Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Таксономия и разнообразие видов и внутривидовых форм рода Botrtyis Micheli. 5
1.2 Ареал и специализация видов рода Botrytis. 30
1.3 Факторы устойчивости растений к возбудителям серой гнили . 38
1.4 Изменчивость популяций фитопатогенных грибов и видов рода Botrytis. 43
1.5 Эколого-трофические группы грибов. Особенности паразитизма видов рода Botrytis. 47
1.6 Биохимические особенности видов рода Botrytis. 51
1.7 Общие подходы к изучению популяций фитопатогенных грибов . 54
1.8 Характеристика популяций видов рода Botrytis. 59
1.9 Взаимодействие видов рода Botrytis с микробиотой. 63
1.10 Использование фунгицидов против серой гнили и резистентность возбудителей. 66
2 Материалы и методы 82
2.1 Сбор материала. Учет частоты встречаемости возбудителей серой гнили и развития заболевания растений. Выделение чистых культур. 82
2.2 Получение моноспоровых культур 84
2.3 Оценка нестабильности штаммов Botrytis 85
2.4 Оценка титра конидиальной суспензии и расчет инфекционной нагрузки для заражения растений штаммами Botrytis. 86
2.5 Получение склероциев и определение их жизнеспособности 87
2.6 Оценка токсичности культуральной жидкости на наборе тест-объектов при выращивании штаммов Botrytis на жидких средах. 87
2.7 Оценка фитотоксичности культуральной жидкости штаммов Botrytis 89
2.8 Выделение полисахаридной фракции из культуральной жидкости штаммов Botrytis и определение качественного и количественного состава моносахаров. 90
2.9 Определение спектра водорастворимых белков и некоторых ферментов мицелия штаммов Botrytis методом электрофореза в полиакриламидном геле 90
2.10 Определение глицериноксидазной активности у видов Botritys. 95
2.11 Исследование парамагнитных свойств препаратов В. cinerea. 96
2.12 Определение микопаразитической активности штаммов грибов. 96
2.13 Определение взаимоотношения представителей микобиоты с видами Botritys и проявления ими антибиотической активности. 97
2.14 Методики выявления резистентности, определения степени устойчивости и адаптации Botritys к фунгицидам. 98
3 Экспериментальная часть 100
3.1 Виды рода Botrytis и спектр поражаемых ими растений в Московской области. 100
3.2 Особенности биологии возбудителей серой гнили 112
3.3 Патогенность видов рода Botrytis и штаммов В. cinerea, выделенных с разных хозяев. 119
3.4 Формирование морфологических структур грибами рода Botrytis Micheli in vivo и in vitro. 133
3.5 Типы реакций вегетативной совместимости у грибов рода Botrytis Mich. 151
3.6. Биохимические особенности видов рода Botrytis Изучение токсического действия видов и штаммов Botrytis 161
3.6.2 Глицериноксидазная активность грибов рода Botrytis. 175
3.6.3 Изучение комплекса фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у грибов рода Botrytis. 179
3.6.4 Анализ сходства и различия видов рода Botrytis по спектрам фенолоксидазы и неспецифической эстеразы. 190
3.7 3.7.1 Обоснование способов ограничения возбудителей серой гнили в агроценозах. Взаимодействие видов рода Botrytis с микобиотой 197
3.7.2 Действие фунгицидов на возбудителей серой гнили в природных популяциях и агросистемах. 207
3.8 Влияние окультуренности почвы и минеральных удобрений на развитие грибов рода Botrytis на примере возбудителя шоколадной пятнистости кормовых бобов В. fabae. 241
Заключение 253
Список литературы 264
Приложение 322
- Факторы устойчивости растений к возбудителям серой гнили
- Общие подходы к изучению популяций фитопатогенных грибов
- Определение спектра водорастворимых белков и некоторых ферментов мицелия штаммов Botrytis методом электрофореза в полиакриламидном геле
- Формирование морфологических структур грибами рода Botrytis Micheli in vivo и in vitro.
Введение к работе
Актуальность исследований. Грибы рода Botrytis Micheli встречаются практически во всех регионах земного шара. Многие из них являются возбудіггелями серой гнили культурных растений, приносящей значительный ущерб урожаю. Виды рода Botrytis отличаются значительной изменчивостью, выраженной в многообразии культурально -морфологических, физиолого-биохимических признаков и паразитических свойств.
Изучение фитопатогенных грибов в биоценозах чаще всего проводится для облигатных биотрофных видов - паразитов сельскохозяйственных растений - мучнисто-росяных и ржавчинных (Горленко, 1974, 1995; Берлянд-Кожевников, 1976, 1979; Михайлова и др., 1982; Лекомцева, 1996; и др.). Значительно меньшее внимание уделяется сравнительному изучению биоразнообразия факультативных патогенов растений (Дьяков, 1998, 2000; Веденяпина, 2000). В целом роль патогенных для растений грибов го различі&к экологических групп в биоценозах изучена недостаточно.
Сведения о распространении видов Botrytis на различных видах растений в биоценозах немногочисленны. Значительные потери урожая при поражении культурных растений грибами этого рода инициируют интерес к всестороннему исследованию биологии возбудителей и разработке средств защиты. Необходимость проведения таких исследований продиктована экономической целесообразностью. Статистические данные по десяти странам Европы показывают, что только на винограде половина средств из проводимых защитных мероприятий приходится на борьбу с серой гнилью, вызываемой Botrytis cinerea Pers.: Fr. (Mathys, 1982). При этом важной и практически мало исследованной проблемой является появление в естественных ценозах устойчивых к фунгицидам форм патогенов.
Виды рода Botrytis являются удобной моделью для изучения этапов эволюции паразитизма иекротрофных грибов. Кроме того, некоторые из них являются продуцентами биологически активных веществ (Герасимова и др., 1983; Филимонова, Талиева, 1992; Куплетская, Лихачев, 1996)
Таким образом, многоплановые исследования биологии грибов рода Botrytis представляются актуальными для выявления видового разнообразия грибов в био - и агроценозах и роли некротрофиых видов патогенов растений в биоценозах, а также для решения практических проблем ограничения развития возбудителей серой гнили на культурных видах.
Цели исследований. Основной целью работы является изучение видов рода Botrytis в естественных условиях на дикорастущих видах растений и выявление особенностей их биологии по сравнению с развитием на культурных видах. Используя фитопатогенные виды Botrytis в качестве модели некротрофиых паразитов, установить влияние растений-хозяев на
полиморфизм, цикл развития и формирование морфологических структур. Выявить наличие устойчивых к фунгицидам форм в биоценозах, их влияние на структуру популяции В. cinerea и резистентность морфологических структур. Изучить особенности популяций фитопатогенных видов Botrytis на культурных и дикорастущих растениях для выяснения внутривидового разнообразия и микроэволюционных процессов у факультативных паразитов. Исследовать взаимодействие видов Botrytis с микобиотой для регуляции численности патогенов и разработки теоретических основ использования антагонистических отношений грибов для создания биопрепаратов.
Задачи исследований: 1 .Выявление видового состава рода Botrytis в условиях Московской области и круга поражаемых ими видов растений 2. Изучение паразитических свойств видог Botrytis. 3. Исследование цикла развития видов рода Botrytis при естественном поражении растений - хозяев из разных семейств и полиморфизма морфологических структур in vitro и in vivo. 4. Изучение реакций вегетативной совместимости между видами и штаммами Botryth разного происхождения. 5. Исследование ряда биохимических свойств у штаммов видов Botrytis: токсичности культуральньгх жидкостей, качественного и количественногс соотношения моносахаров в их полисахаридных фракциях, спектра изозимов некоторых ферментов, б. Выявление устойчивых к фунгицидам форм патогенов в естественных ценоза* и агросистемах и их влияния на структуру популяции В. cinerea.. 7. Изучение взаимоотношения видов Botrytis с микобиотой пораженных серой гнилью растений. 8 Выявление влияния окультуренности почвы и минеральных удобрений на повышение устойчивости растений к серой гнили.
Научная новизна. В результате многолетних наблюдений установлен круг растений-хозяев грибов рода Botrytis, включающий 199 видов из 55 семейств. Выявлены новые видь растений-хозяев В. cinerea, ранее не указанные в определителях и списках работ посвященных исследованию возбудителей серой гнили. Выявлены специализированны! виды и формы Botrytis, не установленные ранее для Московской области, - В. comallaria - ні ландыше майском (Convallaria majalis L.) и Botrytis sp. - на майнике двулистно» Majanthemum bifolium (L.) F.W. Schmidt) и ирисе водяном (Iris pseudacorus L.). Ежегодш поражаемые В. cinerea виды хозяев, выделенные в группу растений - реципиентов служат резерваторами различных форм патогена, определяют состав популяции гриба н; восприимчивых хозяевах в бис- и агроценозах. Впервые установлена ценстическая роль В cinerea, проявляющаяся в снижении репродукции и жизнеспособности семян растений з; счет внешней и внутренней инфекции. Разработаны методы получения моноспоровы; культур и оценки патогенности видов Botrytis при искусственном заражении. Определен; вирулентность штаммов грибов, выделенных с дикорастущих и культурных растений
Впервые изучено проявление патогенносте по отношению разных хозяев у 35 штаммов В. cinerea и 5-й специализированных видов Botrytis. Определена структура популяций В. cinerea и специализированных видов Botrytis по признаку вирулентности и ряду физиолого-биохимических свойств. Изучена динамика развития морфологических структур - мицелия, схлероциев и конидиального спороношения in vitro и in vivo. Выявлены особенности формирования этих структур на разных видах хозяев и их органах. Изучено внутривидовое разнообразие видов Botrytis по культурально - морфолопгческим признакам, проявлению токсичности, спектру изозимов ряда ферментов и реакциям вегетативной совместимости. Впервые установлена возможность синтеза глицериноксидазы видами Botrytis, В природной популяции ввдов Botrytis обнаружены формы, устойчивые к фунгицидам с разным механизмом действия. Специализированные виды Botrytis более чувствительны к фунгицидам по сравнению с многоядным видом В. cinerea.
Практическая значимость работы. Результаты исследований специализации и роли грибов рода Botrytis в качестве компонентов природных биоценозов позволяют выявить источники возбудителей серой гнили для культурных видов. Предложенная в работе оценка патогенности видов Botrytis применима для выявления вирулентности возбудителей и оценки устойчивости растений к патогенным относительно слабо специализированным видам грибов. Определение устойчивости к фунгицидам морфологических структур В. cinerea на землянике, наличие устойчивых клонов видов Botrytis в био- и агроценозах, выявленные особенности влияния химических препаратов на изменение цикла развития возбудителей позволяют предложить последовательность применения фунгицидов различного действия для ограничения развития возбудителей серой гнили. При изучении микобиоты пораженных серой гнилью растений выявлены антагонисты к возбудителям заболевания - штаммы Trichoderma viride Pers С учетом результатов изучения взаимодействия видов Botrytis с разными представителями микобиоты высказан ряд научно-методических положений по разработке теоретических основ биометода. Этот метод может быть применен одновременно с агротехническими мероприятиями. Виды рода Botrytis могут служить продуцентами глицериноксидазы, применяемой в медицинских целях. Материалы диссертации используются в лекциях по фитопатологии и спецкурсах кафедры микологии и альгологии биологического факультета, кафедры агрохимии факультета почвоведения МГУ.
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были представлены на многих конференциях: «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» М. 1970; «Московский Университет - сельскому хозяйству» М. 1972; «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур» Вильнюс. 1978; «Споровые растения Средней
Азии и Казахстана» Душанбе. 1978; « МГУ - сельскому хозяйству», М. 1982; «Изучение грибов в биогеоценозах» Свердловск.,1988; «Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы растений и яашотных» Ташкент, 1989;»; «Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов». Донецк. Украина, 1997; Intern. Conf. Ecological effects of microorganisms action. Vilnius. 1997, Международная конф. посвященная 80-летию каф. микологии и альгологии МГУ и 90 - летию со дня рождения М.В. Горленко. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии".М.1998; II (X) съезд Русского ботанического общества. «Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI веков.» С - Пб.1998; « Проблемы охраны и рационального использования природных экосистем и биологических ресурсов», Пенза, 1998; «Актуальные вопросы агроэкологии в интегрированных системах защиты растений», Пенза, 1999; «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов.(к 110 - летию со дня рождения проф. Е.Е. Успенского)». М. МГУ. 2000 г.; «X Московское совещание по филогении растений» М. МГУ. 2000 г.; Междунар. конф. «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность». С-Петербург. 2000 г.; XII th International Botrytis Symposium. Reims. France. 2000.
По материалам диссертации опубликовано 47 статей.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 322 стр. компьютерного текста (MS Windows 95, Arial 13 / 1,5), состоит из введения, 3 глав, включающих 37 разделов, обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 887 наименований (из них 350 на иностранных языках) и приложения. Работа содержит 50 таблиц и иллюстрирована 23 рисунками.
Факторы устойчивости растений к возбудителям серой гнили
Одноклеточные конидии, собранные в гроздьевидные головки на вздутых окончаниях конидиеносцев, крепятся к ним с помощью коротких зубковидных стеригм. На конидиеносцах может быть 1-9 головок, в каждой из которых содержится от 50 до 259 спор.
Конидии яйцевидные, эллиптические, округлые или шаровидные, 9 - 17,5 х 6,5-10 мкм, в массе дымчатые или оливковые. Размеры конидий вариабельны и зависят от условий окружающей среды и субстрата, на котором развивается гриб (Ванев, 1968, 1972, 1974; Лап, ВеЛоИгм, 1996).
Конидии имеют двухслойные клеточные стенки: наружный слой - тонкий, электронно-плотный, а внутренний - плотный, электронно- проводящий. При прорастании конидии наружная стенка разрывается, а из внутренней образуется ростовая трубка.
Число ядер в конидии - от 1 до 10, у большей части конидий по 4-6 ядер размером 1,5-2 мкм. В более крупных конидиях содержится больше ядер, чем в мелких. Когда ростовая трубка удлинняется, ядра мигрируют в неё. Ядра мигрируют через поры септ. Большое количество ядер собирается в местах формирования апрессориев.
Иногда, особенно в старых культурах и на бедных средах, образуются шаровидные микроконидии диаметром (2)2,5-3,5 мкм. По описанию С.Ф. Сидоровой (1971), они образуются в спородохиях, состоящих из часто септированных гиф, от которых отходят кисти разветвлённых конидиеносцев с заострёнными удлинёнными фиалидами. Штаммы образуют микроконидии в старых культурах. Микроконидии располагаются на фиалидах цепочками, часто бывают окружены слизистым веществом, которое при высыхании ствновится восковидным.
Штаммы B.cinerea с винограда могут формировать головки микроконидий на тех же гифах, на которых развиваются конидиеносцы с макроконидиями Штаммы могут подразделяться по превалированию конидий с определенным типом их формы и размерам (Кублицкая, Рябцева, 1969).
У штаммов, выделенных со свеклы, головки микроконидий могли образовываться внутри конидиеносцев макроконидиального спороношения (Морочковский, 1948). Все авторы отмечают очень низкую способность микроконидий к прорастанию.
Как при культивировании на питательных средах, так и в природных условиях, B.cinerea образует склероции - твёрдые гифальные агрегаты, сохраняющиеся в природе около года и содержащие запасные вещества. В природных условиях склероции начинают закладываться при влажной погоде, когда среднесуточная температура опускается до +13С и ниже, их образование происходит на мёртвых тканях (Вране, 1977). При изменении температуры рост мицелия может прерываться, что приводит к переплетению и слипанию воздушных гиф, образованию гифальных агрегатов, которые затем уплотняются и темнеют.
В зрелых склероциях различают три зоны тканей (Leal, Blanco, 1979; Willets, Bullock, 1982): 1) внешняя псевдопаренхиматическая кора толщиной 1-6 клеток; стенки клеток пропитаны меланином, который защищает склероций от действия полисахаридаз, продуцируемых окружающим мицелием, и, в природе, от литических ферментов других микроорганизмов; 2) узкий кортекс, толщиной обычно в 1 слой клеток; 3) прозенхиматическая медулла, составляющая основную массу склероция. Толщина каждой из зон варьирует у разных штаммов в зависимости от субстрата и условий во время закладки и созревания склероциев. В медулле, в межгифальных промежутках, откладываются полисахариды и протеины, используемые при прорастании.
Склероции могут прорастать мицелием, конидиеносцами с макроконидиями или апотециями. При изучении прорастания склероциев в лабораторных условиях разными исследователями (Ванев, 1966; Васелашку, 1982; Коченко, 1972; Кублицкая, Рябцева, 1968; Рудаков, 1959; Сидорова С.Ф., 1971; Faretra, Antonacci, 1987; Grawes, Loweland, 1953) было установлено, что склероции В.cinerea преимущественно прорастают конидиальным спороношением, формирование и интенсивность которого зависит от температуры и влажности; субстрата, на котором склероции образовались, их возраста и условий хранения. Штаммы В.cinerea, выделенные из разных местообитаний, отличаются по жизнеспособности склероциев, скорости прорастания их при разных температурах и влажности.
Склероции собранные с некоторых естественных субстратов могут формировать апотеции. На их формирование оказывает влияние высокая влажность и резкое колебание температуры в период длительного пребывания в этих условиях и обязательная сперматизация совместимых бисексуальных штаммов.
Наряду с этим, вероятно, на формирование склероциев Botrytis, как и у других видов, оказывают влияние вторичные метаболиты гриба и активность ферментных систем. В лабораторных условиях образованию склероциев способствует высокое содержание в питательной среде глюкозы и полифенолов. Первое соединение способствует повышению выхода внеклеточного полисахарида - склерина, который участвует в агрегации мицелия, а второе - накоплению предшественников меланина и созреванию склероциев (Gmez-Miranda, Leal, 1979; Marukawa, Satomura, 1977). Важную роль в онтогенезе склероциев играют ферменты из группы фенолоксидаз. В литературе отмечена особая роль фенолоксидаз в развитии склероциев у фитопатогенных грибов Sclerotium rolfsii и Sclerotinia spp. (Willetts, 1972). У Sclerotium rolfsii были обнаружены формы фенол оксид азы, имеющие максимум активности на разных стадиях образования склероциев (Chet et al., 1972). Ингибиторы фенолоксидаз блокируют морфогенез склероциев (Le Tourneau, 1976). У Sclerotinia sclerotiorum в активно растущем мицелии тирозиназа не обнаружена. Она появляется на стадии образования склероциальных зачатков, становясь очень активной в молодых и созревающих склероциях. К моменту их созревания и пигментации ее активность снижается. В эксудате склероциев этого гриба также обнаружена фенолоксидазная активность, нарастающая с возрастом культуры (Colotelo, 1973).
У другого фитопатогенного гриба - Venturia inaequalis установлена отрицательная корреляция между активностью фенолоксидазы и вирулентностью: ее активность ниже у свежевыделенных штаммов, чем у старых изолятов, а вирулентность - выше (Hignett et al., 1979).
У В. cinerea внеклеточная фенолоксидаза имеет очень широкую субстратную специфичность, реагируя на 19 соединений (Kovac, 1979). Разные исследователи находили в мицелии и культуральной жидкости В.cinerea несколько электрофоретически различных форм фенолоксидазы (Кожанова и др., 1970; Dubernet et al., 1977). Вероятно, активность фенолоксидаз зависит от условий роста и фазы развития культуры.
У Sclerotinia libertiana отмечена корреляция между интенсивностью вегетативного роста и активностью фенолоксидазы. В условиях, способствующих активному росту, культура накапливает SH-белки, которые ингибируют фенолоксидазу, что в свою очередь приводит к подавлению образования меланина (Marukawa, Satomura, 1977).
Общие подходы к изучению популяций фитопатогенных грибов
Занос патогенов в другие регионы при интродукции растений нередко приводит к изменению круга поражаемых растений-хозяев. Это указывает на ширину адаптационных возможностей грибов, выражающуюся часто в появлении форм с новыми паразитическими свойствами (Горленко, 1995).
Подобное явление отмечено для гриба Pyricularia oryzae, основной ареал которого находится на Дальнем Востоке. Расширение посевов под рисом в районах Кубани привело к поражению пирикуляриозом дикорастущих видов. Переход Pyricularia oryzae на новые виды хозяев, вероятно, способствовал появлению новой формы этого гриба f.sp. zizaniae (Азбукина, Мартынюк, 1986).
Освоение дикорастущих злаков ржавчинными грибами и сохранение урединиомицелием приводит к изменению цикла их развития и повышению роли урединидиальной стадии в эволюционном процессе (Абиев, Есенгулова, 1982; Лекомцева, 1996).
Клоны одного и того же вида гриба, выделенные их разных георафических районов, а у некоторых - с одного поля или даже некротического пятна, могут отличаться как по морфолого - культуральным признакам и патогенности, так физиолого- биохимическим свойствам ( Хохрякова, 1980, 1980а; Данченко, 1989; Дарага и др., 1985, 1989; Афанасенко, Левитин, Михайлова, 1976; Ковалева, Горбунова, 1990).
Проявление такого типа изменчивости свойственно и грибам рода Botrytis. Вариабельность признаков и свойств наблюдается у штаммов, выделенных как с разных растений-хозяев или одного хозяина из отдаленных географических регионов, так и по проявлению патогенности культур, выделенных с разных растений (Сусой, 1990).
Как видно из данных, представленных в табл. 1 размеры конидий у В. cinerea вырьируют в широких пределах и часто перекрываются размерами спор специализированных видов. Штаммы В. fabae, выделенные в из разных стран, отличаются по морфометрическим параметрам конидий, приведенных в описаниях Сардина (Sardina, 1929; Васин, 1966).
Известно, что клональная структура популяций патогенных видов грибов, обусловленная: наличием половой или вегетативной несовместимости; превалированием в цикле бесполой стадии развития над половой; различиями в специализации половой и бесполой стадий, может привести к дивергенции вида в условиях симпатрического существования. Длительное существование определенных клонов во времени и продуцирование ими пропагул в одной и той же нише приводит к расхождению первоначальной популяции. Усиление этого расхождения происходит по мере возникновения новых поколений бесполой генерации спор (Дьяков, Лекомцева, 1984). Это положение находит свое отражение в клинальной изменчивости признаков у изолятов патогенов при географической изоляции (Хохрякова, 1980).
Гетерогенность популяций грибов по признаку вирулентности, скорости репродукции, составу ферментов и.т.д. создает предпосылки для доминирования определенных форм в составе популяций разных регионов. Это четко прослеживается у ржавчинных грибов, возбудителя ложной мучнистой росы хмеля, «томатной» и «картофельной» форм фитофторы и.т.д. (Дмитриев, Михайлова и др.,1976; Дорожкин, Писарева, 1984; Дьяков и др., 1984, 1985; Смирнова, Соломатин , 1991; Смирнов, 1996).
Введение одного нового сорта может приводить к эпифитотийному развитию болезни (Дютин, Шустова, 1984; Буга и др., 1991). Расширение ареала, освоение новых хозяев у многих фитопатогенных грибов особенно четко прослеживается у видов мучнисто-росяных и ржавчинных, происходит с за счет бесполой стадии - конидий и урединиоспор (Бункина, 1982; Лекомцева, 1996).
В настоящее время роль дикорастущих растений в процессе дифференциации популяций фитопатогенных видов грибов остается наименее изученной. Без учета отбора, создаваемого дикорастущими восприимчивыми хозяевами в популяциях широко специализированных видов грибов, невозможно изучать и прогнозировать их развитие на культурных видах растений. В агросистемах создается дополнительное направленное воздействие на популяцию патогенов не только за счет агротехнических мероприятий и подбора сортов, но и при обработках посевов пестицидами. Появление резистентных к препаратам форм создает предпосылки к изменению популяционной структуры патогенных грибов (Бедианашвили, Дьяков, 1987; Тютерев, 1984, 1985, 1999; Lorenz, Eichhorn, 1977; 1980).
Под влиянием фунгицидов и других стрессовых факторов, возможно образование морфологических структур (хламидоспор, склероциев и.т.д), способствующих перенесению неблагоприятных условий и определяющих сохранение вида Botrytis. Данные структуры в обычных условиях могут отсутствовать (Сале, 1989 ).
В процессе развития грибы формируют морфологические структуры - жизненные формы, которые могут объединять в себе функции размножения и сохранения (Великанов, 1980). При этом споры или конидии находящиеся в состоянии покоя не инертны, а обладают свойствами трансформации органических веществ (Скрябин, Головлева, 1976).
Последовательность формирования морфологических структур, определяемая геномом, обеспечивает высокую онтогенетическую и эволюционную пластичность грибов в определенных условиях развития. Отражением этой пластичности является фиксируемая нестабильность признаков грибов, выраженная в их изменчивости, свойственная представителям разных систематических групп (Терехова, Дьяков, 1986). Нестабильность грибов выявляется при освоении ими новых местообитаний и эколого-трофических ниш.
Процесс выщепления сегрегантов, наблюдаемый при культивировании грибов на искусственных средах, позволил высказать предположение о том, что на растениях-хозяевах может также происходить определенная сегрегация и последующее обособление новых форм с адаптацией их впоследствии на новых хозяевах.
Одним из механизмов перегруппировки или обособления клонов в популяциях грибов является половая и вегетативная совместимость, выявленнная у представителей разных таксонов (Портенко, 1992; Дьяков, Долгова, 1995)
Определение спектра водорастворимых белков и некоторых ферментов мицелия штаммов Botrytis методом электрофореза в полиакриламидном геле
Роль дикорастущих растений-хозяев в процессе формирования популяций хозяйственно важных видов грибов, к которым относятся виды рода Botrytis, в настоящее время остается слабо изученной. Исследования видового состава грибов на диких видах растений, кроме выявления биоразнообразия грибов в природных биоценозах, представляющего теоретический интерес, важны и для сельскохозяйственной практики при разработке селекционных программ и защитных мероприятий.
В результате ежегодных многолетних наблюдениий за динамикой развития серой гнили в естественных ценозах и агросистемах, включая дачные участки, тепличные хозяйства и оранжерии, в условиях Московской области и в ботаническом саду МГУ нами установлены растения-хозяева возбудителей данного заболевания. В таблице 4 представлен список видов растений, на которых идентифицированы различные виды Botrytis, указана периодичность поражения растений серой гнилью (ежегодно и в отдельные годы), степень развития болезни (%) и тип развития гриба на растениях - в виде конидиального спороношения или склероциев, кроме того приведены органы растений, на которых зафиксировано развитие грибов рода Botrytis.
Развитие грибов рода Botrytis зарегистрировано нами на 199 видах из 55 семейств растений. Наибольшее число поражаемых видов выявлено в сем. Розоцветных, Бобовых и Сложноцветных (Rosaceae, Leguminosae, Compositae). Близкий спектр поражаемых серой гнилью хозяев выявлен в Прибалтике (Шидла, 1972). В списках микобиоты Украины В. cinerea не указан на видах сем. Розоцветных, а также не зарегистрирован вообще на растениях степной зоны (Гелюта и др., 1987). В списках возбудителей болезней лекарственных растений В. cinerea на многих видах не указывается (Васина и др., 1960; Хохряков и др., 1966). Однако по нашим наблюдениям серая гниль в сильной степени проявляется на цветках и семенах наперстянки, календулы, зверобое продырявленном, купене лекарственной, ландыше майском и др.
Среди выявленных видов рода Botrytis в биоценозах доминировал- В.cinerea Pers.: Fr.. Специализированные виды - В. tulipae (Lib.)Lind. - на тюльпанах и В. paeoniae Oud. - на видах пионов выявлены на садовых участках и ботаническом саду. В. allii Munn.- на вегетирующих растениях лука и при хранении. В. fabae Sard. - на кормовых бобах. На цветках клевера лугового (Trifolium pratense L.) в природе и культивируемых сортах, встречается В. trifolii v. Beyma. На ландыше регулярно отмечено развитие В. convallaria (Kleb.) Ondrej, описанный Ондреем (1972) в Чехословакии. Таким образом, в биоценозах при доминировании В.cinerea, специлизированные виды встречаются крайне редко. Однако последние чаще регистрируются на садовых участках, ботаническом саду МГУ, теплицах и оранжереях. Вероятнее всего они занесены на участки с посадочным материалом. Подобные случаи отмечены и в ботанических садах (Селочник, 1974).
Симптомы серой гнили в биоценозах проявляются в подавляющем большинстве на генеративных органах растений - бутонах, цветках и плодах, редко на листьях и стеблях. Преимущественное поражение генеративных органов многих видов растений в биоценозах сказывается на возобновлении растений в природе. На большинстве диких видов растений регистрируется вид Botrytis cinerea. На ирисе водяном и майнике двулистном выделены две формы Botrytis sp., отличные по культуральным признакам от В. cinerea. В Московской обл. на калужнице и чистяке формируется только конидиальная стадия В. cinerea. Хеннеберг и Гровс на этих растениях в Канаде обнаружили телиоморфы В. cinerea (Hennebert,Groves, 1962). В основном специализированные виды Botrytis отмечены на культурных видах растений как в период вегетации на вегетативных органах, так и при хранении. Из специализированных видов на дикорастущих растениях в биоценозах можно отметить только В. convallariae на ландышах, В. trifolii на клевере и формы Botrytis sp. на ирисе и майнике. Однако на них наряду с указанными видами может развиваться и широко представленный в биоценозах В. cinerea. Характеристика культурально-морфологических признаков видов дана в таблице приложения.
Многоядность B.cinerea, обнаруженная нами в Московской области, говорит об отсутствии узкой специализации этого вида в биоценозах. B.cinerea регистрируется как на диких, так и на культурных видах растений. При развитии на культурных видах он часто вызывает их массовое поражение (Лихачев, 1978, 1979).
Растения, поражаемые серой гнилью в разных биоценозах и агросистемах Московской области.Частота встречаемости B.cinerea в биоценозах ежегодно варьирует. Это может указывать на различия в восприимчивости отдельных видов хозяев, различия условий вегетационных сезонов, а также условий микроклимата в каждом конкретном месте произрастания растения. Так, В. trifolii V. Beyma зарегестрирован лишь в одном из десяти районов Египта (El- Helani et al., 1962), а в Греции наличие В. gladiolorum на гладиолусах было установлено только в 70-х годах (Grigoriu , 1977). Из почвы и растительных остатков подсолнечника в районе Звенигородской биостанции выделен В. carnea.
Формирование морфологических структур грибами рода Botrytis Micheli in vivo и in vitro.
По данным Власова у В. cinerea в некоторых случаях может происходить смена органотропности поражения от типичного поражения генеративных органов на развитие гриба на вегетативных органах растений. Так на томатах в теплицах выявлена стеблевая форма проявления В. cinerea (Власов, 1985 ). В теплицах в Белоруссии на томатах происходит ежегодное нарастание доминирования и вредоностности серой гнили (Поликсенова, 1987)
На культурных видах в агросистемах характер поражения растений отличается от наблюдаемого в биоценозах. Развитие возбудителей осуществляется в основном на вегетирующих органах растений - листьях, стеблях, луковицах, клубнях и.т.д. Подобный характер развития грибов рода Botrytis на культурных видах обеспечивает массовое размножение возбудителей серой гнили, вызывающее значительные потери хозяйственно важных видов растений.
По нашим данным в зависимости от характера вегетации растений- хозяев серая гниль проявляется в разные временные отрезки. Возобновление роста и спороношения грибов рода Botrytis происходит весной с середины - конца апреля при наступлении положительных температур 3-10С. Подушечки конидиеносцев отмечены на мумифицированных плодах культурной земляники, малины, шиповника, черной смородины, реже -рябины и ирги. Склероции, сохранинившиеся на растительных остатках подсолнечника, кормовых бобов, циннии, сныти, грушанки и т. д, также прорастают конидиальным спороношением.
В некротических пятнах листьев вечнозеленого зеленчука желтого (Galeobdolon luteum Huds.), патоген сохраняется в виде мицелия. Аналогичное развитие В. cinerea обнаружено нами на старых листьях и цветоносах земляники. При высокой влажности воздуха на них возможно появление пышного воздушного мицелия, сопровождающееся образованием конидиеносцев.
В условиях Звенигородской биостанции первыми в конце апреля - мае поражаются раннецветущие растения - хохлатка плотная (Corydalis halleri Willd.), медуница неясная (Pulmonaria obscura Dum.), мать-мачеха (Tussilago farfara L.), чина весенняя (Latthyrus verna (L.) Bernh.), ветренница лютиковая (Anemone ranunculoides L.), ветренница дубравная (Anemone nemorosa L.), кизляк кистецветный (Naumburgia thyrsiflora Reichenb.), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.), калужница болотная (Caltha europaeus L.), чистяк весенний (Ficaria verna Huds.), вахта трехлистная (Menyanthes trifoliata L.), лещина (Corylus avellana L.), ландыш майский Convallaria majalis L.), сирень (Syringa sp.). В это же время заболевание проявляется на отрастающих листьях ириса водяного (Iris pseudacorus L.).
Симптомы болезни на разных видах хозяев чаще проявляются на генеративных органах - бутонах, цветках и плодах, реже - на листьях и стеблях. Преимущественное поражение серой гнилью генеративных органов, плодов и семян у многих видов хозяев сказывается на возобновлении растений.
Доминирующий тип морфологических структур грибов рода Botrytis (мицелий, конидиальное спороношение и склероции) в био- и агроценозах определяется различными условиями развития грибов и поражаемыми органами растений-хозяев. В оранжереях и теплицах на пораженных В. cinerea видах преобладают спорулирующие формы штаммов. Тенденция отбора на томатах клонов паразита с преобладанием развития конидиального спороношения и утерей способности к формированию склероциев отмечена в теплицах Болгарии (Илиева, 1977).
На посадках тюльпанов в мае отмечены отдельные выпады растений. Анализ показал, что изначально здесь были поражены луковицы, несущие латентную инфекцию патогена. Возбудитель серой гнили тюльпанов - В. tulipae представлен на прорастающих пораженных луковицах конидиальным спороношением и склероциями. Позднее наблюдалось поражение листьев. На листьях и цветках тюльпанов в некоторых случаях также можно обнаружить В. cinerea.
Первичная инфекция репчатого лука В. allii, вероятно, возникает из луковиц несущих латетную стадию, представленную слаборазвитым мицелием во внутренних чешуях. При повторном использовании одних и тех же посевных площадей под лук развитие болезни нарастает за счет сохранения гриба на растительных отстатках. Дикорастущие виды лука (A. angulosum, A.rotondum, A. globosum, A. ursinum), культивируемые в непосредственной близости с репчатым луком, по нашим наблюдениям не поражаются В. allii и В. cinerea при естественно развивающейся инфекции. Исключение составляли восприимчивые к серой гнили А. schoenoprasum L. и A. porrum L.. У чеснока (A.sativum L.) во влажные годы часто поражаются В. cinerea луковички в соцветиях.
При отрастании пионов нами обнаружены отдельные, выходящие из почвы, пораженные стебли с конидиальным спороношением В. paeoniae. В период формирования бутонов заболевание заметно прогрессировало. На листьях развивались обширные некротические пятна, часто без признаков спороношения. На бутонах и раскрывшихся цветках возможно развитие В. cinerea. По нашим данным частота встречаемости возбудителей серой гнили и расширение спектра поражаемых ими растений нарастает по мере наступления массового цветения и плодоношения хозяев. Пик развития болезни и наибольшее число видов поражаемых растений приходится на август - сентябрь (Лихачев, 1979).
В большинстве случаев на растениях гриб образует конидиальное спороношение. Развитие склероциев наблюдается на плодах и реже стеблях и других органах растений. Широко представленный в био- и агроценозах В. cinerea формирует покоящуюся стадию в виде склероциев не на всех поражаемых растениях и их органах. Образование склероциев В. cinerea в естественных условиях постоянно отмечалось нами в агроценозах: на плодах патиссонов (Cucurbita pepo var. ptisson), кабачков (Cucurbita pepo var. giraumontia), бобов (Vicia faba L.), фасоли (Phaseolus vulgaris (L.) Sav.), люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.), физалиса (Physalis sp.), на корзинках подсолнечника (Heliantus sp. L.). На стеблях выше названных растений склероции формировались значительно реже. На кормовых бобах склероции могут закладываться под эпидермисом стебля. Весной, при разрушении покровной ткани они прорастают пучками конидиеносцев.
В биоценозах на ирисе водяном (Iris pseudacorus L), пораженным Botrytis sp., склероции выше корневой шейки сохранялись на протяжении всей вегетации. Обильное спороношение отмечено на нижней части листьев, соцветиях и плодах.
