Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Оксигенные фототрофные бактерии 8
1.1.1. Основная характеристика 8
1.1.2. Биоразнообразие 10
1.2. Оксигенный фотосинтетический аппарат - структура и функционирование 14
1.2.1. Фотосинтетические пигменты 14
1.2.1.1. Хлорофиллы 18
1.2.1.2. Фикобилипротеины 22
1.2.1.3. Каротиноиды 26
1.2. Структура оксигенного фотосинтетического аппарата 37
1.2.3. Функционирование оксигенного фотосинтетического аппарата 39
1.3. Антенные системы как аспект биоразнообразия представителей филы Cyanobacteria 43
1.3.1. Типы антенных систем фототрофных организмов 43
1.3.2. Основной светособирающий комплекс оксигенных фототрофных бактерий 47
1.3.2.1.Фикобилисома 47
1.3.2,2. Хлорофилл-содержащий светособирающий комплекс 52
1.4. Систематика и филогения оксигенных фототрофных бактерий 57
1.4.1. Систематика оксигенных фототрофных бактерий: от отдела водорослей Cyanophyta до бактериальной филы Cyanobacteria 58
1.4.2. Филогения Cyanobacteria 64
Глава II. Материал и методы исследования
II. 1. Выделение и культивирование штаммов оксигенных фототрофных бактерий с атипичным пигментным составом 69
II.2. Методы исследования морфологии клеток 72
II.2.1. Световая микроскопия 72
II.2.2. Электронная микроскопия , 72
II.3. Методы анализа пигментного состава клеток 73
II.3.1. Выделение и анализ билиновых пигментов 73
II.3.2. Вьщеление и анализ хлорофилла и каротиноидов 73
II.4. Определение биомассы клеток 74
II.5. Получение сферо пластов Prochlorotrix hollandka 74
II.6. Статистическая обработка результатов 74
Глава III. Результаты и обсуждение
III.1. Коллекция оксигенных фототрофных бактерий с «нестандартными» ССК 76
III.2. Собственно цианобактерии 85
III.2.1. Пигментные типы цианобактерии 85
III.2.2. Одноклеточные цианобактерии, имеющие атипичную пигментацию 88
II 1.2.3. Нитчатые «пурпурные» цианобактерии пор. Oscillatoriales 106
III.2.3.1. Учет внешней морфологии и ультраструктуры при идентификации «пурпурных» цианобактерии nop.Oscillatoriales 106
III.2.3.2. Олигомеризация трихомов - особенность некоторых «пурпурных» цианобактерии p. Pseudanabaena 110
III.2.3.3. Ревизия p. Pseudanabaena 125
III.3. Особенности морфологии и ультраструктуры Prochlorothrix hollandica — хлб-содержащего представителя оксигенных фототрофных бактерий 127
III.4. Новый подход к использованию пигментного критерия в систематике оксигенных фототрофных бактерий 134
Заключение 145
Выводы 147
Список литературы 148
- Функционирование оксигенного фотосинтетического аппарата
- Систематика оксигенных фототрофных бактерий: от отдела водорослей Cyanophyta до бактериальной филы Cyanobacteria
- Выделение и культивирование штаммов оксигенных фототрофных бактерий с атипичным пигментным составом
- Коллекция оксигенных фототрофных бактерий с «нестандартными» ССК
Введение к работе
Молекулярный механизм фототрофии имеет очень древнее эволюционное происхождение. В настоящее время фотосинтетический аппарат рассматривают как одну из важнейших фенотипических черт архаичных бактерий, наряду с грамотрицательным строением, термофилией и углеродавтотрофией (Olsen et al., 1994).
Цианобактерии представляют собой одну из пяти филогенетических групп фототрофных бактерий и отличаются от представителей остальных четырех способностью осуществлять оксигенную фототрофию (чем объясняется второе название этой группы - оксигениые фототрофные бактерии, ОФБ). Функционирование в составе фотосинтетического аппарата ОФБ дегидрогеназной системы, катализирующей светозависимую реакцию окисления воды, приводит к образованию триплетного кислорода. Способность к углерод- и азотавтотрофии позволяет рассматривать ОФБ как важных первичных продуцентов органического вещества.
На протяжении всей своей эволюционной истории цианобактерии служили причиной глобальных геохимических и биотических изменений. По современным представлениям именно они являются пионерами жизни - геохимическая датировка начала оксигенного фотосинтеза приблизительно соответствует палеонтологической датировке появления первых клеточных организмов (см.: Peschek, 1999).
Оксигенные фототрофные бактерии до недавнего времени рассматривались как обладатели трех основных фенотипических признаков:
- прокариотный морфотип;
- фотосинтетический аппарат оксигенного типа;
- фикобилипротсиновый светособирающий антенный комплекс. Непременный и обычно доминирующий компонент ССК, фико цианин, обеспечивает характерную окраску цианобактерии и определяет систематическое название этой группы - Cyanobacteria (от греч. KDOCVSOC; - синий). Специфика положения цианобактерии среди биологических объектов заключается в том, что они одновременно рассматриваются с позиций двух дисциплин: ботаники и бактериологии. Альгологическая система, детально разрабатывавшаяся на протяжении двух столетий, является фенотипической и базируется главным образом на морфологических признаках, описанных для природного материала. Бактериологический подход к систематике этой группы, основан на использовании в качестве объектов выращиваемых культур и учитывает экологические характеристики, культуральные признаки, а также морфологические, ультраструктурные, физиолога-биохимические и молекулярно-биологические свойства лабораторных штаммов.
Таксономическая система ОФБ приведена в III томе 1-го издания «Руководства Берги по систематике бактерий» (1989). В ней, согласно предложенной Rippka с соавторами системе, цианобактерии разбиты на шесть порядков, или «субсекций» (subsection): Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, Stigonematales и Prochlorales. В первые пять порядков входят классические формы ОФБ, имеющие светособирающий комплекс (ССК), содержащий фикобилипротеины (ФБП). Их диагнозы основаны на морфологических признаках, которые диагностируются на клеточном уровне. В шестой порядок, обособленный по хемотаксономическому признаку, вошли т. н. прохлорофиты - формы ОФБ, имеющие ССК, содержащий хлорофилл Ъ (хл Ь): одноклеточный эктосимбионт асцидий Prochloron didemni и нитчатый свободноживущий Prochlorothrix hollandica.
В систематике ОФБ сложилась логически противоречивая ситуация, когда в диагнозах пяти порядков ключевым критерием служит морфология, а шестой порядок обособлен на основе пигментного состава. Создание пор. Prochlorales было необоснованным и в филогенетическом плане - прохлорофиты и другие формы с нетривиальным пигментным составом распределены внутри древа ОФБ, и все чаще их называют «другими» цианобактериями. Термин «цианобактерии» приобрел двойственный смысл: с одной стороны, собственно цианобактерии - это ОФБ, ССК которых состоит из ФБП; с другой стороны, - его стали применять по отношению ко всем ОФБ, В названии диссертации он используется во втором, более широком значении.
Позже были открыты новые одноклеточные ОФБ с нетривиальным пигментным составом. Это свободноживущий Prochlorococcus marinus, содержащий дивинил хл а и дивинил хл b в составе ССК, и эктосимбиотаческий Acaryochloris marina, у которого до 99% хлорофилла составляет хл d. При использовании пигментного критерия в качестве ключевого в обоих случаях речь должна идти о таксонах в ранге порядка, хотя по морфологическим признакам эти изоляты отвечают диагнозу пор. Chroococcales. При дальнейшем накоплении данных о реальном разнообразии пигментного состава ОФБ система, изложенная в 1-ом издании «Руководства Берги...», грозила превратиться в формализованный каталог объектов с различными типами и сочетаниями ССК.
Таким образом, система, предложенная в 1-ом издании «Руководства Берги ...», сохранила принципы морфологической классификации, предложенные еще во второй половине XIX века и составляющие основу традиционной ботанической классификации «сине-зеленых водорослей». Однако формы, имеющие необычный пигментный состав, фактически оказались вне системы.
Для решения этой таксономической проблемы было необходимо проанализировать ранее опубликованные литературные данные о разнообразии ССК у ОФБ и произошедших от них пластид. Наряду с этим требовалось экспериментально изучить свойства ОФБ с неканоническим пигментным составом, в том числе - оригинальные штаммы.
Функционирование оксигенного фотосинтетического аппарата
Основным светособирающим комплексом цианобактерий, Rhodophyceae и Gtaucocystophyceae является PBS. «Стандартная» PBS представляет собой соответственно гемидискоид и гемиэллипсоид (12-24 х 32-70 нм, Mr=7-10 mDa). PBS обращены друг к другу своей главной проекцией и образуют параллельные ряды на цитоплазматической поверхности тилакоидов (Бекасова, 1993; Grossman et al., 1993).
PBS последовательно построены из модульных элементов первого, второго и третьего порядков - соответственно тримеров (аР)у, гексамеров 2( агД 3 и цилиндров [(afyih или стержней [2(аДЬ]г-б (MacColl, 1998). У некоторых штаммов цианобактерий, а также у Rhodophyceae гексамеры РЕ, состоящие из белковых субъединиц сг и Д связывают дополнительную -субъединицу (Grossman et al., 1993),
У отдельных представителей прохлорофитов, которые содержат небольшое количество РВР (Hess et al., 1996; Ни et al., 1999), а также у Cryptophyceae (Glazer, Wedemeyer, 1995) «стандартные» PBS не обнаружены. В случае Cryptophyceae установлено, что высшие агрегаты РВР находятся в интратилакоидном пространстве, однако архитектуру таких «квази-PBS» до сих пор не удалось реконструировать из-за методических трудностей.
«Стандартная» PBS состоит из двух морфологически оформленных доменов - кора из 2-3 центральных цилиндров и периферии из шести стержней (рис. 8). Каждый цилиндр содержит четыре тримера АРС, в то время как стержни образованы 2-6 гексамерами. Проксимальные гексамеры всегда содержат «длинноволновую» форму PC. Дистальные гексамеры у разных организмов состоят из «коротковолновой» формы PC, из РЕС или из РЕ. Такое распределение пигментов внутри основного светособирающего комплекса способствует безызлучатсльной миграции энергии к реакционным центрам (Grossman et al., 1993) по пути:
Состав стержней может варьировать и при фотоакклиматизации. В случае цианобактерий этот феномен основан на использовании трех стратегий: - общей для всех фототрофов «геометрической» стратегии, которая связана с биогенезом антенны, площадь сечения которой находится в обратной зависимости от плотности потока квантов (стержни укорачиваются на более ярком свету); - свойственной многим оксигенньш фототрофам «кинетической» стратегии, которая связана с переходом состояний 1 -»2; - уникальной «пигментной» стратегии — хроматической адаптации (complementary chromatic adaptation, CCA). Последняя представляет собой модуляцию пигментного состава периферического участка PBS, которая регулируется на транскрипционном уровне и обеспечивает эффективное поглощение квантов доминирующей «цветовой» группы. Так, при избытке в спектре красной компоненты преимущественно синтезируется PC, а при избытке зеленой компоненты - РЕ (Grossman et al., 1993). Помимо а- и /2-субъединиц в состав PBS входят бесцветные «линкерные» полипептиды (от англ. link - связь), имеющие Мг -10-40 kDa. Линкеры сокращенно обозначаются заглавной буквой «L» с подстрочным буквенным индексом, обозначающим их локализацию в PBS. Иногда помимо этого в обозначение линкера дополнительно вводится надстрочный индекс, обозначающий округленную величину молекулярной массы (kDa). В частности, линкеры LR обеспечивают сборку гексамеров и их объединение в стержни (от англ. rod - стержень), линкеры Lc - сборку тримеров кора (от англ. «core»), а линкеры LRC - прикрепление стержней к кору (от англ. «rod-core»). Наряду с бесцветными линкерами существуют еще по крайней мере два типа «хромофшгарованных», или окрашенных, линкеров. Из них более известен минорный высокомолекулярный линкер АрсЕ (Mr=120 kDa). Он обеспечивает агрегацию тримеров кора в цилиндры и ассоциацию кора с дим ером PSII. Поэтому его чаще всего обозначают как LCM (ОТ «core-membrane») , или «анкерный» белок (от англ. anchor -якорь). Этот линкер имеет сложную доменную структуру и, соответственно - сложную пространственную конфигурацию. Он состоит из «петлевого» домена, погруженного в ядро PSII, «фикобшшпротеинового» домена, встроенного в тример кора, трех «линкерных» доменов, соединяющих соседние тримеры кора друг с другом, а также трех «плечевых» доменов, один из которых связывает тримеры цилиндра, а два других - соединяют между собою цилиндры (рис. 8). Линкер LCM служит тем терминальным каналом, по которому -75% энергии, поглощенной основным светособирающим комплексом, поступает к PSII (Bald et al, 1996). Вторым примером окрашенного линкера является так называемая -субъединица, которая тесно ассоциирована со стержнями РЕ у некоторых Rhodophyceae. В частности, Aglaothamnion neglectum имеет две различные у-субъединицы (М,=31 и 33 kDa), которые связывают 2(аД)з-гексамеры друг с другом и таким образом выполняют такую же функцию, как и бесцветные линкеры у цианобактерий (Apt et al., 2001). PBS пространственно ассоциирована с PSII и находится с ней в состоянии энергетического сопряжения. Тем не менее светособирающий комплекс этого типа может участвовать в регуляторном процессе, который основан на феномене «мобильной антенны» и аналогичен переходу энергетических состояний 1 - 2 в хлоропластах (Bald et al., 1996). До сих пор не ясно, играет ли PBS роль латерально мигрирующей антенны, или же ее сопряжение с PSI увеличивается в результате действия протеин-киназиой системы, которая «разрыхляет» связь кора с димерами PSII (Allen, 1992; Grossman et al., 1993; Bald et al., 1996; MacColl, 1998). На одной из ранних стадий формирования гетероцист цианобактерии - в так называемых прогетероцистах - РВР подвергаются индуцированному протеолизу. Поэтому в терминально дифференцированных гетероцистах морфологически выраженные PBS, как правило, не обнаруживаются. Тем не менее у некоторых штаммов при образовании зрелых гетероцист PBS не разрушаются, а остаются интактными и перманентно реассоциируются с PS1 (Ке et al., 1983). Помимо гемидискоидов и гемиэллипсоидов существует по крайней мере еще один морфологический тип PBS. Это цилиндрические PBS, которые имеются только у архаической цианобактерии G. violaceus. Они плотно упакованы на внутренней поверхности СМ и образованы пучком стержней, каждый из которых в свою очередь состоит из 8-10 гексамеров (Guglielmi et al., 1981).
Аналогичные, хотя и значительно меньшего размера, «MHHH»-PBS были обнаружены у A. marina. Они содержат PC наряду с небольшим количеством АРС, имеют форму тороида размером 1,3x26 нм и прикреплены к цитоплазматической поверхности тилакоида (Ни et al., 1999). Тороидальные мини-PBS построены из четырех гексамеров. Входящие в их состав апопротеины имеют Мг=15,5; 22; 24; 26; 40; 50 и 58 kDa (Marquardt et al., 1997). Хотя на поверхности тилакоидов не были обнаружены более крупные агрегаты РВР, полученные данные свидетельствуют о том, что мини-PBS выполняют роль светособирающей антенны и ассоциированы с PSII (Ни et al., 1999).
Систематика оксигенных фототрофных бактерий: от отдела водорослей Cyanophyta до бактериальной филы Cyanobacteria
Оксигенные фототрофные бактерии до недавнего времени отождествлялись с цианобактериями, обладающими билин-содержащими ССК и имеющими сине-зеленую окраску. Коллекции цианобактерий в основном составлены из организмов, легко выделяемых из природы и способных к росту в лабораторных условиях. В музее культур института Пастера (РСС) содержатся более 1 тыс. штаммов, часть из которых была в свое время использована в таксономическом анализе Rippka с соавторами (1979). Много штаммов, относящихся к родам Synechococcus и Anabaena, депонировано в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Из других крупных микробиологических коллекций, имеющих в своем составе штаммы цианобактерий, следует упомянуть коллекции Геттингенского (SAG) и Кембриджского (ССАР) университетов, а также американскую коллекцию университета штата Техас (UTEX) и коллекцию Норвежского института Водных Исследований (NIVA). В России наиболее известны коллекции МГУ (DMMSU), С.-Петербургского университета (CALU), института Физиологии Растений РАН (IPPAS) и института Микробиологии РАН (IMAS) (Громов и др., 1993). Коллекция отдела Микробиологии С.-Петербургского университета содержит более 150 штаммов цианобактерий с традиционной сине-зеленой пигментацией (Громов, Титова, 1991).
С открытием Prochloron sp. (Lewin, 1977), не имеющего фикобилипротеинов, возрос интерес к изучению биоразнообразия прокариотных оксифотобионтов - бактерий, осуществляющих оксигенный фотосинтез. Исследования, проводимые методами молекулярной биохимии с начала 70-х годов, позволили обнаружить объекты, имеющие тривиальную морфологию, но необычный пигментный состав светособирающих антенн. Изменилась и стратегия поисков новых объектов: особое внимание уделяется криптическим и некультивируемьга формам (см: Пиневич, 1999). Полученные в течение последних 20 лет данные касаются в основном объектов из морских (суб)тропических экосистем (Chisholm et al., 1988; Miyashita et al., 1996). Аналогичные данные об обитателях пресноводных водоемов умеренной зоны немногочисленны.
Собранная нами коллекция оксигенных фототрофных бактерий с «нестандартными» ССК включает изоляты, полученные из водоемов Северо-Западного региона Российской Федерации. Ее основу составляют богатые ФЭ цианобактерии. Такие организмы не являются доминирующими в смешанных популяциях цианобактерии, и были выделены с помощью специальной методики обогащения водных проб. В коллекцию входят одноклеточные и нитчатые формы, относящиеся к порядкам Chroococcales (6 штаммов), Oscillatoriales (19 штаммов) и Nostocales (3 штамма). В настоящее время детально изучены морфология и ультраструктура этих объектов, а также их пигментный состав (табл. 3). Абсолютное содержание ФЭ варьирует в пределах 55-300 мкгмг св., а содержание ФЦ — в пределах 20-80 мкг-мг" св. Отношение ФЭ:ФЦ в клетках составляет 2—7, что свидетельствует о ярко выраженном «состоянии обогащения ФЭ» (рис.12). Все изоляты содержат С-ФЭ, имеющий максимум поглощения при 560-570 нм.
По типу хроматической адаптации ФЭ-содержащие штаммы цианобактерии можно разделить натри группы —в соответствии с классификацией, предложенной Tandeau de Marsac (1977). Для Synechococcus sp. CALU 1054 характерна «перманентная» хроматическая адаптация (тип I), связанная с постоянным высоким уровнем накопления ФЭ в клетках, независимо от условий освещения. «Комплементарная» хроматическая адаптация (тип II) выражается в увеличении количества ФЭ в клетках при культивировании под зеленым, и его снижении - под красным светофильтром (рис. 13). Способность осуществлять комплементарную хроматическую адаптацию обнаруживают Synechocystis sp. CALU 1077, 8 штаммов пор. Oscillatoriales и 1 штамм пор. Nostocales (табл.1). «Реципрокно-комплементарная» хроматическая адаптация (тип III) также определяется способностью к адаптивному изменению количества ФЭ и ФЦ в зависимости от качественного состава освещения, однако в этом случае при культивировании под зеленым светофильтром происходит накопление ФЭ и уменьшение количества ФЦ, а при культивировании под красным светофильтром -накопление ФЦ и уменьшение количества ФЭ (см. рис. 14). У 4 штаммов пор. Chroococcales, 7 штаммов пор. Oscillatoriales и 2 штаммов пор. Nostocales наблюдается реципрокно-комплементарная хроматическая адаптация. Таким образом, способность к хроматической адаптации не коррелирует с систематическим положением богатых ФЭ цианобактерии.
В коллекцию входит штамм Pleurocapsa sp. CALU 1126 (пор. Pleurocapsales), обладающий коричневой окраской, однако количество ФЦ в клетках превышает количество ФЭ (рис. 15), и необычная пигментация у этого штамма связана с высоким содержанием каротиноидов (см. гл. Ш.2.1), При смене условий освещения (рост под зеленым и под красным светофильтрами) он способен изменять относительное содержание ФБП, осуществляя реципрокно-комплементарную хроматическую адаптацию.
В состав коллекции входят 2 штамма, относящиеся к пор. Prochlorales и имеющие хлб-содержащие ССК - Prochlorothrix hoUandica и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90. Оба штамма изолированы в Северной Европе из проб озерной воды. В отличие от облигатно симбиэтических прохлорофитов {Prochloron didemni и Acaryochloris marina) данные формы способны к росту в лабораторных условиях, что позволяет использовать их в качестве модельных объектов для изучения фотосинтетического аппарата оксигенного типа.
Результаты исследования некоторых особенностей морфологии и пигментного состава штаммов коллекции с их подробным анализом изложены в следующих разделах данной главы.
Цианобактерии («сине-зеленые водоросли») первоначально получили свое название из-за характерной окраски их клеточных скоплений. На самом же деле для этой группы бактерий возможны различные варианты пигментации, определяющиеся всем набором светособирающих пигментов (хлорофилла, каротиноидов и ФБП) с различным положением и относительной величиной максимумов поглощения.
Пигментные типы цианобактерии незакономерно представлены в различных систематических группах. Штаммы с сине-зеленой и синей окраской, как правило, характеризуются высоким относительным содержанием ФЦ, Зеленый цвет связан с низким содержанием каротиноидов и ФБП. «Пурпурные)» штаммы обычно имеют высокий уровень содержания ФЭ, а коричневая и бурая окраска определятся каротиноидами (тип «коричневый I») или ФЭ, содержащим ФУБ-хромофоры (тип «коричневый II»). Одновременное накопление ФЭ и каротиноидов приводит к малиновой окраске клеток. На рис. 16 схематически обозначены 7 основных пигментных типов цианобактерии, хотя возможны промежуточные варианты. Поскольку окраска зависит от стехиометрического соотношения пигментов, она отражает специфическую архитектуру ССК.
Выделение и культивирование штаммов оксигенных фототрофных бактерий с атипичным пигментным составом
Накопление ФЭ, возможно, связано и с тем, что этот пигмент участвует в депонировании азота (Wyman et al„ 1985). При азотном голодании происходит разрушение ФБС, начиная с периферических участков стержней (Grossman et al., 1993), которые содержат ФЭ. Использование ФЭ в качестве источника азота важно для морских цианобактерий, так как они часто попадают в условия лимитирования по азоту. Накопление ФЭ цианобактериями может вносить значительный вклад в общую продуктивность морского фитопланктона, поскольку ФЭ является потенциальным источником материала для синтеза аминокислот (Wyman et al., 1985).
Наконец, ФЭ может выступать в роли фотопротектора, накапливаясь в условиях интенсивного освещения и рассеивая избыток энергии путем автофлуоресценции (Wyman et al., 1985). Установлено, что ФЭ в меньшей степени, чем ФЦ и ЛФЦ, подвержен фотодеструкции. В частности, солнечная УФ-радиация («дальний» УФ, в диапазоне 280-315 нм) индуцирует синтез ФЭ у Nostoc sp. и одновременно с этим приводит к снижению уровня ФЦ и АФЦ (Araoz, Hader, 1999).
Согласно полученным данным, в клетках Synechococcus sp. CALU 1054 содержится минорный хлб-подобный пигмент. Присутствие различных хлорофиллов, ранее известное у прохлорофитов и A, marina, соответствует концепции эволюции фотосинтетических антенн, по которой прародительская форма оксифотобактерий обладала генетическими детерминантами для нескольких типов ССК (Chisholm et al., 1992; Larkum et al., 1994; Miyashita et al., 1996). Дивергентная эволюция привела к возникновению организмов с различными комбинациями ССК. Таким образом, основу биоразнообразия оксифотобактерий составляет поливариантность ССК в сочетании с разнообразной морфологией (Bhattacharya, Medlin, 1995). Изучение ССК методами прямой цитоспектрофлуориметрии и HPLC показывает, что в океаническом пикопланктоне существуют организмы, у которых одновременно имеются ФЭ и хлЬ (Hess et al., 1996). Полученные нами данные показывают, что "цианопрохлорофиты" могут иметь более широкое распространение и обнаруживаться, наряду с морскими и океаническими акваториями, в пресных водоемах.
Штаммы «пурпурных» цианобактерии, отнесенные к порядку Oscillatoriales, имеют неспирализованные неветвящиеся трихомы, которые состоят из вегетативых клеток цилиндрической или бочковидной формы. По морфологическим признакам их можно разделить на две группы (табл. 3). Штаммы группы (а) имеют глубокие перетяжки, т. е. диаметр трихома уменьшается в области межклеточного контакта наполовину и более, что является диагностическим признаком рода Pseudanabaena (Anagnostidis, Komarek, 1988). Штаммы группы (б), не имеющие перетяжек, сответствуют диагнозу рода Phormidium.
Несмотря на гетерогенность морофологии, штаммы осциллаториевых «пурпурных» цианобактерии имеют сходную ультраструктуру ламеллярной системы (см.: Pinevich et al„ 2000). На продольных срезах параллельные тилакоиды локализуются на периферии, повторяя контур клеточной оболочки. В поперечной проекции они образуют периферические концентрические круги (рис. 31). Объемная реконструкция дает картину агрегата, состоящего из продольно ориентированных, вложенных друг в друга тубулярных структур (рис. 32а).
Комплексный подход к систематике цианобактерии, среди прочего, учитывает морфологию ламеллярной системы. В частности, по этому признаку было предложено дифференцировать сем. Pseudanabaenaceae от сем. Phormidiaceae (Komarek, Caslavska, 1991). Диагностическим признаком Pseudanabaenaceae является параллельно-периферическое расположение фотосинтетических ламелл как на продольном, так и на поперечном срезе. Признаком Phormidiaceae служит параллельно-периферическое расположение тилакоидов только на продольном срезе, а в поперечной проекции они ориентированы радиально (рис. 32Ь). Характерное отличие объемных моделей ламеллярных систем представлено на рис, 32.
До сих пор вышеуказанный ультраструктурный критерий был использован применительно к немногим штаммам, и лишь в отдельных случаях одновременно учитывалась форма ламеллярной системы в продольной и в поперечной проекциях. Кроме того, ультраструктура рассматривалась независимо от общей морфологии. В соответствии с ультраструктурным критерием (Komarek, Caslavska, 1991) все изученные нами осциллаториевые штаммы следовало бы отнести к роду Pseudanabaena. Однако по морфологии трихома штаммы группы (а) диагностируются как Pseudanabaena, а штаммы группы (б) - как Phormidium. На наш взгляд, целесообразно отказаться от использования ультраструктурного критерия и проводить идентификацию штаммов кластера Pseudanabaena — Phormidium на основе общей морфологии.
Четыре штамма пор. Oscillatoriales (CALU 1037, CALU 1123, CALU 1124, CALU 1125), относящиеся к группе (а), имеют трихомы, число клеток в которых не превышает 20 (рис. 33). При культивировании на агаре эти штаммы растут диффузно. В условиях светового градиента трихомы проявляют положительный фототаксис. Жидкие культуры представляют собой гомогенные невязкие суспензии, В оптимальных условиях при освещении лампами дневного света (1,5-2 тыс. лк) и 20 С клетки имеют пурпурную или темно-бордовую пигментацию. При старении культуры приобретают желто-зеленую окраску и частично лизируются.
Спектры поглощения водорастворимых пигментов (рис. 34—37) указывают на наличие ФЭ (560 нм), ФЦ (610-615 нм) и АФЦ (645 нм). Содержание ФЭ составляет 11-21% с. в., что близко к таковому у богатых ФЭ штаммов Oscillatoria sp. (Phlips, Zehman, 1990) и Nostoc sp. (Пиневич и др., 1994), однако превышает значения, зарегистрированные для штаммов Anabaena sp. и Psedanabaena sp., имеющих коричневую окраску (Rudiger et al., 1980; Rodriguez et al., 1989). Соотношение ФЭ:ФЦ составляет от 3:1 до 5:1 и является промежуточным между относительно низкими значениями (2-3:1) у нитчатых цианобактерий, богатых ФЭ (Wyman et al.,1985; Rodriguez et al., 1989; Пиневич и др., 1994), и высокими значениями (10-20:1) у одноклеточных штаммов (Wyman et al., 1985).
У изучаемых штаммов наблюдаются изменения в соотношении ФБП в зависимости от спектрального состава освещения, причем характер этих изменений неодинаков. Штаммы CALU 1037 (рис. 38), CALU 1124 (рис. 40) и CALU 1125 (рис. 41) проявляют реципрокно-комплементарную хроматическую адаптацию (тип III). Штамм CALU 1123 (рис. 39) характеризуется способностью к комплементарной хроматической адаптации (тип II).
Один из штаммов (CALU 1037) был подвергнут детальному изучению. Морфология трихома и ультраструктура этой цианобактерий соответствуют диагнозу рода Pseudanabaena (Anagnostidis, Komarek, 1988). Форма клеток варьирьирует от сферической до цилиндрической или бочковидной (диаметр 2-2,4мкм, длина 2-4,5мкм). Между соседними клетками наблюдаются глубокие перетяжки. Чехол отсутствует. Тилакоиды занимают периферически-параллельное расположение, на полюсах клеток наблюдаются газовые вакуоли (рис. 42).
Коллекция оксигенных фототрофных бактерий с «нестандартными» ССК
У оксигенных фототрофных бактерий реакционные центры ФС1 и ФС2 имеют консервативную структуру, но тип и молекулярная структура основного светособирающего комплекса могут варьировать. Собственно иианобактерии (цианобактерии sensu stricto) имеют экстрамембранные ФБС (гидрофильные частицы с М,«10 МДа, состоящие из ФБП-субъединиц). В отличие от них прохлорофиты имеют интрамембранные (дивинил-)хла/М)елковые комплексы; это название подразумевает наличие у прокариотов того же набора пигментов, что и у зеленых водорослей (Пиневич и др., 2000). Кроме того, обнаружен организм, имеющий в качестве главной антенны хло/ -белковыЙ комплекс (Miyashita et al., 1996), а также показана возможность сосуществования ФБП с хл-содержащими ССК (Hess et al., 1996; Marquardt et al., 1997).
Прохлорофиты отличаются от цианобактерии и сходны с хлоропластами тем, что они обладают интрамембранными ССК, состоящими из гидрофобных полипептидов с Мг«32-38 кДа, с которыми нековалентно связаны молекулы каротиноидов и хлорофиллов а и Ъ, Эти прокариоты рассматриваются как «другие» цианобактерии -они являются оксигенными фототрофами и, в соответствии с результатами секвенирования 16S рРНК расположены на одной ветви глобального филогенетического древа с классическими циаиобактериями (Post, Bullerjahn, 1994). Строение и функционирование фотосинтетического аппарата этих микроорганизмов интенсивно изучалось в связи с проблемой эволюции хло/б-содержащего ССК (La Roche et al., 1996). Настоящий раздел посвящен анализу ультраструктуры нитчатого представителя прохлорофитов, Prochlorothrix hoUandica, и ее сравнению с ультраструктурой собственно цианобактерии.
Как выяснилось, при общем сходстве ультраструктуры цианобактерии и прохлорофитов (Matthijs et al., 1994; Post, Bullerjahn, 1994), последние имеют ряд особенностей. Исследование проводили как на целых клетках, так и на сферо пластах, впервые полученных для прохлорофитов. Подобно цианобактериям, прохлорофиты обладают многослойной клеточной стенкой. Действие лизоцима (особенно в сочетании с хелатирующими агентами) приводит к разрушению пептидогликанового слоя, маскирующего морфологическое взаимодействие между двумя мембранами клеточной оболочки и между цитоплазматической мембраной и тилакоидами. Как ранее показано, контакты плазмалеммы с тилакоидами у ЛпаЬаепа sp. РСС 7118 лучше наблюдаются не в интактных клетках, а в сферопластах (Пиневич,1977).
Исследования, проведенные с использованием метода криофрактографии (Matthijs et al., 1994), позволили охарактеризовать гетерогенность клеточных мембран у прохлорофитов. Однако характер взаимодействия между цитоплазматической и наружной мембранами, а также между цитоплазматической мембраной и тилакоидами оставался невыясненным.
Зоны адгезии цитоплазматической и наружной мембраны, несомненно, играют важную роль в реализации пограничных функций у грам отрицательных бактерий. В частности, они могут участвовать в переносе вновь синтезированных элементов наружной мембраны (липополисахаридов и полипептидов) к месту их окончательной дислокации (Hoiczyk, Hansel, 2000). Импорт нуклеиновой кислоты бактериофагов и образование половых пилей также ассоциированы с зонами контакта наружной и цитоплазматической мембран (Lugtenberg, van Alphen, 1983). Однако, за исключением результатов, полученных на Е. coli, которая традиционно используется в исследованиях клеточной оболочки, сведения об этих зонах, называемых «мостиками Байера», довольно скудны (Bayer, 1991). До сих пор неизвестно, являются ли они стабильными структурами или возникают временно. Хотя у некоторых цианобактерий ранее наблюдались изгибы наружной мембраны, они отличались от мостиков Байера, поскольку не имели непосредственного контакта с цитоплазматической мембраной (Gantt, 1994). Аначиз материалов ультраструктурных исследований прохлорофитов (Miller et al., 1988; Bullerjahn et al., 1990) позволяет говороить об адгезии наружной и цитоплазматической мембран, однако авторы оставляют это без внимания.
На микрофотографиях P. hollandica (рис. 44) видны мостики Байера с ясно различимыми участками наружной и цитоплазматической мембран, В местах контакта мембран наблюдаются ранее не описанные электрон-плотные структуры. Они обнаруживаются как в интактных трихомах, так и в сферопластах (которые лишены наружной мембраны, хотя сохраняют фрагменты пептидогликанового слоя). Вероятно, это сохранившиеся при сферопластировании белковые агрегаты, которые участвуют в процессах, ассоциированных с мостиками Байера.
Ассоциация цитоплазматической мембраны и интрацитоплазматических мембран редко наблюдается у цианобактерий (Stevens, Nierzwicki-Bauer, 1991; Gantt, 1994) и не была ранее отмечена у прохлорофитов (Whatley 1977; Golecki, Jurgens, 1989). Как видно из рис. 45а, окончания тилакоидов соединены с цитоплазматической мембраной, однако неясно, означает ли это просто контакт или слияние мембран с образованием гибридной структуры.
Как видно из рис. 45 (а, Ь), тилакоиды сходятся в отдельных участках, расположенных под цитоплазматической мембраной, которые напоминают так называемые «тилакоидиые центры» одноклеточных и нитчатых цианобактерий (Kunkel 1982; Nierzwicki-Bauer et al., 1983). Предполагается, что через эти структуры переносятся предшественники хлорофилла из места синтеза - цитоплазматической мембраны — в участки формирования фотосинтетических систем (Hinterstoisser et al., 1993). Возможно, другая функция тилакоидных центров заключается в том, что они прикрепляют тилакоиды к цитоплазматической мембране и тем самым определяют их расположение в цитоплазме. Тилакоидиые центры цианобактерий представляют собой включения диаметром 30 и длиной 300 нм, которые расположены под цитоплазматической мембраной и состоят из радиально уложенных субъединиц (Kunkel, 1982). В случае PMollandica аналоги тилакоидных центров выглядят как неструктурированные глобулы (см. рис. 45Ь).
При наблюдении P. hollandica в световом микроскопе некоторые исследователи обнаруживали на периферии клеток темные гранулы, неизвестной природы (Burger-Wiersma et al.,1989). Аналогичные электрон-плотные включения диаметром около 100 нм, окрашиваются йодом (рис. 46Ь), то есть в их составе имеется крахмал-подобный полимер. Полисахаридные включения у цианобактерий (так называемые сс-гранулы) меньше по размерам и не окрашиваются йодом в использованном нами цитохимическом тесте (Shively et al., 1988; Bertocci et al., 1990). Полученные результаты согласуются с данными о наличии у P. didemni гранул запасного полиглюкозида, состоящего из двух фракций — линейной, подобной амилозе, и разветвленной, подобной амилопектину (Fredrick, 1980).
Как известно, в хлоропластах, имеющих хлорофилл a/b-ССК, запасным полисахаридом является крахмал. Результаты секвенирования 16S рРНК опровергают возможность эволюционного перехода от прохлорофитов к хлоропластам. Учитывая также гетерологическую природу апопротеинов соответствующих хла/Ь-ССК, можно предположить, что эти линии оксигенных фототрофой приобрели хл Ъ и крахмал конвергентным путем (Doolittle, 1994).
