Введение к работе
Актуальность проблемы
Pantoea ananatis — один из представителей семейства энтеробактерий, различные штаммы которого известны как растительные патогены либо эпифиты. В последние десять лет данный вид привлекает к себе всё большее внимание исследователей поскольку, с одной стороны, он оказался распространённым и опасным патогеном растений, а с другой его природные штаммы способны продуцировать целый ряд полезных веществ (например, каротиноиды, 2,3-бутандиол и т.д.). Учитывая способность P. ananatis быстро расти на простых минимальных средах, содержащих глюкозу, сахарозу и другие углеводы и углеводороды (Moriya et а!., 1999), данный вид можно рассматривать как перспективный объект биотехнологии.
На момент окончания экспериментов данной работы были секвенированы и аннотированы геномы только четырёх штаммов рода Pantoeal два из которых относятся к виду P. ananatis. При этом два генома (Pantoea sp. At-9b и Р. ananatis LMG20103) принадлежат патогенным штаммам и один геном принадлежит штамму Pantoea vagans С9-1, используемому в сельском хозяйстве в качестве био протектора. За период подготовки работы к публикации геномы ещё двух штаммов P. ananatis были секвенированы и аннотированы.
Объект настоящего исследования - штамм P. ananatis AJ13355, относящийся к первому уровню биобезопасности (непатогенный штамм), на базе которого в настоящее время создаётся ряд штаммов-продуцентов, часть из которых уже находится на стадии промышленного внедрения. Составление подробной аннотации генома данного штамма и реконструкция его центрального метаболизма, несомненно, является актуальной и практически значимой задачей. С другой стороны, сравнение геномов P. ananatis AJ13355 и LMG20103 могло бы пролить свет на генетическую природу патогенности последнего штамма.
Современные методы секвенирования, доступные программные средства и обширные базы данных, содержащие последовательности ДНК и белков позволяют быстро определять полные нуклеотидные последовательности бактериальных геномов, составлять их аннотации и реконструировать метаболические пути.
Однако экспериментальная проверка предсказанных моделей зачастую не проводится или существенно задерживается, что определяется отсутствием эффективных генноинженерных методов для конкретного исследуемого организма. Поэтому экспериментальная проверка функционирования предсказанных метаболических путей, поиск новых ферментов, специфических для данного вида или рода, представляет большой научный и практический интерес.
Цели и задачи работы
Диссертационная работа посвящена реконструкции путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Pantoea ananatis и экспериментальной проверке их функционирования.
В процессе работы решались следующие задачи:
аннотация генома и теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками P. ananatis;
экспериментальное подтверждение функционирования и оценка относительного вклада и взаимозаменяемости предсказанных путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками P. ananatis',
изучение генов P. ananatis, нераспространённых среди Энтеробактерий.
Научная новизна и практическая значимость работы
В диссертационной работе составлена подробная аннотация генома Р. ananatis AJ13355 и проведена теоретическая реконструкция центрального углеродного метаболизма для данной бактерии.
Ранее в нашей лаборатории были успешно адаптированы для использования в P. ananatis все наиболее эффективные методы прецизионной модификации хромосомы Е. coli, основанные на использовании системы гомологичной рекомбинации фага X и систем сайт-специфической рекомбинации. Это позволило нам в данной работе не только теоретически реконструировать центральный метаболизм углерода, но и, впервые для Pantoea, провести полную экспериментальную проверку построенной теоретической схемы. Ьыло экспериментально подтверждено существование предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы (фосфоенолпируват- зависимой фосфотрансферазной системы (PTS), H -симпортёров (GalP, XylE, FncP), глюкозодегидрогеназного пути, пути Эмбдена-Мейрхо фа-Парнаса и пентозо фосфатно го пути) в клетках P. ananatis, показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость, обнаружены интересные особенности регуляции.
В ходе работы были обнаружены специфические для Pantoea гены транспорта и катаболизма глюкозы (xylE, fucP, pqq, pzwf, pgnd) определяющие интересные особенности метаболизма. Использование найденных генов может быть полезным для повышения эффективности штаммов-продуцентов как на базе P. ananatis, так и на базе E.coli.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в журналах рекомендованных ВАК. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников «АГРИ» (июнь 2009).
