Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
2.1. Современные представления о возбудителе сибирской язвы 8
2.2. Эпизоотологическая ситуация по сибирской язве в РФ 21
2.3. Методы эпизоотологического мониторинга и картографического анализа 29
2.4. Современные методы идентификации возбудителей инфекционных болезней 33
Собственные исследования 45
3.1. Материалы и методы 45
3.2. Результаты собственных исследований 55
3.2.1. Эпизоотологический мониторинг сибирской язвы в Республике Татарстан 55
3.2.1.1. Изучение распространения сибирской язвы и районирование зон риска на территории республики 55
3.2.1.2. Климато-географическая характеристика и влияние типа почв на распространение сибирской язвы в РТ 63
3.2.1.3. Структура заболеваемости сельскохозяйственных животных и изучение интенсивности эпизоотической ситуации по сибирской язве в РТ 66
3.2.1.4. Влияние климата региона на частоту проявления антракса 68
3.2.2. Наличие сибиреязвенных захоронений на территории РТ
и их ветеринарно-санитарное состояние 72
3.2.2.1. Индикация В. anthracis в старых сибиреязвенных захоронениях 74
3.2.2.2. Изучение фенотипических признаков различных изолятов возбудителя сибирской язвы 77
3.2.2.3. Генотипирование изолятов Bacillus anthracis методом секвенирования 82
3.2.3. Электронное картографирование и анализ стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов 89
Обсуждение результатов исследований 98
Выводы 112
Практические предложения 114
Список использованной литературы 115
Приложения 146
- Современные представления о возбудителе сибирской язвы
- Методы эпизоотологического мониторинга и картографического анализа
- Эпизоотологический мониторинг сибирской язвы в Республике Татарстан
- Структура заболеваемости сельскохозяйственных животных и изучение интенсивности эпизоотической ситуации по сибирской язве в РТ
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Сибирская язва (антракс) - высококонтагиозное особо опасное заболевание человека и животных. Однажды, возникнув на определенной территории, она сохраняет опасность повторных вспышек инфекции на многие десятилетия, ввиду высокой патогенности и способности возбудителя длительное время сохраняться в почве и даже размножаться в ней. Ежегодно практически во всех странах мира среди животных и людей регистрируются заболевания антраксом. Значимость инфекции подтверждается многочисленными сообщениями ученых на международных конференциях по сибирской язве [12,18,19,28,29,149,232,323].
На территории Российской Федерации случаи возникновения сибирской язвы регистрируются периодически, что дает основание считать её по-прежнему опасной инфекцией [31,135,166,167,174,205,208,232].
Современная статистика регистрирует новые вспышки болезни в ранее благополучной и «ожившие» старые очаги в стационарно неблагополучной местности по причине земляных работ, природных катаклизм и т.п. Зарегистрированные ранее очаги, которые не проявляют в данный момент активности, текущей статистикой не учитываются. Сведения о них можно получить из сибиреязвенных кадастров, отчетов, эпизоотических журналов и эпизоотических карт, публикаций. Однако эти места гибели животных или захоронения сибиреязвенных трупов остаются потенциально опасными [18,39,73,168,196].
На сегодняшний день по Республике Татарстан не систематизированы сведения о наличии и месторасположении сибиреязвенных захоронений, скотомогильников с учетом их климато-географических характеристик, метеорологических и экологических факторов, картографического положения, а также ^^/прогнозировании инфекции.
Исходя из этого, разработка новых подходов к эпизоотологическому мониторингу, индикации и дифференциальной диагностики сибирской язвы остаются актуальными для ветеринарной науки и практики.
1.2. Цель и задачи исследований.
Целью работы явилось проведение эпизоотологического мониторинга стационарно неблагополучных сибиреязвенных пунктов в Республике Татарстан, выделение изолятов, определение фено- и генотипических свойств возбудителя сибирской язвы для установления территориальной приуроченности.
Для выполнения основной цели исследований поставлены следующие задачи:
Изучить эпизоотическую ситуацию по сибирской язве в Республике Татарстан за период с 1914 г. по 2004 гг.
Определить характер влияния природно-климатических факторов
і» на эпизоотический процесс и зависимость вспышек болезни от состояния
сибиреязвенных захоронений.
Провести генотипирование и определить территориальную принадлежность и происхождение вновь выделенных на территории РТ изолятов возбудителя сибирской язвы.
Разработать электронную карту по стационарно неблагополучным сибиреязвенным пунктам в РТ.
1.3. Научная новизна работы заключается в том, что впервые проведен
эпизоотологический мониторинг антракса за 1914-2004 гг. в РТ. Изучено гео
графическое распространение сибирской язвы, выявлены пространственные
связи эпизоотического процесса с предполагаемыми причинными факторами
среды, проведено районирование территории Республики Татарстан на зоны с 4
степенями эпизоотической опасности. Депонированы и паспортизированы 3
штамма возбудителя сибирской язвы; установлено территориальное происхож
дение выделенных изолятов путем секвенирования отдельных локусов, ампли-
фицированных в ПЦР, с последующим их сравнительным анализом, а также
разработана электронная карта эпизоотологического районирования СНП по
сибирской язве в Республике Татарстан.
1.4. Практическая ценность. Результаты проведенных исследований
вошли в «Методические рекомендации по снижению риска распространения и возникновения сибирской язвы», Утв. директором ФГУ «ФЦТРБ», 06.02.06г.
1.5. Апробация работы. Результаты выполненных исследований доло
жены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ФГУ «Федеральный центр
токсикологической и радиационной безопасности животных» ФЦТРБ-ВНИВИ
(Казань, 2003-2006 гг.). А также основные положения диссертации доложены
на Всероссийской конференции молодых ученых «Молодые ученые - агропро
мышленному комплексу» (Казань, 2004); Всероссийской научно-практической
конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса (Ка
зань, 2004); на Всероссийской научно-практической конференции, посвящен
ной 45-летию института «Проблемы экотоксикологического, радиационного и
эпизоотологического мониторинга» (Казань, 2005).
1.6. Публикация результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 8 работ, в числе которых 4 статьи и 4 тезиса.
1.7. На защиту выносятся следующие положения:
Климато-географические показатели влияют на эпизоотологическую ситуацию по сибирской язве;
Фено- и генотипический анализ выделенных изолятов возбудителя сибирской язвы в РТ определяет их территориальную приуроченность;
Электронная карта СНП по сибирской язве и гео-информационная система позволяет проводить компьютерный эпизоотологический мониторинг и дает возможность прогнозирования ситуации.
1.8. Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 151 странице и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы (332 источника, в том числе 115 иностранных, 8 ссылок на сайты internet) и приложения. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками.
Современные представления о возбудителе сибирской язвы
Сибирская язва - сапрозоонозная особо опасная бактериальная инфекционная болезнь с конкретным механизмом передачи возбудителя. К сибирской язве восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных, пушные звери, грызуны и человек. Резервуаром возбудителя инфекции служит почва. Источником возбудителя является зараженный организм, где патоген способен сохраняться, размножаться, накапливаться и выделяться во внешнюю среду [29, 32,91,100,157,159,160,209].
Вызываемое возбудителем сибирской язвы заболевание протекает тяжело и скоротечно, нередко заканчивается летально. По многочисленным данным, летальность при висцеральной (генерализованной) форме заболевания составляет 85 - 100% [118,212,275,288,289].
Возбудитель сибирской язвы - Bacillus anthracis впервые был обнаружен под микроскопом Поллендером Ф. в 1849 году. Давэн К. и Райе (Франция) в 1850 году выявили нитевидные неподвижные палочки в крови овец, погибших от сибирской язвы. В России Брауэль Ф. в 1857 году нашел палочки в крови умершего человека, и ему удалось экспериментально воспроизвести болезнь у животных, заразив их кровью, содержащей палочки сибирской язвы. В 1876 году культуру возбудителя антракса, независимо друг от друга, удалось получить Коху Р. и Пастеру Л.
Классификация и таксономия. По современным представлениям возбудитель сибирской язвы принадлежит по Берджи [221] к классу II Schizomycetes; роду IY Eubacteriales; семейству YIII Bacillaceae; роду I Bacillus; типовому виду Bacillus anthracis.
Род Bacillus включает 48 видов аэробных или факультативно-анаэробных бацилл. Обнаружена большая группа микробов - сапрофитов, близкородственных В. anthracis по культурально-морфологическим, биохимическим и другим свойствам, эту группу принято называть антракоиды или группа псевдоантракса, хотя такое понятие в современной классификации отсутствует [159].
Наиболее близки к бацилле сибирской язвы следующие виды: B.cereus sive - восковидная бацилла (синоним В. antracoidas sive, В. pseudoanthracis); В. cereus var. micoides sive - корневидная бацилла (синонимы В. mycoidas), В. met-goterium - капустная бацилла; В. subtilis sive - сенная бацилла; В. pumilus sive -картофельная бацилла (синоним В. mesentericus Chester). Все они - сапрофиты, за исключением B.cereus, которая синтезирует активный фермент патогенности лецитиназу, вследствие чего способна вызывать токсикозы.
Вопрос о происхождении и эволюционных связях Bacillus anthracis, с другими почвенными бактериями, до настоящего времени остается открытым. Некоторые авторы указывают на типичность сибиреязвенных бацилл, другие -на имеющиеся у них различия [29,47,184].
Больше всего возникает трудностей при дифференциации В. anthracis от В. cereus. При электронно-микроскопическом исследовании у обеих бацилл найдены как общие, так и нетипичные признаки [201]. На основании общих черт, одни авторы считают В. cereus прародителем В. anthracis [98, 223], другие [234, 258], наоборот, утверждают, что В. cereus трансформировалась от В. anthracis вследствие утраты последней патогенных свойств.
Коротич А. С. и Погребняк Л. И. [97], ссылаясь на работу Smith Н., пишут, что еще в 1953 году был поставлен вопрос: сибиреязвенный штамм, потерявший свою вирулентность, еще В. anthracis или уже В. cereus!
Сам Smith Н. [304], изучая аэробные спорообразующие бактерии, пришел к выводу, что В. anthracis является патогенным вариантом В. cereus, а потерявшие свою вирулентность штаммы В. anthracis нельзя дифференцировать от В. cereus.
Seidel G. [302]; Brown E. и Cherry W. [223] также рассматривают штаммы как варианты друг друга или одного общего предшественника. Leise J.M. и др. [237] считают, что В. anthracis и В. cereus возможно идентифицировать на основе биохимически-морфологических тестов и тестов на патогенность. Ими также представлены данные, свидетельствующие, что патогенные штаммы В. anthracis, потерявшие свою вирулентность остаются В. anthracis и могут быть дифференцированы от В. cereus и других патогенных бацилл.
Bohm R. [222] проверил 10 штаммов В. anthracis и 19 штаммов родственных аэробных спорообразующих бацилл посредством ДНК-ДНК гибридизации. В результате сделал заключение, что В. anthracis является отчетливым и гомогенным видом с гомологиями между штаммами 90-99%. Гомологии представителей других видов к В. anthracis были равны или составляли меньше 59%.
Гинсбург Н.Н. [47] полагает, что никаких разновидностей В. anthracis в природе не существует.
Абдуллин Х.Х. [1], Краминский В.А., Соркин Ю.А. [98] считают, что вначале возбудитель сибирской язвы обитал в почве как сапрофит, а затем постепенно приспособился к паразитированию в организме животных.
Бакулов И.А. и Гаврилов В.А. [18], говоря об эволюции возбудителя сибирской язвы, представляют его состоящего как бы из нескольких фаз: от типичных сапрофитов к типичным паразитам и затем снова к сапрофитам на фоне иммунологического пресса и изменившихся условий внешней среды.
Таким образом, по мнению авторов, происходит своего рода сапрофити-зация циркулирующих сибиреязвенных штаммов. Вирулентность их связывают с наличием капсулы, которая детерминируется плазмидой рХ02 (60 Мд). Потеря этой плазмиды, как доказано многочисленными экспериментами, ведет к потере вирулентности [239,250,307,308,219].
Методы эпизоотологического мониторинга и картографического анализа
Среди методических приемов эпизоотологического мониторинга важнейшее место занимает ретроспективный эпизоотологический анализ, который выявляет закономерности и особенности проявлений эпизоотического процесса, определяет его тенденции, оценивает эффективность профилактических и противоэпизоотических мероприятий [195].
Ретроспективный анализ позволяет выявлять территориальную приуроченность эпизоотических очагов, природные и хозяйственные факторы, влияющие на ход эпизоотического процесса и определять животных группы-риска, причины осложнения обстановки. Результаты этой работы позволяют прогнозировать изменения ситуации и соответственно планировать оптимальные противоэпизоотические мероприятия [59, 155].
Ценность эпизоотологического прогноза состоит в конкретности и максимальной определенности. В настоящее время признаются три вида прогнозов: краткосрочные, среднесрочные и долгосрочные [17, 123, 173]. Продолжительность прогноза определяется народнохозяйственными планами и хозяйственно-географическими изменениями в конкретном районе [27,173, 179].
Развитие и практическая ценность прогнозных исследований зависят от совершенства методов сбора, качества информации, полноценного анализа эпизоотического процесса [173], задачей которого является установление конкретных условий, их воздействие на ход, динамику эпизоотии, а также определение наиболее частых путей заноса инфекции [84].
Эпизоотии сибирской язвы свойственна стадийность, которая отражает ее волнообразную динамику и включает ряд стадий: предэпизоотическую, развития эпизоотии, максимального подъема, угасания и постэпизоотическую. Длительность каждой стадии различна, поэтому анализ проявления эпизоотии удобно проводить, используя относительные показатели [9, 20, 25, 57, 109, 111, 165, 177,178], вычисляемые путем соотношения двух сравниваемых чисел [60].
Для изучения динамики эпизоотии используют данные о распространении сибирской язвы, строят графики по отрезкам времени, измеряют длительность волны, отмечают напряженность эпизоотического процесса. Напряженность эпизоотии определяют по показателям распространенности болезни, заболеваемости и летальности животных [150]. Напряженность эпизоотического процесса характеризуется показателями в трех измерениях:
- показатели интенсивности эпизоотии, характеризующие охват поголовья животных инфекционной болезнью в стаде, населенном пункте (заболеваемость, инцидентность, смертность, летальность, очаговость);
- показатели экстенсивности эпизоотического процесса, характеризующие охват инфекционной болезнью стад, неблагополучных пунктов по отношению ко всем стадам и населенным пунктам района, области (неблагополучие, распространенность и энзоотичность);
- показатели продолжительности проявления эпизоотии, характеризующие изменение интенсивности и экстенсивности проявления процесса во времени (периодичность, стационарность и сезонность) [122,173, 176].
Показатель территориальной приуроченности болезни - определяется при нанесении на бланк универсальной таблицы показателей распространенности или числа неблагополучных пунктов, что наглядно иллюстрируется при составлении карт. В большинстве случаев территориальная приуроченность обусловлена феноменом природной очаговости инфекции.
Показатель периодической повторяемости эпизоотии - изображают графически, он выводится из показателей заболеваемости, инцидентности, распространенности или количества неблагополучных пунктов. График наглядно иллюстрирует уменьшение или увеличение заболеваемости в отдельные годы, что позволяет вычислить продолжительность периодов между очередными увеличениями показателей.
Показатель сезонности - показатель изменения проявления эпизоотического процесса в течение календарного года, он определяет усиление инцидентности или заболеваемости в определенные периоды [60,102,162].
Для выявления влияния на динамику сибиреязвенной эпизоотии почвен-но-климатических факторов: температура воздуха и почвы, влажность воздуха, количество осадков и физико-химический состав почвы, показатели группиру 32 ют в виде таблиц и графическим методом проводят выявление регрессионных связей и корреляционный анализ [62,132, 209].
Весьма полезным оказалось для эпизоотологического мониторинга - модельное предвидение. Так как реальная эпизоотическая ситуация характеризуется определенными тенденциями и закономерностями, то представляется возможным моделировать ее математическими методами. Меняя в таких математических моделях эпизоотического процесса одни переменные, можно определить, как будут меняться другие [21, 36].
Эпизоотологический мониторинг сибирской язвы в Республике Татарстан
При анализе эпизоотической ситуации установили, что первый случай заболеваемости сибирской язвой животных в Республике Татарстан, по данным архивных документов ГУВ КМ РТ, был зарегистрирован в 1914 г. в с. Клянчино Верхнеуслонского района. С тех пор сибирская язва приобретала массовый характер, заполоняя собой все 43 района республики. Динамика вспышек инфекции с 1914-2004 гг. представлена на рисунке 2.
Из рисунка видно, что наибольшее количество вспышек сибирской язвы отмечается в довакцинальный период - это 1935-1952 гг., эти годы также совпадают с периодом военных действий в СССР, когда контроль за передвижением, вакцинацией и утилизацией больных животных находился на низком уровне. Самый низкий показатель - 9 вспышек в послевоенные годы наблюдался в 1963 г.; затем в 1964 г. произошло резкое увеличение до 28 вспышек, после чего заметна периодичность подъема их возникновения через каждые четыре го да. О неравномерности распределения эпизоотичности сибирской язвы в районах Республики Татарстан свидетельствует эпизоотическая карта представленная на рисунке 3.
С 1914-2004 гг. на территории РТ произошло 1927 вспышек антракса в 1127 населенных пунктах. По количеству вспышек самой неблагополучной является зона Предкамья - 1004 (52%); в зоне Закамья насчитывается 701 (36%) вспышка и всего 222 (12%).- в Предволжье. Наиболее неблагополучными районами в республике являются: Арский - 224; Балтасинский - 144 и Мензелин-ский - 95 вспышек, что составляет 11,6%, 7,5%, 4,9%) соответственно. Наименьшее число вспышек было в районах: Черемшанском - 6, Мамадышском - 8 и Рыбно-Слободском -10; 0,26%, 0,41%, 0,52% соответственно.
В соответствии с табличными данными показатель неблагополучия районов варьирует от 6,0 до 88, 6%. Наиболее благополучными (1-30%) являются 19 районов, 10 из которых расположено в зоне Закамья. От 30 до 50% неблагополучия населенных пунктов отмечается в 13 районах Республики Татарстан. В 11 районах более 50% населенных пунктов, в прошлом имели очаги сибирской язвы, 6 из них - в зоне Предкамья.
Индекс эпизоотичности свидетельствует о количестве лет неблагополучия, в отношении к 90 годам исследуемого периода, и чем он выше, тем выше ежегодная частота вспышек сибирской язвы в районе. Распределение районов РТ по показателям индекса эпизоотичности представлено на рисунке 4.
Восемнадцать районов были подвергнуты вспышкам сибирской язвы 15 и менее лет (Иэ=0,0-0,15). В 20 районах средний показатель индекса эпизоотичности составлял от 0,16 до 0,29; а в пяти районах: Альметьевском, Арском, Елабужском, Зеленодольском и Чистопольском ежегодные вспышки наблюдались в течение 30 и более лет (Иэ=0,30; 0,33; 0,31; 0,32 и 0,30 соответственно).
Распространенность болезни мы проанализировали в сравнительном аспекте лет: 1950, как самого неблагополучного за период с 1914-1990 гг. и 1992 -самого неблагополучного за последние 14 лет в РТ.
При сравнении этих двух периодов отметили, что в настоящее время распространенность болезни в населенных пунктах РТ заметно упала. В 1950 г. только 12 районов были свободны от антракса против 38 в 1992 г. По распространенности Мензелинский район в 1950 г. занимал 1 место - 53,6%; на втором месте - Атнинский район (13%); третье место разделили Агрызский и Муслюмовский районы с показателем в 12,7%). В 1992 г. особенно выделились Кайбицкий (1,8%), Сабинский (1,5%) и Агрызский (1,4%) районы.
Анализ полученных результатов показал, что в 1950 г. показатель распространенности варьировал от 1,2 до 53,6%; в настоящее время от 0,8 до 1,8%; то есть показатели снизились в 30 раз.
Эпизоотическая ситуация по сибирской язве за последние 14 лет по РТ представлена в таблице 6.
Структура заболеваемости сельскохозяйственных животных и изучение интенсивности эпизоотической ситуации по сибирской язве в РТ
Наряду с экстенсивными показателями, характеризующими эпизоотический процесс, мы определяли и рассчитывали интенсивные показатели, связанные с заболеваемостью животных.
Видовой состав сельскохозяйственных животных, наиболее часто подверженных заболеванию сибирской язвой определяли в сравнении двух периодов 1964-1978 гг. и 1991-2004 гг. (Рисунок 6).
Рассмотрим вначале заболеваемость животных с 1964 по 1978 гг. За этот период лет было зарегистрировано 162 случая заболевания животных сибирской язвой, из них 86 случаев пришлось на крупный рогатый скот (54%). Треть заболеваемости антраксом отмечалась среди овец и составляет 54 животных (33%); свиньи в этой структуре занимают 10% (17 животных). Самые низкие показатели заболеваемости отмечались у лошадей - 5 животных (3%).
За период 1991-2004 гг. было зарегистрировано 27 животных заболевших антраксом, причем 7 из них не были вакцинированы.
Анализ видовой заболеваемости животных показал, что с течением времени видовая структура косвенно изменилась, и заболеваемость животных снизилась в 6,5 раз. С 1991 г. по 2004 г. не было зарегистрировано ни одного случая сибирской язвы среди лошадей (0%). Крупный рогатый скот, как и прежде, является основным видом домашнего скота, наиболее подверженным болезни -23 животных (85%). Заболеваемость свиней возросла, доля их составляет - 11%. Овцы в видовой структуре инфицированности животных сибирской язвой занимают 3-е место, и составляют 4%, необходимо отметить, что заболеваемость их снизилась в 54 раза.
На примере Актанышского, Мензелинского, Муслюмовского и Нижнекамского районов, мы провели расчет интенсивных показателей, представленный в таблице 8.
Из таблицы видно, что в периоды этих лет Актанышский район по всем показателям благополучен (0%). Заболеваемость с 1964 по 1978 гг. в Мензелин-ском и Нижнекамском районах среди крупного рогатого скота составляла 0,012 и 0,01 к 0,0% в 1991-2004 гг., заболеваемость свиней в последнем наоборот возросла в настоящее время.
Заболеваемость КРС в Муслюмовском районе увеличилась на 0,005%, а свиней и овец снизилась соответственно на 0,003 и 0,02%. Летальность живот ных при заболевании сибирской язвой во всех районах составляла 100% в оба периода исследования.
Коэффициент очаговости в расчете крупного рогатого скота для Нижнекамского и Мензелинского районов составил 1,3 и 1,25 в период с 1964 по 1978 гг., а для Муслюмовского - 1,0 с 1991-2004 гг. Очаговость инфицированных овец и свиней снизилась с 0,5 и 3,5 до 0,0 соответственно в Муслюмовском районе. Коэффициент очаговости больных антраксом свиней в Нижнекамском районе возрос до 1,0.
Таким образом, в настоящее время заболеваемость наблюдается среди КРС в Муслюмовском районе и свиней Нижнекамского района; средний показатель очаговости при этом составляет 1 больное сибирской язвой животное на 1 неблагополучный пункт.
Влияние климата региона на частоту проявления антракса
Роль природно-климатических факторов, таких как температура окружающей среды, относительная влажность, количество осадков, солнечная радиация на В. anthracis весьма существенна, но не однозначна.
В результате сопоставительного анализа динамики изменения числа вспышек сибиреязвенной инфекции и температуры воздуха за период с 1964 по 1974 гг., нами была установлена определенная закономерность: чем ниже была температура, тем реже регистрировались вспышки болезни (Рисунок 7.).
