Содержание к диссертации
1. Введение '. 3
2. Обзор систематики грибов рода Trichoderma Pers.: Fr., их экологических и физиологических особенностей, а также их практического применения. (Обзор литературы)
2.1. Систематика и таксономия рода Trichoderma Pers.: Fr.
2.1.1. История и развитие концепции рода и видов Trichoderma 8
2.1.2. Современное состояние системы рода Trichoderma и перспективы ее развития 14
2.2. Географическое распространение грибов рода Trichoderma и их экологические особенности.
2.2.1. Распространение видов Trichoderma в природе 22
2.2.2. Роль видов рода Trichoderma в сообществах организмов 26
2.2.3. Роль видов рода Trichoderma в круговороте веществ и преобразовании антропогенных загрязнении окружающей среды 28
2.3. Физиологические и генетические особенности грибов рода Trichoderma 31
2.4. Ферменты и биологически активные вещества грибов рода Trichoderma 33
2.5. Использование грибов рода Trichoderma в защите растений 36
2.6. Значение грибов рода Trichoderma как паразита базидиомицетов 45
2.7. Опасные свойства грибов рода Trichoderma для здоровья человека 46
3. Объем материала и методика исследований.
3.1. Видовое разнообразие и распространение грибов рода Trichoderma 48
3.2. Сравнение видового состава грибов рода Trichoderma в почве и на древесине в различных типах леса Тверской области 53
3.3. Оценка влияния Trichoderma harzianum на почвенную микобиоту 54
4. Анализ видового разнообразия и географического распространения видов рода Trichoderma на территории России и сопредельных стран.
4.1. Анализ видового разнообразия видов рода Trichoderma 57
4.2. Анализ географического распространения видов рода Trichoderma 60
4.3. Распространение видов рода Trichoderma на различных субстратах 62
4.4. Сравнительный анализ видового состава грибов рода Trichoderma на различных субстратах на территории Звенигородской биостанции МГУ 65
4.5. Сравнительный анализ видового состава грибов рода Trichoderma на различных субстратах в окрестностях деревни Крутицы Тверской области 66
4.6. Сравнительный анализ видового состава грибов рода Trichoderma в вулканических почвах кальдеры вулкана Узон и Долины Гейзеров на Камчатке 71
4.7. Сравнение популяций наиболее распространенных видов рода Trichoderma из различных регионов 73
5. Характеристика рода Trichoderma Pers.: Fr.
5.1. Общая характеристика рода 77
5.2. Ключ для определения видов рода Trichoderma Pers.: Fr 82
5.3. Описания видов рода Trichoderma
5.3.1. Т. viride Pers.: Fr., 87
5.3.2. Т. asperelhim Samuels, Lieckfelt et Nirenberg 90
5.3.3. T. koningii Oudem 93
5.3.4. T. atroviride Karsten 98
5.3.5. T. aareoviride Rifai 101
5.3.6. T. harzianum Rifai 103
5.3.7. T. minutisporum Bisset 106
5.3.8. T. hamatum (Bon.) Bain 109
5.3.9. T. croceum Bissett 112
5.3.10. Г./
5.3.11. T longipilis Bissett 118
5.3.12. T. oblongisporum Bissett 121
5.3.13. T. spirale Bissett 124
5.3.14. T strictipilis Bissett 127
5.3.15. T. strigosam Bissett 130
5.3.16. T. tomentosum Bissett 133
5.3.17. T. virens (Miller, Giddens et Foster) von Arx 136
5.3.18. T. crassum Bissett 139
5.3.19. T. polysporum (Link: Fr.) Rifai 142
5.3.20. T. citrinoviride Bissett 145
5.3.21. T longibrachiatam Rifai 148
5.3.22. T. saturnisporum Hammill 151
5.3.23. Trichoderma sp. 1 (106) 154
5.3.24. Trichoderma sp. 2 (436) 157
6. Грибы рода Hypocrea Fr., имеющих анаморфу, относящуюся к роду Trichoderma, в южно-таежных лесах Европейской части России.
6.1. Общая характеристика рода Hypocrea 160
6.2. Распространение видов рода Hypocrea, имеющих анаморфу, относящуюся к роду Trichoderma, в исследованных областях 160
6.3. Описания обнаруженных видов Hypocrea.
6.3.1. Я rufa Vers.: Fr 162
6.3.2. Н. schweinitzii (Fr.) Saccardo 165
6.3.3. Hypocrea sp. (образец № 436) 168
7. Влияние гриба Т. harzianum напочвенные микромицеты 170
8. Заключение 180
9. Выводы 182
10. Список литературы 184
11. Приложения 210
Введение к работе
В последние годы грибы находят все большее применение в самых разных областях деятельности человека. Однако, на данный момент хорошо изучены свойства только небольшого количества известных видов. В связи с этим необходимо как детальное изучение биологии используемых человеком видов, так и поиск новых полезных свойств других грибов. Несмотря на то, что ферменты грибов давно уже широко используются в промышленности, постоянно обнаруживаются новые свойства известных ферментов а так же выделяются новые продуценты. (Archer, Peberdy, 1997). Грибы рода Trichoderma в настоящее время находят, пожалуй, наиболее разнообразное применение в промышленности и сельском хозяйстве.
Изучение видов Trichoderma представляет большой практический и теоретический интерес в связи с их использованием в деятельности человека. Широкое применение этих грибов требует детального изучения их экологических особенностей, видового разнообразия, биотопического распределения, конкурентных взаимоотношений и географического распространения.
Грибы этого рода широко распространены в природе и встречаются на многих субстратах, но чаще в почве и на мертвой древесине. Они играют ключевую роль в сообществе микроорганизмов (Салина, 1981; Smith, 1995; Великанов, 1997) и применяются во многих областях человеческой деятельности. Виды этого рода используются для получения целлюлозолитических и некоторых других ферментов, для биологического контроля болезней растений и биологической очистке почвы (Samuels, 1996).
В последние годы систематика этого таксона вызывает много споров, вызванных как пересмотром концепции рода, так и описанием большого числа новых видов. Параллельно с морфологическим подходом, в последнее время активно развиваются различные макромолекулярные методы систематики этого рода, которые позволяют доказать связь анаморфы с телеоморфой и дают новый подход к системе этого рода. На данный момент описано около 200 видов Нуросгеа, и около половины из них имеет анаморфу относящуюся к роду Trichoderma. (Samuels, 1996; Rossman, Samuels, 1999). Из этого можно предположить, что существует, по крайней мере, 100 естественных видов Trichoderma, но возможно их еще больше, поскольку клоны потерявшие способность к половому размножению могут эволюционировать самостоятельно (Горленко, 1979; Samuels, 1996; Дьяков, 1993, 1999).
Представление о таксономии этого рода не соответствует все более расширяющемуся количеству сторон использования видов Trichoderma человеком. Успешная работа биотехнологов, фитопатологов и медицинского персонала с видами этого рода невозможна без их точной идентификации (Samuels, 1996; Esposito, Dasilva, 1998). Классификация грибов используемых для биоконтроля и биотехнологии очень важна в практическом отношении. Но создание приемлемой системы для рода Trichoderma затруднено неясностью морфологических признаков и не всегда известной связью с телеоморфой. Накопление макромолекулярных данных помогает в решении этих проблем, но пока еще остается много неясных вопросов (Samson, 1995).
В результате современных исследований многие из агрегатов видов, описанных Rifai (1969), разбиты на отдельные виды и на данный момент известно 29 видов рода Trichoderma. Но определение их довольно сложно в первую очередь из-за отсутствия единого ключа ко всему роду, а не только к отдельным его группам (Bissett, 1991 b; Samuels et al., 1998; Samuels et all., 1999).
Грибы рода Trichoderma являются активными целлюлозолитиками и хитинолитиками, поэтому их используют для получения ферментов, разрушающих хитин, целлюлозу, лигнин и пектин, которые применяются в целлюлозно-бумажной, пищевой, топливной промышленности, при производстве спирта, а также в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях (Archer, Peberdy, 1997). Их также используют для производства кормового белка. Кроме того, из них получают биологически активные вещества, в том числе некоторые антибиотики и токсины (пептаиболы, циклоспорины) (Samuels, 1996; Ghisalberti, Sivasithamparam, 1991).
Способность разрушать хлорорганические вещества и различные пестициды, гербициды и инсектициды, а также полиэтилен и некоторые пластмассы открывают возможность для использования с помощью биоочистки загрязненных почв и в переработке отходов (Esposito, Dasilva, 1998).
Грибы этого рода являются удобным объектом для биохимических физиологических и генетических исследований. Физиология этого рода активно изучается на примере вида Т. reesei E.G. Simmons, который является модельным объектом для биохимических, генетических и физиологических исследований.
Кроме положительных, с точки зрения человека свойств, она имеет и несколько отрицательных. Так Trichoderma наносит сильный ущерб при коммерческом выращивании грибов, таких как шампиньоны, шии-таке и вешенка, развиваясь на субстрате или поражая плодовые тела (Castle et al., 1998; Tokimoto et al., 1998; Muthumeenakshi et al., 1998).
В ряде случаев Trichoderma может представлять опасность для здоровья неловка. Так, в недавнее время выяснилось, что она вызывает глубокие микозы у людей с подавленным иммунитетом, в основном у пациентов, перенесших пересадку органов (Munoz et al., 1997). А также может быть потенциальным аллергеном, особенно для работников лесопилок и деревообрабатывающих комбинатов (Halpin et al., 1994).
Грибы этого рода образуют одни из наиболее сильных известных грибных токсинов, таких как виридин, глиотоксин, триховиридин, дермадин, аламетицин, трихополины и могут являться причиной токсикозов почв.
Способность подавлять рост и развитие других грибов, а также паразитировать на них, поражая гифы и склероции, вместе с неспособностью поражать живые растения, используется в сельском хозяйстве для биологического контроля паразитов растений. Препараты на основе видов рода Trichoderma используются для защиты растений от широкого круга болезней, вызванных грибами, а также почвенных нематод, как в теплицах, так и в открытом грунте, а также для стимуляции роста и развития растений. Сейчас существует несколько коммерческих препаратов на основе разных видов рода Trichoderma, и активно разрабатываются новые преимущественно комплексные средства защиты растений (Сидорова, 1980; Chet, Inbar, 1994; Великанов, 1997). В нашей стране широко применяется препарат «Триходермин» на основе активных штаммов Trichoderma, получаемый путем культивирования этих грибов на различных растительных отходах, как в биологических лабораториях, так и непосредственно в хозяйствах (Федоринчик и др., 1974; Бадяй, 1984).
Химический метод защиты растений давно критикуется как небезопасный для окружающей среды. Напротив, биологический метод считается экологически чистым (Великанов, Сидорова, 1988; Baker, 1991; Lynch, Crook, 1992; Chet, Inbar, 1994). Однако интродукция в сообщество сильных неспецифических конкурентов влияет не только на паразитов растений, но и на организмы не мишени, что может привести к нарушению равновесия в биоценозе. При использовании Trichoderma для защиты растений не было исследовано ее влияние на сапротрофную почвенную биоту.
Исследования, посвященные этой теме, отсутствуют, хотя существуют указания на то, что каждый микробиологический препарат должен проходить такую же длительную проверку экологической безопасности, как и химические средства защиты растений (Филиппов, Кузнецова, 1994; Cook et al., 1996). В связи с этим одной из целей нашей работы было определить влияние интродуцированного в почву антагониста на микобиоту на примере активного штамма Trichoderma harzianum Rifai, использующегося для защиты картофеля от Rhizoctonia solani Kiihn.
Хотя работ по применению видов Trichoderma довольно много, их изученность в природе явно недостаточна. Видовой состав и распространение этого рода гифомицетов в России изучены не полно. Г.Ш. Сейкетов (1982), занимаясь этим вопросом, использовал систему, в которой Trichoderma делится только на пять видов. Другие исследователи пользовались более современной и общепринятой системой, введенной индонезийским микологом Rifai (1969), но их исследования были ограничены определенной территорией (Шарова, 1983; Салина, 1988; Курини, 1991). Кроме того, и эта система на данный момент устарела, так как сейчас описаны новые виды, большинство из которых встречаются довольно широко (Turovzi et al., 1994; Samuels et all., 1999). Нечеткая морфология этого рода и отсутствие доступных ключей затрудняет определение видов, в связи с этим их распространение в России не изучалось, что и представляет новизну данной работы.
Вместе с тем, существует путаница с названиями из-за того, что в разных работах в основном по практическому применению использовались разные таксономические системы. Это затрудняет исследования этого рода, так как не всегда ясно о каком виде идет речь (Шарова, 1981; Сидорова, 1980).
Таким образом, ОДНОЙ ЦЕЛЬЮ настоящей работы стало изучение разнообразия и распространения грибов рода Trichoderma в нашей стране с учетом новой систематической концепции. ДРУГОЙ ЦЕЛЬЮ была оценка влияния Trichoderma на сапротрофную почвенную микобиоту при ее интродукции в агроэкосистему.
Для достижения этих целей нами были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Изучить видовое разнообразие рода Trichoderma на территории России, принимая во внимание описанные новых видов;
2. Проанализировать географическое распространение видов этого рода в различных географических областях;
3. Сравнить морфологию изолятов, которые были получены из разных географических регионов;
4. Оценить значение различных морфологических признаков для идентификации видов рода Trichoderma;
5. Составить ключ для определения всех описанных на данный момент видов;
6. Найти телеоморфные стадии некоторых видов рода Trichoderma в природе и посмотреть их распространение;
7. Составить коллекцию, которая в последствии может быть использована для поиска активных штаммов для биоконтроля и продуцентов биологически активных веществ;
8. Оценить выживаемость Т. harzianum в окультуренной почве опытного поля Звенигородской биостанции МГУ.
9. Определить влияние широко используемого для защиты растений вида Т. harzianum на сапротрофную почвенную микобиоту.
Научная новизна результатов исследования состоит в подробном изучении распространения видов рода Trichoderma по территории России, обнаружении 14 видов ранее не отмеченных для России, выявлении совершенной стадии трех видов, ранее не описанных на территории России. Впервые показано, что биологические методы защиты растений могут иметь отрицательные экологические последствия: интродукция антагониста приводит к изменению структуры комплекса микромицетов, не являющихся мишенью биоконтроля, что может привести к нарушению равновесия в сообществе почвенных организмов, а также почвообразовательных процессов.
Практическое значение работы состоит в составлении ключей для определения всех описанных на данный момент видов. Так же собрана большая коллекции изолятов (726), которые могут быть использованы в практических це;ях (пять штаммов переданы в коллекцию промышленных микроорганизмов при Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов).
В основу работы положен материал, собранный в период с 1994 по 1999 годы собранный в 24 регионах России и некоторых других государств.
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Полевой эксперимент проведен на Звенигородской биостанции МГУ.
Я сердечно благодарю сотрудников, студентов и аспирантов кафедры микологии и альгологии МГУ, оказавших мне неоценимую помощь в сборе, материала. Особую благодарность автор выражает Л.Л. Великанову и И.И. Сидоровой, под непосредственным руководством которых была выполнена данная работа.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории сенсорных систем ИППИ РАН за предоставленную возможность обработки образцов на микроскопе и помощь в подготовке иллюстративного материала.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ (проект № 98-04-488813).
