Введение к работе
Актуальность. Среди каротиноидов ликопин обладает наибольшей антиоксидантной активностью и регуляторными свойствами, обусловливающими его перспективность для профилактики и лечения многих хронических заболеваний и рака [Tanaka et. al., 2012], а также для применения в пищевой промышленности и косметологии [Archer et. al., 2008; Anunciato, da Rocha, 2012]. Поскольку химически синтезированный ликопин вызывает побочные эффекты [Scientific committee on food, 1999], возрастает интерес к биотехнологическим способам его получения [Pegklidou et. al., 2008; Tang et. al., 2011; Yan et. al., 2012; Papaioannou, Liakopou-Kyriakides, 2012]. Среди продуцентов гриб Blakeslea trispora наиболее перспективен в связи с высоким выходом каротиноидов.
Изучение каротиногенеза у B. trispora имеет длительную историю. Большой вклад в развитие этой тематики внесли работы М.Н. Бехтеревой, Г.И. Самохвалова, Е.П. Феофиловой, Л.А. Вакуловой и многих других. В результате были разработаны биотехнологии получения в-каротина [Бехтерева, 1973] и ликопина [Феофилова и др., 1998; 2001], в которых используется совместная культура гетероталличных (+) и (-) штаммов гриба. Необходимость использования совместной культуры обусловлена тем, что при половом взаимодействии (+) и (-) штаммов образуются половые гормоны, триспоровые кислоты (ТСК), которые стимулируют каротиногенез [Schmidt et. al., 2005] и контролируют образование покоящихся половых клеток, зигоспор. Однако литературные данные о взаимосвязи зиготообразования, синтеза ТСК и каротиногенеза противоречивы [Бобнева, 1974; Sutter et. al., 1996; Калинина и др., 2007]. Отсутствуют данные о составе триспороидов (ТС) в глубинной культуре, в том числе в условиях стимуляции каротиногенеза, а также не разработан метод количественного анализа состава ТС.
В биотехнологии получения ликопина используется 6-метил-2-аминопиридин (МАП), который ингибирует ликопинциклазу, что приводит к накоплению ликопина в мицелии гриба, но выход его остаётся низким [Феофилова и др., 1998]. В связи с этим, открытым остаётся вопрос поиска путей дополнительной стимуляции синтеза ликопина.
Эмпирически обнаружено, что введение в среду выращивания растительных масел в качестве дополнительного источника углерода приводит к заметной стимуляции синтеза в-каротина [Anderson et. al., 1958; Ciegler et. al., 1959; Pazola et. al., 1968; Bjork et. al., 1970]. Однако данных о влиянии масел на синтез ликопина, растворимость которого в маслах ниже, чем у в-каротина, в литературе не обнаружено. Также неясен механизм их стимулирующего действия, хотя на взаимосвязь липо- и каротиногенеза указывает то, что в клетке липофильные каротиноиды локализованы в липидных глобулах [Murphy, Vance, 1999].
Совокупность вышеизложенного показывает, что исследование содержания и состава ТС в глубинных совместных культурах при различных соотношениях (+) и (-) штаммов B. trispora, в зависимости от их способности к зиготообразованию и в условиях интенсификации каротиногенеза может способствовать выявлению механизмов взаимосвязи этих процессов, а изучение влияния ТСК на липогенез и экзогенных масел на состав запасных и мембранных липидов - прояснить взаимосвязь между липо- и каротиногенезом.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало исследование роли триспороидов и липидов в каротиногенезе мицелиального гриба B. trispora.
Для достижения данной цели были поставлены задачи:
-
Изучить взаимосвязь каротиногенеза с образованием зигоспор и триспороидов у B. trispora;
-
Исследовать состав триспороидов в динамике развития совместных культур B. trispora, при различных соотношениях (+) и (-) штаммов гриба в инокуляте и в условиях стимуляции каротиногенеза МАП и в-иононом;
-
Изучить влияние триспороидов на липогенез у Т (-) штамма гриба;
-
Исследовать влияние экзогенных масел на рост, образование липидов и ликопина в совместной культуре штаммов Т (+) и Т (-) B. trispora.
Научная новизна работы. Установлено, что зиготообразующие пары (+) и (-) штаммов дикого типа Blakeslea trispora синтезируют значительно больше триспороидов и каротиноидов, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Однако прямой корреляции между интенсивностью зиготообразования и активностью каротиногенеза не обнаружено. Основными триспороидами в глубинной культуре гриба являются триспоровые кислоты В и С и их нейтральные предшественники, триспорины и триспоролы, а минорными - триспоровая кислота А и метилтриспораты.
Впервые показано, что совместное применение в-ионона в комбинации с МАП приводит к значительной интенсификации ликопиногенеза и сопровождается ингибированием синтеза триспороидов, особенно ТСК. Впервые установлено, что ТСК оказывают стимулирующий эффект на синтез триацилглицеринов, который снимается при введении экзогенных масел. Впервые выявлено, что экзогенные масла с высоким содержанием Q82 и особенно С18:3 значительно стимулируют образование ликопина, оказывая существенное влияние на состав жирных кислот запасных три- и диацилглицеринов, но не мембранных липидов.
Практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы для оптимизации биотехнологии получения ликопина с использованием гетероталличного гриба B. trispora. Сформулированы критерии отбора каротиногенных штаммов гриба при селекции, в качестве которых могут служить высокий уровень ТСК и (или) способность совместных культур к зиготообразованию. Предложен способ количественного анализа триспороидов, который может быть использован для селекции неспособных к зиготообразованию мутантных штаммов по уровню ТСК. Разработана схема введения двух стимуляторов, в-ионона и МАП, позволяющая в 1.5-2 раза увеличить выход ликопина. Определён критерий подбора экзогенных масел для интенсификации ликопиногенеза - высокое содержание в их составе ненасыщенных жирных кислот C182 и C183. Получены новые данные о синтезе триспороидов, зиготообразовании и каротиногенезе пары штаммов-суперпродуцентов каротиноидов, Т (+) и Т (-).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Зиготообразующие пары штаммов дикого типа синтезируют значительно больше триспороидов и каротиноидов, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Однако между интенсивностью зиготообразования и активностью каротиногенеза прямой корреляции не обнаружено.
-
Стимуляция биосинтеза ликопина под действием в-ионона в комбинации с ингибитором ликопинциклазы, МАП, сопровождается ингибированием синтеза триспоровых кислот.
-
Триспоровые кислоты оказывают стимулирующий эффект не только на синтез каротиноидов, но и на синтез триацилглицеринов.
-
Стимулирующее ликопиногенез действие экзогенных масел с полиненасыщенными жирными кислотами связано с повышением степени ненасыщенности жирных кислот триацилглицеринов липидных глобул клеток гриба.
Апробация. Материалы работы были представлены на V Молодежной школе- конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2009 г.), FEBS Workshop on Microbial Lipids from Genomics to Lipidomics (Вена, Австрия, 2010 г.) и 20th International Symposium on Plant Lipids (Севилья, Испания, 2012 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в т.ч. 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК и 3 тезисов.
Место проведения работы. Работа проводилась в ИНМИ РАН (лаборатория Экспериментальной микологии).
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 13 рисунков и 14 таблиц. Список литературы» содержит 208 источников, в том числе 49 отечественных и 159 зарубежных.
Похожие диссертации на ТРИСПОРОИДЫ И ЛИПИДЫ В КАРОТИНООБРАЗОВАНИИ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Blakeslea trispora
-
