнении генов 23 S рРНК, отстоят от ветви штаммов биоваров R. galegae (Terefework et al., 1998; 2001; Suominen et al., 2001). Более того, показано, что штаммы R. galegae, принадлежащие двум биоварам, продуцируют почти идентичные Nod-факторы (Yang et al., 1999). Из этого можно предположить, что Nod-факторные рецепторы G. orientalis и G. officinalis гомологичны.
Однако исследования геномного полиморфизма штаммов R. galegae с помощью методов случайного праймирования (RAPD) и концевого мечения рестриктазных фрагментов (КМРФ) показали отчетливо выраженную генетическую разнородность между биоварами (Баймиев и др. 1999). На отрезке рентгеновской пленки, несущей отпечатки фрагментов ДНК длиной приблизительно от 80 до 270 н можно обнаружить, в разных образцах, от 20 до 40 полос, расположение которых позволяет выявить различия между исследуемыми штаммами R. galegae bv. orientalis, а также объединить несколько близких штаммов в своеобразные подгруппы. Имеющиеся же полосы штаммов R. galegae bv. officinalis свидетельствуют об их отличии от bv. orientalis. Однако среди них обнаруживаются отдельные полосы, свидетельствующие о родстве со штаммами, нодулирующими G. orientalis. Таким образом, nod-гены бактерий находятся под сильным контролем со стороны их растения-хозяина при столь выраженной геномной дивергенции штаммов биоваров R. galegae. Следовательно, Nod-факторы участвуют в одном из критических моментов при становлении симбиоза Galega sp. с гетерологичными ризобиями, но не определяют его специфичность у Galega sp. - R. galegae.
Поэтому природа фактора, ограничивающего перекрестную инокуляцию ризобиями морфологически близких растений G. orientalis и G. officinalis, оставалась до конца неясной.
Принимая во внимание гипотезу о лектине, как критическом факторе специфичности со стороны растения-хозяина (Diaz et al., 1989; Kijne et al., 1997; Hirsch, 1999), нами были секвенированы фрагменты генов лектинов длиной — 360 п.н. G. orientalis и G. officinalis разного географического происхождения. Эти фрагменты включают в себя последовательности, кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков.
В нуклеотидной последовательности фрагмента гена лектина 12 козлятника восточного обнаружена открытая рамка считывания, не нарушающаяся по всей длине клонированного фрагмента и не содержащая интронов, так же как это наблюдается и у остальных секвенированных последовательностей генов лектинов бобовых, свойства которых описаны ранее (Баймиев и др., 2001). Однако при анализе последовательности гена лектина козлятника лекарственного обнаружены кодоны терминации сразу после области, кодирующей углеводсвязывающий пептид. Для того чтобы убедиться в том, что это не ошибка чтения и не «молчащий» ген, нами были проанализированы растения козлятника лекарственного, выращенные из семян разных географических ареалов. В генах лектинов этих растений также обнаружены терминирующие триплеты справа от области, кодирующей углеводсвязывающий домен.
Более того, в последовательности после этих терминаторов повышена частота мутаций, проявляющихся в виде замен, делений и инсерций нуклеотидов, вследствие чего рамка считывания уже не восстанавливается. При этом локализация и число мутаций в генах лектина растений из разных мест обитания различаются между собой (рис. 3.3).
Нуклеотидные, а также выведенные из них аминокислотные последовательности депонированы в международный банк данных DDBJ/EMBL/GenBank под регистрационными номерами AY563548, AY563271-AY563273. Судя по отсутствию терминирующих кодонов слева от функционально значимых областей и по идентичности последовательностей до первых сайтов, где нарушается рамка считывания, можно предположить, что третичная структура такого «укороченного» лектина все же не сильно нарушена и что он способен правильно сворачиваться в пространстве с сохранением его функции. Подобный двухцепочечный лектин с укороченной последовательностью (3-цепи полипептида ранее обнаружен у чечевицы {Lens cidinaris) (Foriers et al., 1978). При этом нельзя исключать и вероятность существования других генов изолектинов у козлятника лекарственного, которые не амплифицируются данными праймерами подобно изолектину // козлятника восточного.
Сравнительный анализ последовательностей методом множественного выравнивания с помощью пакета компьютерных программ "Lasergene" фирмы "DNASTAR"noKa3bmaeT, что терминирующие триплеты образовались вследствие делении 41 п.н., если сравнивать с генами лектинов козлятника восточного и ряда других бобовых растений (рис. 3.3). Вместе с тем, последовательности образцов из козлятника лекарственного до терминаторов практически идентичны и обнаруживают достаточно высокую степень гомологии с той же областью гена лектина козлятника восточного, которая, однако, меньше, чем можно было ожидать для этих очень близких филогенетически и морфологически видов растений с перекрывающимися ареалами происхождения (Andronov et al., 2003).
Из рассмотрения филогенетического древа, построенного на основе сравнения секвенированных нуклеотидных последовательностей генов лектинов можно видеть, что G. orientalis и G. officinalis родственны, поскольку эти растения объединяются в отдельную, хотя и не очень компактную ветвь (рис. 3.4). Это согласуется с данными по анализу последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров генов рРНК (ITS2) козлятников восточного и лекарственного (рис. 3.5). Для сравнения приведены гены лектинов бобовых растений трибы Vicieae, Trifolieae, Galegae.
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина козлятника восточного и лекарственного
В исследовании роли лектина при становлении бобово-ризобиального симбиоза некоторые представители Trifolium sp. являются по существу модельными растениями. Тем не менее, последовательности их лектинов до сих пор не были определены. Нами были секвенированы фрагменты генов лектинов длиной 360 п.н. 7". repens, Т. pratense и Т. trichocephalum, включающие в себя последовательности, кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков. В нуклеотидных последовательностях этих фрагментов обнаружена открытая рамка считывания, не нарушающаяся по всей длине клонированного фрагмента и не содержащая интронов.
При анализе аминокислотного состава углеводе вязываю ще го участка лектинов клеверов мы обнаружили между ними определенные различия по значимым аминокислотам (рис. 3.6 и 3.7): у Т. pratense в позиции 124 стоит полярный аминокислотный остаток Туг, в 127 отрицательно заряженный остаток Asp, в 134 положительно заряженный Arg и в 135 отрицательно заряженный Asp. У Т. repens: положительно заряженный 124His, в 127 позиции делеция, в 134 положительно заряженный Lys и в 135 неполярный Не. У Т. trichocephalum в этих позициях стоят неполярные аминокислоты. Хотя углеводсвязывающие участки Т. repens с М. albus практически полностью гомологичны но, тем не менее, специфичность к сахаридам у них разная. Т. pratense показал наибольшее сходство с P. sativum, но у этого вида были обнаружены замены по консервативным аминокислотам: Vall26Ala, Aspl27Ala и Thrl3lSer, соответственно. Множественное выравнивание фрагментов генов их лектинов на нуклеотидном уровне, а также по ITS 2 показало ту же картину, клевер белый находится в кластере представителей Trifoleae (рис. 3.4 и 3.5). Поскольку бобовые одной группы инокуляции имеют сходные лектины, можно было ожидать, что Т. repens также будет нодулироваться теми же ризобиями S. meliloti, что и Melilotus sp. Однако ризобии этих растений не входят в одну группу перекрестной инокуляции по следующей причине. Debelle с соавт. показали, что S. meliloti с мутациями генов nodFE, nodG и nodH способен инициировать скручивание корневых волосков и образование инфекционных нитей на Т. repens, но своего хозяина инокулировать уже не мог. С другой стороны, R. leguminosarum bv. trifolii с генами wodFEGH S. meliloti был способен вызывать не только формирование инфекционных нитей, но и клубенекподобных структур на М. sativa, при этом теряя специфичность к Trifolium sp. (Debelle, 1988). Здесь отметим, что лектин необходим для формирования инфекционных нитей и клубенькообразования (Diaz et al., 1995; van Rhijn et al., 1995). To есть барьером на пути формирования симбиотических отношений между Т. repens и S. meliloti или М. sativa и R. leguminosarum bv. trifoli. являются не лектины хозяина с очень схожими углеводсвязывающими участками, а возможно полисахариды симбионтов. Замечено, что лектин белого клевера не способен связываться с полисахаридами поверхности ризобий люцерны (Dazzo, Brill, 1977).
Тогда как объяснить, почему лектины клеверов связывают одни и те же ризобии bv. trifolii, если углеводсвязывающие участки у них не гомологичны? Прежде всего отметим, что лектины Trifolium sp. важны при взаимодействии клевера с ризобиями, поскольку только при трансформации белого и красного клевера геном лектина гороха PSL, гетерологичный для них штамм R. leguminosarum bv. viciae, очень схожий по nodABCIJ и 16S РНК с R. leguminosarum bv. trifolii, был способен индуцировать на них клубенъкообразование (Diaz et al., 1995; 2000). Кроме того, у белого клевера нашли специфичный к 2-диоксиглюкозе лектин, инактивация которого приводила к подавлению агглютинации R. legiiminosarum bv. trifolii, специфичных к клеверу на корни растения и, в дальнейшем их нодуляции. Причем этот белок не связывается ни с ризобиями S. meliloti, ни с B.japonicum (Dazzo, Brill, 1977).
Как видно на рисунке 3.6, несколько подобную ситуацию мы наблюдаем и у представителей Vicia sp. Лектин V. faba сгруппирован с лектинами Lathims sp., а V. cracca с представителями трибы Viciae. Однако подобная гетерогенность в УСП не выходит за пределы группы инокулируемости этих растений. Причем если отслеживать филогенетические отношения растений по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров рРНК, мы обнаружили то же самое (рис. 3.5).
Наиболее вероятное объяснение этому - существование в Trifolium sp. изолектинов, подобных изолектинам Ulex enropaeas. Один из них специфичен к L-Fuc, а другой к GlcNAc/Gal, у A. hypogaea найдено до семи изоформ, специфичных как к Man/Glc так и к Gal, у Griffonia simplicifolia - четыре Gal/GalNAc, GlcNAc и Fuc и у V. cracca - Man/Glc, другой к GalNAc.
В экспериментах над 2-диоксиглюкоза специфичным лектином белого клевера было показано, что среди альфа D-глюкозы, 2-диоксигалактозы и 2-диоксиглюкозы только последний ингибировал адсорбцию бактерий R. legiiminosarum bv. trifolii к корням растения-хозяина (Dazzo et al., 1976), но не влияла на связывание S. meliloti с М. sativa (Dazzo, Brill, 1977). Возможно у клевера белого содержится только один лектин, специфичность к моносахаридам которого отличается от лектинов люцерны.
На филогенетическом древе углеводсвязывающих доменов лектинов, клевер белый образует компактный кластер с донниками белым и желтым, красный же далеко отстоит от представителей Trifoleae, тогда как на нуклеотидном уровне УСП и на древе, основанном на ITS2, красный входит в группу Trifolium sp. Аналогичная ситуация наблюдалась и в группе Galegae у лектинов козлятника восточного и лекарственного (рис. 3.6). Нуклеотидные последовательности УСП их схожи, но аминокислотные сильно различаются. Углеводсвязывающий участок клевера волосистоголового, ни на нуклеотидном, ни на аминокислотном уровне не входит в группу представителей Trifoleae. Подобная картина наблюдается и с лектинами М. sativa и М. truncatula. Все три аллеля гена лектина последнего входят в совершенно разные группы.
Таким образом, перед нами разные аллели генов лектина Trifolium sp., изолектины. У рассматриваемой формы лектина клевера красного делетирован Pro 130, являющийся инвариантной аминокислотой лектина бобовых, связывающий ионы металлов и стабилизирующий пространственную структуру белка. Это может оказывать существенное влияние на функциональную активность этого белка. Поэтому у клевера красного и волосистоголового, в отличии от клевера белого возможно не один лектин, как это показано у некоторых представителей чечевицы кроме L. tomentosus, у которой обнаружен один лектин.
