Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы.
2.1. Грибы - возбудители биоповреждений строительных материалов 7
2.2. Основные компоненты древесины - ДСП 10
2.2.1. Укладка молекул целлюлозы в древесине 10
2.2.2. Строение лигнинового компонента древесины 12
2.3. Деструкция древесины грибами 14
2.4. Метаболиты микромицетов, участвующие в деструїщии строительных материалов на основе древесины 24
2.4.1. Строение и механизм действия целлюлазного комплекса 24
2.4.2. Строение и механизм действия лигнолитического комплекса 33
2.4.2.1. Характеристика и механизм действия фенолоксидаз 33
2.4.2.2. Характеристика и механизм действия каталазы 39
2.4.2.3. Характеристика и механизм действия пероксидазы 43
2.5. Механизмы действия фунгицидов на микроорганизмы 47
2.6. Терпены, как биоцидные препараты 49
III. Экспериментальная часть.
3.1. Объекты и методы исследований 52
3.1.1. Объекты исследований 52
3.1.2. Основные методы исследований 52
3.2. Результаты и их обсуждение 62
3.2.1. Идентификация микромицетов, выделенных с зараженных ДСП 62
3.2.2. Выявление деструкторов ДСП 65
3.2.3. Определение грибостойкости ДСП 66
3.2.4. Биохимическое тестирование грибов - деструкторов ДСП на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса 70
3.2.5. Лигыолитическая активиость грибов - истинных деструкторов ДСП 73
3.2.6. Целлюлолитическая активность грибов - истинных деструкторов ДСП 91
3.2.7. Биодеструкция лигнина из ДСП микроскопическими грибами...98
3.2.8. Исследование биоциднои активности некоторых производных дитепреноидов 109
3.2.9. Определение сублетальной концентрации Биоцика Т для грибов Aspergillus fiimigatus, Paecilomyces carneus, Stemphyliiim verruculosum, Trichoderma koningii 111
3.2.10. Исследование активности экстрацеллюлярных ферментов грибов, выделенных с ДСП, в условиях воздействия биоцидами 114
3.2.11. Определение грибостойкости ДСП, обработанных фунгицидом БиоцикТ 119
125 127 .141
Заключение 122
IV. Выводы
V. Цитированная литература
Список используемых сокращений
- Грибы - возбудители биоповреждений строительных материалов
- Строение и механизм действия целлюлазного комплекса
- Идентификация микромицетов, выделенных с зараженных ДСП
- Исследование активности экстрацеллюлярных ферментов грибов, выделенных с ДСП, в условиях воздействия биоцидами
Введение к работе
Актуальность темы. Среди всех видов биоповреждений микробиологические особенно часто встречаются и приносят большой ущерб. На их долю, по данным статистики, приходится около 20% от общего числа повреждений материалов (Анисимов, 1985). Известно, что древесина и строительные материалы на ее основе (древесностружечные плиты - ДСП) могут подвергаться процессу биоповреждений. Основными агентами биоповреждений древесностружечных плит являются различные микроорганизмы, главным образом микроскопические грибы (Баженов и др., 1992).
Доминирующая роль грибов среди микроорганизмов в процессах биоповреждений обусловлена их метаболическими особенностями, которые заключаются в очень богатом ферментативном аппарате (Дьяков, 2003). С его помощью они осуществляют разнообразные химические превращения сложных субстратов, которые не доступны другим микроорганизмам. Многим грибам свойственна способность образовывать токсические продукты, что еще больше повышает их конкурентоспособность за освоение субстрата (Каневская, 1984). Немалую роль в микологическом повреждении материалов играет способность грибов расти в биологически экстремальных условиях. Споры стойки к высыханию, известны случаи, когда они выдерживали высушивание в течение 20 лет и более. Значительная часть грибных спор переносит низкие температуры без потери биохимической активности. Отличительной особенностью некоторых грибов, вызывающих повреждение материалов, является их способность расти на твердых сухих субстратах за счет атмосферного увлажнения (Ильичев и др., 1987).
В качестве своеобразной экологической ниши для грибов в настоящее время выступают различные промышленные и строительные материалы (бумага, древесина, металл, бетон, пластмасса, резина, кожа, топливо, лаки, краски, и т. д.), в результате «колонизации» которых сапрофитными грибами формируется своеобразная группа грибов - технофилов. Биоповреждение материалов и изделий микроскопическими грибами происходит за счет механического разрушения разрастающимся мицелием, биозагрязнения и, главным образом, вследствие воздействия ферментов и органических кислот (Анисимов и др., 1987).
В последнее время много внимания уделяется биодеградации строительных материалов
на основе древесины. Одним из таких материалов, имеющим широкое применение в
строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении являются
древесностружечные плиты (ДСП). В настоящее врёмЧАМя1&й4у*й«»зДСП на основе
| БИБЛИОТЕКА |
фенолоформальдегидных и на основе карбамидных полимеров. Однако имеется ряд преимуществ карбамидных плит перед фенолоформальдегидными ДСП. К недостаткам фенолоформальдегидных ДСП относятся выделение свободного фенола и формальдегида, специфический запах и темная окраска. Плиты на основе карбамидных полимеров не имеют запаха, бесцветны, стойки к действию ркружающей среды, экологически безопасны. Известно, что и ДСП на основе фенолоформальдегидных, и на основе карбамидных полимеров подвержены разрушающему действию грибов, главным образом микромицетов. Однако процесс биодеструкции изучен слабо.
Учитывая постоянно совершенствующиеся рецептуры изготовления и прессования ДСП, а также высокие адаптационные возможности микроскопических грибов, необходимо целенаправленное изучение механизмов и причин деструкции ДСП, что позволит осуществить целенаправленный поиск средств защиты данного строительного материала.
Цели и задачи исследований. Данная работа посвящена исследованию процесса деструкции микроскопическими грибами различных рецептур ДСП с целью поиска эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических повреждений.
Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:
изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП,
выявить наиболее активных деструкторов ДСП,
провести биохимическое тестирование микроскопических грибов на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса,
исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - истинных деструкторов ДСП,
изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП,
произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от биоповреждений.
Сєяіь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках Всероссийской программы фундаментальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.). Направление 12. Экологические проблемы биоповреждений».
**
Научная новизна работы. В работе впервые дан сравнительный видовой анализ микобиоты двух типов древесностружечных плит на фенолформальдегидной и карбамидной основе.
Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест -культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.054-91.
Впервые выделены и идентифицированы «дикие» штаммы микроскопических грибов, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять биодеструкцию древесностружечных плит.
Определены наиболее активные грибы - деструкторы ДСП которые могут разрушать как фенолформальдегидные, так и карбамидные плиты: Aspergillus Jumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii. Для данных микроскопических грибов подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП.
Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов - деструкторов данного материала: выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и целлюлазная активности исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП.
Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП: сернокислотного лигнина из ДСП на основе фенолформальдегидных смол (СЛ из ФФДСП), сернокислотного лигнина из ДСП на основе карбамидных смол (СЛ из КДСП), диоксанового лигнина из плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП), диоксанового лигнина из плит на основе карбамидных смол (ДЛ из КДСП).
Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод зашиты ДСП от биоповреждений.
Практическая значимость работы. Разработаны приемы повышения биостойкости древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания НОВОЙ рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Рекомендуемые нами препараты могут быть использованы не только на стадии производства плит, но и на стадии эксплуатации данного материала. Даны рекомендации по дополнению
существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных материалов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано и принято к печати 12 работ
Положения, выносимые на защиту. 1 Показано, что несмотря на наличие в составе ДСП грибостойких компонентов (фенолформальдегидных и карбамидных смол), данные материалы способны разрушаться микроскопическими грибами.
2. Все виды лигнина, выделенные из фенолформальдегидных и карбамидных плит сернокислотным и диоксановым методами, способны поддерживать рост микодеструкторов, то есть не являются грибостойкими (за исключением препарата ДЛ из ФФДСП).
3 Скрининг ряда дитерпеноидов на наличие у них фунгицидной активности позволил рекомендовать препарат Биоцик Т в качестве средства защиты ДСП от микробиологических биоповреждений.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологических повреждений материалов» (Пенза, 2002), I Всероссийской научно-технической конференции «Проблемы строительного материаловедения: Соломатовские чтения» (Саранск, 2002), IV Международной научно-практической конференции «Реставрація музейних пам яток в сучасних умовах Проблеми та шляхи іх вирішення» (Киев, 2003), VIII (IX, X) Нижегородской сессии молодых ученых (Н Новгород, 2003. 2004, 2005), Международной научно-технической конференции «Биоповреждения и биокоррозия в строительстве» (Саранск, 2004), Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы строительства» (Саранск, 2004), 9 Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), 1-ый Международный форум «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005). На основе проекта: «Физиолого-биохимические основы защиты древесностружечных материалов от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами» получен грант Министерства образования и науки Российской федерации по ведомственной научной программе «Развитие научного потенциала высшей школы». Задание 4597 - 2005 год.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 136 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. В работу включено 26 рисунков и
13 таблиц Указатель литературы включает 139 источников, в том числе 26 на иностранных языках.
Грибы - возбудители биоповреждений строительных материалов
Под биоповреждениями в настоящее время понимают такие ситуации, когда живые организмы своей деятельностью и присутствием вызывают изменения структурных и функциональных характеристик у объектов антропогенного происхождения или природный объектов, используемых в качестве сырья (Экологические и биологические аспекты .,., 2002). К группе морфологических признаков проявления биоповреждений относят: обрастание поверхности мицелием грибов, появление окрашенных пятен; появление язв, каверн и трещин на поверхности материала; К группе признаков биоповреждений по изменению свойств материалов относят: изменение физико-механических свойств материалов, например потеря прочности древесины, резины, пластиков, под действием микроорганизмов или их метаболитов; ухудшение электрофизических свойств, например снижение электроизоляционных свойств материалов; изменение оптических свойств, например, опалесценция и потеря прозрачности стёкол оптических приборов, протравленных метаболитами грибов; изменение химических свойств материалов в результате окисления или гидролиза пластификаторов в пластиках, целлюлозы в древесине (Биоповреждения, 1987). Среди микроорганизмов, повреждающих различные материалы и изделия, первое место принадлежит мицелиальным грибам в силу быстрого роста мицелия, богатства, мощности и лабильности их ферментных систем, позволяющих им использовать большой круг материалов как природного, так и искусственного синтеза (Андрекж и др., 1980). Грибы имеют некоторые морфологические, физиологические и генетические особенности, благодаря которым они занимают доминирующие положение среди организмов, вызывающих биоповреждения. Для повреждения материалов необходимо присутствие микроорганизмов в окружающей среде. Грибы очень широко распространены по всему земному шару. Благодаря своим микроскопическим размерам они могут проникать в невидимые глазу трещины и поры, которыми пронизаны даже такие плотные материалы, как гранит и металл. Иногда грибы обнаруживаются на стыке полимера и входящих в его состав компонентов (Каневская, 1984). Споры могут с током воды просачиваться вглубь некоторых материалов, особенно пористых. Эти примеры свидетельствуют о том, что грибы можно встретить всюду, даже там, куда не проникают другие организмы. Большую роль при заселении материалов играет способность спор адсорбироваться на гладкой поверхности (Шлегель, 1987; Махова и др., 2001). Адгезия является первым этапом биоповреждений твердых нерастворимых субстратов. Закрепившись на поверхности материалов, при благоприятных условиях споры прорастают, образуя мицелий. Мицелиальное строение грибов является одной из наиболее важных биологических особенностей, определяющих их специфику взаимоотношения со средой. Мицелий быстро распространяется по субстрату и захватывает большие площади (Агрессивные метаболиты грибов..., 1994).
Доминирующая роль грибов среди микроорганизмов в процессах биоповреждений обусловлена их метаболическими особенностями, которые заключаются в очень богатом ферментативном аппарате. Грибы образуют инвертазу, амилазу, протезу, липазу, фосфатазы, танназу, оксидазу а-аминокислот, пектиновые ферменты, фенолоксидазу, каталазу, комплекс целлюлаз и др. Ферментативный аппарат грибов наиболее богат по сравнению с другими микроорганизмами (Дьяков, 2003). С его помощью они осуществляют разнообразные химические превращения сложных субстратов, которые не доступны другим микроорганизмам. Многим грибам свойственна способность образовывать токсические продукты, что еще больше повышает их конкурентоспособность за освоение субстрата (Каневская, 1984). Опасность для многих материалов представляют и другие продукты метаболизма грибов, особенно органические кислоты. Немалую роль в микологическом повреждении материалов играет способность грибов расти в биологически экстремальных условиях. Споры стойки к высыханию, известны случаи, когда они выдерживали высушивание в течение 20 лет и более. Значительная часть грибных спор переносит низкие температуры без потери биохимической активности. Отличительной особенностью некоторых грибов, вызывающих повреждение материалов, является их способность расти на твердых сухих субстратах, за счет атмосферного увлажнения (Биоповреждения, 1987).
В качестве своеобразной экологической ниши для грибов в настоящее время выступают различные промышленные материалы (металл, бетон, пластмасса, резина, кожа, топливо, лаки, краски, бумага и т.д.), в результате «колонизации» которых сапрофитными грибами формируется своеобразная экологическая группа грибов - технофилов. Биоповреждение материалов и изделий плесневыми грибами происходит за счет механического разрушения разрастающимся мицелием, биозагрязнения и главным образом вследствие воздействия ферментов и органических кислот (Анисимов и др., 1987).
Разрушение микроорганизмами обычно происходит под действием не одной какой-либо группы, а комплексом, включающим и бактерии, и грибы. Одна группа микроорганизмов своей деятельностью подготавливает субстрат для другой. При этом возникает отдельные связи между отдельными микроорганизмами, постоянно формируется взаимосвязанные ассоциации, обеспечивающие выживание и адаптацию каждого вида в отдельности (Биоповреждения, 1987). Видовое многообразие микромицетов, их исключительно высокая адаптируемость к условиям обитания приводит к тому, что микромицеты занимают лидирующие положение в биодеструкции промышленных и строительных материалов (Экологические и биологические аспекты..., 2002).
Строение и механизм действия целлюлазного комплекса
На основании сложившегося интуитивно представления о том, какие именно компоненты объединять в понятии «целлюлазные системы», имеются весьма серьезные поводы для разногласий. Так по традиции, к ним не относят Р-гликозилгидролазы, действующие на короткие целлоолигосахариды, но имеющие высокое сродство к 1,4-(3-гликозидной связи. С другой стороны, часто к целлюлазам причисляют ксиланазы, причем как с относительной, так и с абсолютной специфичностью к 1,3-3" гликозидной связи. Можно основать классификацию на основе способности к расщеплению конкретно 1,4-р-гликозидной связи, и рассматривать соответствующие классы гидролаз (КФ 3.2.1.4; 21; 73; 74; 91). Можно использовать более строгий критерий — разложение упорядоченных форм целлюлозы, и на этом основании ограничить рассмотрение только специфическими целлобиогидролазами (КФ 3.2.1.91) (БилаЙ, 1965; Кретович, 1967; Гусаков, Синицын, 1998; Кураков, Болобова, 1999). Чаще всего семейство целлюлаз представляют комплексом трех ферментов: 1. Эидоцеллюлазы (КФ 3.2.1.4) - эндо-1,4-Р гликаназа, носящая ранее название Сх-фермента (Мг=23,5-58,0 кДа), неупорядоченно гидролизует внутренние гликозидные связи в целлюлозных полимерах, образуя новые концы цепей и олигосахариды различной длины. 2. Экзоцеллюлазы или целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91) (до обнаружения гидролазной активности назывались С [-ферментом Мг=60,5-62,0 кДа) отщепляют с концов молекулы целлюлозы димеры (целлобиозу). 3. р-гликозидазы (КФ 3.2.1.21) или целлобиазы действуют на целлобиозу (С2-фермент Мг=76 кДа), расщепляя ее до глюкозы (БилайД982; Марченков, 2002; Enzymatic Properties..., 2002).
Но такой подход не оправдывает себя тем, что оставляет неучтенным множество форм ферментов, участвующих в разложении целлюлозы. Целлюлолитическая система Trichoderma reesei является одной из наилучшим образом охарактеризованных в этом аспекте (Worthington Cellulase, 2004). Сообщают, что мутантные типы производят свыше 35 г/л внеклеточного белка, и почти весь выделенный белок состоит из целлюлаз и гемицеллюлаз (Enzyme production..., 1991; ACEII, a Novel Transcriptional Activator..., 2001). Известно, что данный гриб продуцирует все компоненты целлюлазного комплекса в нескольких формах: две целлобиогидролазы (СВН 1 и II), эндогликаназы (EGL I, II, III, IV, V) (Miettinen-Oinonen and Suommen, 2002), р-гликозидазы (BGL I и II) (Saroj et al., 1989). В настоящее время поиск форм данных ферментов продолжается (База данных Expasy; Рабинович, Мельник, 2003; Enzymatic Properties..., 2002).
К индивидуальным свойствам ферментов относятся: способ их действия на целлюлозу, молекулярную активность (т. е. какие участки целлюлозы и с какой скоростью будут расщепляться данным конкретным ферментом), их способность адсорбироваться на поверхности целлюлозы, рН и температурный оптимумы действия (в зависимости от источника, фермент может проявлять активность в кислой, нейтральной или щелочной среде, а также при умеренной, 40-50С, или повышенной, 60-80С, температуре), и, наконец, их стабильность при конкретных условиях применения (Билай, 1965; Брустовецкая и др., 1991; Квеситадзе и др., 1997). Соотношение между эндогликаназной и целлобиогидролазной активностью в целлюлазном комплексе также зависит от генетических свойств микробного штамма -продуцента и условий его культивирования (Hydrolysis of cotton cellulose..,, 1994; Гусаков, Синицын, 1998). На целлюлазную активность грибов влияют многие факторы. Производство основных целлюлаз у Trichoderma регулируется на транскрипционном уровне в зависимости от доступного источника углерода: гены подавляются глюкозой и индуцируются целлюлозой или дисахаридом софорозой (АСЕІІ, a Novel Transcriptional Activator..., 2001). Так, например, показано, что высокие концентрации (20 г/л) сахарозы или глюкозы подавляли целлтололитическую активность грибов (Билай, 1965). Даже в отсутствии целлюлозы в грибах присутствует высокий уровень транскриптов двух участников целлюлазной системы (cbhl и egll), которые индуцируются, по крайней мере, 1100-кратно в присутствии целлюлозы (Cellulase induction..., 1997). Причем замечено, что глюкозная репрессия связана с промоторами, тогда как софорозная индукция проявляется независимо от наличия или отсутствия промотора (Functional analysis..., 1996; Enzymatic Properties..., 2002). Такие соединения, как глицерол и сорбитол, не влияют на экспрессию целлюлаз (Functional analysis..., 1997).
Для работы внеклеточного комплекса целлюлаз Myrothecium verrucaria был выяснен оптимум рН 5-6 (диапазон активного рН: 5-9) (Билай, 1965). Оптимум рН в нейтральной и слабокислой среде для ферментного комплекса можно объяснить тем, что рН среды вследствие проявления грибами активности С]-фермента повышается (Нюкша, Коссиор, 1976а).
Показано (Cellulose hydrolysis..., 1994), что концентрация фермента, необходимая для достижения половины от максимальной степени гидролиза, находится в районе 3-4 мкМ для целлобиогидролаз и 0,05-0,10 мкМ для эндогликаназ. Для эффективного гидролиза данные ферменты должны работать совместно и синхронно (Wood et ah, 1989). Совместное действие различных групп ферментов является более эффективным, чем их отдельная работа (Regulation of cellulase gene..., 1997; Тарабукин, 2003). 2) Строение целлюлолитических ферментов.
В начале исследования целлюлаз еще не были расшифрованы пространственные структуры белков, поэтому структура целлюлаз, по аналогии с одним из первых изученных ферментов - лизоцимом из яичного белка, представлялась довольно просто: в виде компактной глобулы с углублением (активным центром), в котором происходит каталитический разрыв целлюлозной цепи (Рабинович, Мельник, 2003).
Идентификация микромицетов, выделенных с зараженных ДСП
Одним из широко распространенных материалов, имеющим широкое применение в строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении является ДСП (древесностружечные плиты). Однако в процессе эксплуатации древесностружечные плиты могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, главным образом микроскопических грибов (Анисимов, 1983; Баженов и др., 1992). Сведения об их грибостойкости весьма противоречивы. Это связано с рядом причин. Во-первых, степень биоразрушения материала во многом зависит от способа получения ДСП, а именно от разновидности смолы, используемой в качестве связующей стружек. ДСП на фенолформальдегидной основе, как правило, более грибостойки по сравнению с одноименными материалами на основе карбамидной (мочевиноформальдегядной) смолы. Во-вторых, с течением времени мочевино- и фенолформальдегидные смолы могут улетучиваться из состава материала и, как следствие, грибостойкость плит изменяется. В-третьих, высокая адаптируемость микроскопических грибов к условиям обитания приводит к тому, что ранее грибостойкие материалы утрачивают это качество и становятся нестойкими к биоразрушению. В-четвертых, для оценки грибостойкости не всегда используются истинные деструкторы данного материала, а, зачастую, грибы, развивающиеся на древесностружечных плитах за счет внешних загрязнителей. Это особенно важно для разработки биостойких рецептур ДСП.
В связи с этим представляло интерес исследовать фенолформальдегидные и карбамидные плиты на предмет разрушения их микромицетами и сравнить их деструкторов.
На первом этапе работы определили грибы, поражающие данные материалы в условиях их эксплуатации. С пораженных микромицетами фенолформальдегидных ДСП выделили в чистую культуру штаммы грибов, относящиеся к 27 видам, а с карбамидных плит - штаммы грибов, относящиеся к 30 видам. Идентификацию микромицетов производили на основании их морфолого-культуральных особенностей, используя определители (таблица 1).
Таксономическая характеристика микроскопических грибов, выделенных с древесностружечных плит, дана в таблице 1. Результаты исследований показали, что микобиота фенолформальдегидных древесностружечных плит (ФФДСП) представлена 11 родами, 3 семействами, 2 порядками и 2 классами. К классу Hyphomycetes принадлежат 2 семейства: Dematiaceae и МопШасеае. Семейство МопШасеае является ведущим семейством, на его долю приходится около 75% видового состава грибов, а самыми распространенными родами внутри этого семейства - род Aspergillus, к которому относятся 9 видов и род Penicillium - 6 видов. Второй класс - Zygomycetes самый малочисленный, представлен 1 семейством (Мисогасеае) и 2 видами грибов. Эколого-систематический анализ грибов, выделенных с карбамидных древесностружечных плит (КДСП) показал, что их микобиота представлена 2 классами, 3 порядками, 4 семействами и 10 родам. Помимо обнаруженных и на ФФДСП семейств Dematiaceae и МопШасеае, на КДСП выявили еще одно семейство Tuber culariaceae, представленное одним видом гриба (Fusarium moniliforme). Данное семейство является самым малочисленным наряду с семейством Мисогасеае, представленное тремя видами грибов. Самое богато представленное семейство, как и в случае с ФФДСП - семейство МопШасеае, на его долю приходится более 73% видового состава грибов. Полученные данные согласуются с известными из источников литературы, где представители этого семейства также являются наиболее часто встречаемыми на производных древесины (Билай, 1965; Нюкша, Коссиор, 19766; Кондратюк, Жданова, 2002). Самыми распространенными родами этого семейства, как и в случае ФФДСП были род Aspergillus и РєпісіШит, однако на КДСП, в отличие от ФФДСП более многочисленным является род РєпісіШит (10 видов), а не Aspergillus (7 видов). Анализ видового разнообразия грибов выявил, что существует ряд микромицетов, обнаруженных только на каком-либо одном типе ДСП. Так, на ФФДСП не замечен рост грибов, принадлежащих к роду Fusarium и Alternaria, в то время как на КДСП их рост выявлен. С другой стороны, рост родов Botrytis, МопШа, Sterigmatobotrys не отмечен на КДСП, но присутствует на ФФДСП. Обнаружение роста микромицетов на каком-либо материале не позволяет с уверенностью утверждать, что данные грибы являются истинными его деструкторами, т. е. способны использовать компоненты материала в качестве источника питания. Возможен рост микромицетов за счет внешних загрязнителей, которые в обязательном порядке присутствуют на поверхности материала. Как уже отмечалось выше, многие исследователи, изучающие микобиоту строительных материалов, обнаружив рост грибов, ограничиваются этим, не выявляя истинных деструкторов. Нами была предпринята попытка выяснить, какие из выделенных плесневых грибов являются истинными деструкторами древесностружечных плит. Для выявления плесневых грибов - истинных деструкторов древесностружечных плит проводили оценку грибостойкости (ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051-91 с добавлением в качестве тест - культур выделенных с древесностружечных плит штаммов). Метод устанавливает, является ли материал источником питания для развития грибов без дополнительных источников питания. Среди 27 видов микроскопических грибов, выделенных с ФФДСП, истинными деструкторами оказались только 12 видов {Aspergillus flavus, А. fumigatus, A. orysae, A. penicilloides, Botryosporium longihrachiatum., Mucor globosus, M. hiemalis, Paecilomyces carneus, Penicillium palitans, P. nigricans, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii). А среди 30 видов микромицетов, выделенных с КДСП - 14 видов (Aspergillus carbonarius, А. fumigatus, A. niger, A. ustus, Alternaria alternata, Paecilomyces carneus, Penicillium cyclopium, P. funiculosum, P. notatum, P variabile, P. variotii, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii, T. lignorum). Остальные виды плесневых грибов, рост которых был также обнаружен на материале, не могли использовать компоненты древесностружечных плит в качестве единственного источника питания. Рост их на ДСП происходил, вероятно, за счет внешних загрязнителей.
Исследование активности экстрацеллюлярных ферментов грибов, выделенных с ДСП, в условиях воздействия биоцидами
В настоящее время о причинах и механизмах деструкции древесины многое известно, однако сведения о древесностружечных плитах, в состав которых помимо древесных частиц входят также и полимерные смолы отсутствуют. Тем не менее, вопрос деструкции ДСП очень актуален, так как данный строительный материал имеет широкое применение. Мировое производство древесностружечных плит (ДСП) составляет 45 миллионов кубометров в год. Большой объем производства обусловлен тем, что древесностружечные плиты находят широкое применение в мебельной промышленности, строительстве, вагоно- и автомобилестроении. Известно, что в процессе эксплуатации древесностружечные плиты могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, главным образом микроскопических грибов. Однако не исследованы механизмы и причины деструкции данного строительного материала, не выявлены его грибы -деструкторы, не изучены физиолого-биохимические особенности микромицетов — деструкторов ДСП. В данной диссертационной работе предпринята попытка восполнения указанных пробелов.
Данная работа посвящена исследованию процесса деструкции микроскопическими грибами ДСП различных рецептур с целью поиска эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических повреждений.
Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи: изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП, выявить наиболее активных деструкторов ДСП, провести биохимическое тестирование микроскопических грибов на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозиого комплекса, исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - истинных деструкторов ДСП, изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП, произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов: Биопаг-2; Бионик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от биоповреждений.
В работе впервые дан сравнительный видовой анализ микобиоты двух типов древесностружечных плит на фенолформальдегидной и карбамидной основе. Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест - культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051-91. Впервые выделены и идентифицированы «дикие» штаммы микроскопических грибов, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять биодеструкцию древесностружечных плит. Определены наиболее активные грибы - деструкторы ДСП, которые могут разрушать как фенолформальдегидные, так и карбамидные плиты: Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculoswn, Trichoderma koningii. Для данных микроскопических грибов подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП. Исследованы физиолога-биохимические особенности микромицетов - деструкторов данного материала: выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и целлюлазная активности исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП. Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП. Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод защиты ДСП от биоповреждений.
Разработаны приемы повышения биостойкости древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостоикого типа. Рекомендуемые нами препараты могут быть использованы не только на стадии производства плит, но и на стадии эксплуатации данного материала. Даны рекомендации по дополнению существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных материалов.
Показано, что несмотря на наличие в составе древесностужечных плит грибостойких компонентов (фенолформальдегидных и карбамидных смол), данные материалы способны использоваться микроскопическими грибами в качестве источников питания. Большую степень биодеструкции микроскопическими грибами демонстрировали ДСП на карбамидной основе как под действием стандартных, так и «диких» тест - культур, чем ДСП на фенолформальдегидной основе. Грибы, синтезирующие экстрацеллюлярные лигнинолитические (фенолоксидазу, каталазу, пероксидазу) и целлюлолитические ферменты, оказались более активными деструкторами ДСП. Установлено, что все виды лигнина (за исключением ДЛ из ФФДСП), выделенные из фенолформальдегидных и карбамидных плит сернокислотным и диоксановым методами, способны поддерживать рост микромицетов — активных деструкторов ДСП. Скрининг ряда дитерпеноидов на наличие у них фунгицидной активности и изучение их ингибирующего действия на ряд экстрацеллюлярных ферментов позволили рекомендовать препарат Биоцик Т в качестве средства защиты ДСП от микробиологических повреждений.
