Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 6
1.1. История открытия цианобактерии-прохлорофитов и их распространение 6
1.1.1. Представители p. Prochloron 6
1.1.2. Представители p. Prochlorothrix 7
1.1.3. Представители p. Prochlorococcus 9
1.1.4. Представители p. Acaryochloris 10
1.2. Метаболизм цианобактерии-прохлорофитов 12
1.3. Экофизиологические условия обитания цианобактерии-прохлорофитов 16
1.4. Морфология цианобактерии-прохлорофитов 17
1.5. Внутриклеточное строение цианобактерии-прохлорофитов 18
1.5.1. Клеточная оболочка 18
1.5.2. Интрацитоплазматические мембраны 21
1.5.3. Зона нуклеоида 23
1.5.4. Включения 24
1.5.5. Покровные структуры 27
1.6. Способы подвижности цианобактерии 28
1.7. Особенности организации фотосинтетического аппарата цианобактерии и прохлорофитов 29
1.7.1. Пигментный состав 29
1.7.2. Состав и структура фотосинтетического аппарата 37
1.8. Систематика и филогения представителей филы вх cyanobacteria 50
Заключение к обзору литературы 55
Цель и задачи исследования ; 57
ГЛАВА 2. Материал и методы 58
2.1. Материал и условия культивирования 58
2.2. Микроскопия 60
2.3. Оценка влияния уровня солености среды 61
2.4. Регистрация фотоиндуцированных изменений внеклеточного РН 61
2.5. Спектрофотометрия 62
2.6. Получение сферопластов и бесклеточных препаратов 62
2.7. Анализ фикобилипротеинов 63
2.8. Высокоэффективная жидкостная хроматография 63
2.9. Получение мембранных препаратов и количественное определение пигментов 63
2.10. Получение и электрофоретическое разделение неденатурированных хлорофилл-белковых комплексов 64
2.11. Электрофорез денатурированных мембранных препаратов 65
2.12. Получение препаратов днк 66
2.13. Определение мол%гц 66
2.14. Днк-днк гибридизация 67
2.15. Получение нір 1/днк-амплификонов 68
2.16. Статистическая обработка результатов 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Морфология и ультраструктура представителей p. Prochlorothrix 69
3.1.1. Общий вид трихома и размер клеток 69
3.1.2. ультраструктура 75
3.2. экофизиологические признаки представителей p. prochlorothrix 93
3.2.1. галотолерантность 93
3.2.2. фотоиндуцированное изменение внеклеточного рн 96
3.3. пигментный состав представителей p. prochlorothrix 106
3.4. особенности организации фотосинтетического аппарата представителей P. PRochlorothrix 118
3.5. Геносистематические признаки представителей p. Prochlorothrix 123
Заключение 130
Выводы 132
Список литературы 133
- История открытия цианобактерии-прохлорофитов и их распространение
- Экофизиологические условия обитания цианобактерии-прохлорофитов
- Регистрация фотоиндуцированных изменений внеклеточного РН
- Морфология и ультраструктура представителей p. Prochlorothrix
Введение к работе
Фила ВХ Cyanobacteria является одной из наиболее архаичных ветвей эволюционного древа Bacteria. В ее состав входят оксигенные фототрофные бактерии {Cyanobacteria), облигатные эндоцитобионты Glaucocystophyceae (цианеллы), а также пластиды высших растений и зеленых водорослей (Castenholz, 2001). Наряду с этим их объединяет способность осуществлять оксигенную фототрофию, которую детерминируют консервативные гены, кодирующие апопротеины фотосистемы I (psaA-M), фотосистемы II (psbA-W) и Мп-стабилизирующий белок водоокисляющего комплекса (psbO) фотосинтетического аппарата. В то же время состав пигментов и апопротеинов светособирающих комплексов у окси-генных фототрофов варьирует (Пиневич, Аверина, 2002).
В зависимости от типа основного светособирающего комплекса (англ. light harvesting complex, LHC) оксигенные фототрофные бактерии подразделяются на собственно циа-нобактерий и прохлорофитов, или «других цианобактерий» (Matthijs et al, 1994). Собственно цианобактерии обладают эпимембранными гидрофильными LHC — фикобилисомами (ФБС), содержащими фикобилипротеины (ФБП). Прохлорофиты имеют интегральные гидрофобные мультимерные хлорофилл-белковые комплексы. В' отличие от цианобактерий sensu stricto прохлорофиты содержат хотя бы один вспомогательный хлорофилл (Пиневич и др., 2000). Данные последних лет расширили представления о разнообразии вспомогательных пигментов у прохлорофитов. Помимо хлорофилла (хл) Ъ к ним относятся дивинил-хл alb (агІЬі), xnd и хлс-подобный пигмент (Chisholm et al., 1992; Larkum et al., 1994; Miyashita et al., 1995). Оказалось также, что у прохлорофитов ФБП могут сосуществовать с хл d, как у Acaryochloris marina (Marquardt et al., 1998) или с хл агІЬг, как у Prochlorococcus marinus (Hess et al., 1996).
В первом издании «Руководства Берги по систематике бактерий» прохлорофитов диагностировали по наличию/отсутствию вспомогательного хл b (Castenholz, Waterbury, 1989). На основании этого хемотаксономического критерия в секции Oxygenic Phototrophic Bacteria (Оксигенные Фототрофные Бактерии) для представителей прохлорофитов выделили* порядок Prochlorales. Согласно последнему изданию «Руководства Берги по систематике бактерий» прохлорофитов, как и прочих представителей филы ВХ Cyanobacteria, классифицируют с помощью морфологических критериев (Castenholz, 2001). В соответствии с этой фенотипической классификацией одноклеточные бинарно делящиеся прохлорофиты Prochloron didemni, Prochlorococcus marinus и Acaryochloris marina относятся к Субсекции I (ранее пор. Chroococcales), а трихомные прохлорофиты рода Prochlorothrix — к
Субсекции III (ранее пор. Oscillatoriales). По результатам секвенирования 16S-pPHK установлено, что прохлорофиты полифилетичны, но все они располагаются на дендрограмме филы ВХ Cyanobacteria (Urbach et al., 1992; Wilmotte, Herdman, 2001).
В настоящее время основной акцент изучения цианобактерий из группы прохлоро-фитов сместился из области клеточной палеонтологии и эволюции пластид в область молекулярной эволюции апопротеинов светособирающих комплексов, а также их участия в распределении энергии между фотосистемами (Lewin, 1981; Wolfe et al., 1994; McFadden, 1996; Bibby et al., 2003a; Boichenko et al., 2007). Изучение биологического разнообразия Cyanobacteria позволяет выявить новые аспекты организации фотосинтетического аппарата оксигенных фототрофов и реконструировать пути эволюции их антенных систем (Chen et al., 2005b). Особый интерес представляет сравнительный анализ морфологических и моле-кулярно-генетических признаков, а также экофизиологических особенностей новых представителей цианобактерий из группы прохлорофитов.
В данной работе предпринято исследование цианобактерий-прохлорофитов p. Prochlorothrix — Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и Prochlorothrix hollandica PCC 9006. Полученные результаты рассматриваются в свете общих вопросов проблем классификации цианобактерий.
История открытия цианобактерии-прохлорофитов и их распространение
Первый хл о/6-содержащий прокариотический микроорганизм был обнаружен в 1975 г. независимо друг от друга Льюином и Ньюкомбом (Lewin, 1975; Newcomb, Pugh, 1975). Его определили как синезеленую водоросль отдела Cyanophyta, пор. Chroococcales — Synechocystis didemni. Уникальное сочетание прокариотного клеточного строения и «растительного» пигментного состава (наличие хл alb) переопределили его систематическое положение. Впоследствии ботаники создали для него новый таксон — отдел Prochlorophyta (Lewin, 1976). Под видовым названием Prochloron didemni он получил легитимное описание в соответствии с требованиями Международного Кодекса Ботанической Номенклатуры — ICBN (Lewin, 1977).
Анализ первичной структуры 16S-pPHK показал, что P. didemni принадлежит к домену Bacteria и, впоследствии, микроорганизм описали согласно требованиям Международного Кодекса Номенклатуры Бактерий — ICNB (Florenzano et al., 1986). В первом издании «Руководства Берги по систематике бактерий» Prochloron sp. поместили в порядок Prochlorales секции Oxygenic Photothrophic Bacteria (Gastenholz, Waterbury, 1989). В на стоящее время, во втором издании «Руководства Берги по систематике бактерий» P. didemni, как и остальные одноклеточные и бинарно делящиеся прохлорофиты, входит в Субсекцию I филы ВХ Cyanobacteria (Castenholz, 2001).
В природной среде обитания Prochloron sp. существует в качестве облигатного эпи-симбионта колониальных асцидий сем. Didemnidae. Его клетки обычно располагаются на поверхности туникальной части асцидий (Lewin, 1981). Известно около двадцати видов асцидий, симбионтом которых является Prochloron sp. К ним относятся Didem-пит carneolentum, D. molle, D. ternatanum, Diplosoma virens, Lissoclinum patella, L. voelzkowii и Trididemnum cyclops (Lewin, Cheng, 1993). Как правило, это обитатели прибрежной полосы (суб)экваториальной зоны, которые встречаются от Средиземного моря до Калифорнийского побережья Южной Америки и Большого барьерного рифа Австралии. Обычно они предпочитают теплое мелководье (до 5 м глубины), которое характеризуется широким диапазоном освещенности: от 50 лк до 2000 лк (Alberte et al., 1986; Lewin, Cheng, 1993).
Попытки культивировать P. didemni в лабораторных условиях не привели к успеху и показали, что он является облигатным симбионтом, поскольку зависит от незаменимых для него метаболитов асцидии-хозяина. В отдельных случаях P. didemni проявляет способность к слабому росту на морской минеральной среде (рН 5,5) с добавлением триптофана (Patterson, Withers, 1982). Таким образом, первый из обнаруженных прохлорофитов — морской эписимбионт асцидий Prochloron sp. относится,к некультивируемым формам оксифо-тобактерий и его изучение основано на природном материале.
Через десять лет после открытия Prochloron didemni стало известно о свободножи- вущем представителе прохлорофитов — Prochlorothrix hollandica (Burger-Wiersma et al., 1986). На этот раз легитимный диагноз был дан в соответствии с правилами Международного Кодекса Номенклатуры Бактерий, ICNB. Поскольку обнаруженный оксифототрофный микроорганизм имел хл alb и трихомный морфотип, авторы предложили внутри существовавшего в то время порядка Prochlorales создать новое семейство Prochlorotrichaceae с типовым родом Prochlorothrix (Burger-Wiersma et al., 1989). В настоящее время во втором издании «Руководства Берги по систематике бактерий» трихомные цианобактерии с недифференцированными клетками относятся к Субсекции III филы Cyanobacteria (Castenholz, 2001).
P. hollandica выделили из фитопланктона системы пресноводных озер Лоосдрехт в Нидерландах (5220 с.ш., 55 в.д.). Вода в этих неглубоких (до 2 м) искусственных водоемах прогревается летом до 15-18С ( рН 10). В этих условиях в фитопланктоне среди цианобактерий отмечается преобладание вида P. hollandica. Среда его обитания — эвтроф-ные водоемы с умеренной освещенностью (до 1000 лк) и низким содержанием фосфора (Burger-Wiersma et al., 1989; Post et al., 1994). Известно, что в качестве источника азота P. hollandica может использовать нитраты, аммоний (но не мочевину) и не способен осуществлять азотфиксацию (Burger-Wiersma et al., 1989).
В лабораторных условиях P. hollandica РСС 9006 культивируют в жидкой, а также на агаризованной (0,5-1,5% агара) минеральной среде FPG или BG-11 (рН 7-8,4) при температуре 20-22С и освещенности 400-600 лк (Burger-Wiersma et al., 1989).
Другой представитель p. Prochlorothrix — штамм Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 был обнаружен в озере Мэларен (Швеция) в районе массового цветения осциллаториоподобных цианобактерий (p. Limnothrix и Pseudanabaena). Детальное изучение фитопланктона этого водохранилища проводили из-за ухудшения качества питьевой воды, поступающей в г. Стокгольм. В результате комплексного химического анализа было установлено, что вода озера характеризуется повышенным уровнем эвтрофности из-за относительно высокого содержания фосфора (30 мг/л) и азота (650 мг/л). Предпочтительные условия для «цветения» цианобактерий в озере создаются поздним летом, когда температура воды составляет около 15С, а освещенность — около 400 лк. В этот период уменьшается концентрация кислорода (3-5 мг/л) и фосфора (20 мг/л), а количество доступных источников неорганического азота увеличивается (60 мг/л Юз и 5 мг/л NH/).
В лабораторных условиях Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 культивируют при 22-24С в жидкой или на агаризованной (0,8-1,6% агара) среде mBG-11 (Pinevich et al., 1999).
В 2003 г. Гайс с соавторами (Geip et al., 2003) сообщили, что с помощью генотипи-ческих методов анализа в пробах фитопланктона из южной части прибрежных вод Балтийского моря обнаружены последовательности ДНК, гомологичные генам pcb и 16S-pPHK P. hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90. В месте отбора проб в это время в фитопланктоне преобладали морские формы цианобактерий родов Planktothrix и Pseudanabaena. Выделить в культуру обнаруженный по «отпечаткам» ДНК новый штамм Prochlorothrix sp. пока не удалось. Однако вполне вероятно, что в заливах Балтики обитает морской представитель p. Prochlorothrix.
Экофизиологические условия обитания цианобактерии-прохлорофитов
В настоящее время известно, что прохлорофиты распространены достаточно широко. Это преимущественно морские или пресноводные планктонные формы. В частности, представители p. Prochlorococcus составляют основную массу океанического прокариотно-го пикопланктона и обеспечивают до 80% первичной продукции Мирового океана (Сагг, Mann, 1994; Partensky et al., 1999). Относительно недавно было обнаружено, что Acaryochloris sp. штамм Awaji является одним из самых распространенных микроорганизмов морского пикопланктона побережья Японии (Larkum, KUhl, 2005).
Известны свободноживущие и симбиотические формы прохлорофитов. Например, P. didemni и A. marina MBIC-11017 являются симбионтами асцидий (Lewin, 1977; Miyashita et al., 1996; Castenholz, 2001). Большинство прохлорофитов (за исключением
Prochlorothrix sp. PCC 9006 и Acaryochloris sp. CCMEE 5410) обитают в олиготрофных условиях (Burger-Wiersma et al., 1989; Lewin, 1989; Larkum, Kuhl, 2005; Post, 2006). Среди прохлорофитов преобладают мезофилы. Они встречаются преимущественно в нейтральных или слабощелочных, пресных или умеренно соленых водоемах.
Фила ВХ Cyanobacteria — эволюционно родственная, но морфологически разнородная группа, которая включает как одноклеточные, так и трихомные (нитчатые) формы ок-сигенных фототрофных прокариотов (Castenholz, 2001). Одноклеточные прохлорофиты имеют сферическую или овальную форму. Размер округлых клеток Prochloron sp. варьирует от 9 до 30 мкм (Lewin, Cheng, 1989). Клетки P. marinus имеют самый небольшой размер (0,5-0,8x0,4-0,6 мкм) и по праву относятся к пикопланктону (Rippka et al., 2000). Интересно, что размер клеток у Prochlorococcus spp. зависит от экотипа и может увеличиваться практически вдвое у штаммов, обитающих при низкой освещенности (Partensky et al., 1999а). Клетки А. тагіпаМВїСА 1017 имеют размер 1,8-2,1x1,5-1,7мкм, а у штамма Acaryochloris sp. CCMEE 5410 — около 2x3 мкм (Miyashita et al., 1997; Miller et al., 2005).
Одноклеточные цианобактерии способны делится бинарно (эквивалентно, как Synechococcus sp. и не эквивалентно, как Hamaesiphon sp.) или множественно (с образованием беоцитов — мелких специализированных для расселения клеток, как у Pleurocapsa sp.), способом перетяжки или септированием (Кондратьева, 1996). Клетки в трихоме делятся бинарно, в одной плоскости, а при делении в нескольких плоскостях — формируются клеточные скопления (микроколонии) правильной и неправильной формы (например у Dermocarpa sp. или Myxosarcina sp.). У одноклеточных форм прохлорофитов обнаружено только бинарное эквивалентное деление, которое происходит способом перетяжки (Partensky et al., 1999; Marquardt et al., 2000).
У цианобактерии различают простые и сложные трихомы. Простые трихомы состоят из одного ряда недифференцированных клеток (Oscillatoria spp. или Prochlorothrix spp.). Трихомы некоторых цианобактерии (например Spirulina sp.) способны к спирализации (Кондратьева, 1996). В составе сложных трихомов встречаются специализированные клетки, отличающиеся от вегетативных клеток размером и формой. Это могут быть акинеты — покоящиеся клетки, или гетероцисты — клетки, приспособленные для ассимиляции молекулярного азота в аэробных условиях. У прохлорофитов образование дифференцированных клеток не отмечено (Castenholz, 2001).
Трихомы некоторых цианобактерий ветвятся. К истинному ветвлению приводит способность клеток трихома делиться в разных плоскостях (иногда с образованием многорядных трихомов, как у Fisherella sp.), в результате чего возникают однорядные трихомы с боковыми ветвями (как у Stigonema sp.). Ложное ветвление трихомов не связано с делением клеток, и является следствием объединения разных нитей посредством чехла или слизи под углом друг к другу как, например, у Scytonema sp. (Wilmotte, Golubic, 1991; Кондратьева, 1996).
Деление клеток в трихоме обычно осуществляется путем септирования, т.е. врастания поперечной перегородки, состоящей из муреинового слоя и цитоплазматической мембраны 1 (англ. cytoplasmic membrane, СМ), без участия наружной мембраны (англ. outer membrane, ОМ). Поэтому клетки в трихоме окружены общей ОМ и посредством микроплазмодесм объединяются в одно квази-синцитиальное образование (Пиневич, Аверина, 2002).
Размножение трихомов цианобактерий может происходить за счет фрагментации (разлома между клетками), с помощью разрушения специальных некридиальных клеток, а также при образовании гормогониев (например, у Nostoc sp.). Последние представляют собой олигомерные трихомы и служат также расселительнош стадией в жизненном цикле цианобактерий (Громов, 1996; Кондратьева, 1996).
Регистрация фотоиндуцированных изменений внеклеточного РН
Световая микроскопия. Прижизненные препараты просматривали и фотографировали с помощью фазовоконтрастного микроскопа Leica (объектив х40 и хЮО, окуляр х15). Для определения линейных размеров клеток фотографии трихомов Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 сканировали и обрабатывали с помощью программы Image Tool 2.0.
Электронная микроскопия. Для электронной микроскопии использовали стандартные и модифицированные методы фиксации, постфиксации и последующей обработки материала (Sommerville, Scheer, 1987). Клетки или сферопласты (получение см. раздел 2.6) осаждали на центрифуге Т-24 (4000 об/мин, 5 мин). Осадки ресуспендировали в 0,15 М Na-фосфатном буфере (рН 7,0), а затем при 4С последовательно префиксировали 0,5%-ным OsC 4 (30 мин), фиксировали 1,5%-ным глутаровым альдегидом (12 ч) и постфиксировали 1%-ным Os04 (12 ч). После этого материал помещали в 2%-ный агар, обезвоживали серией спиртов возрастающей концентрации (от 25 до 100%) и заключали в смолу Spurr или LR-White (Sigma). Продолжительность полимеризации при 60С составляла 12 ч.
Ультратонкие срезы получали на микротоме фирмы Reichert с помощью стеклянных ножей. Затем срезы контрастировали насыщенным 4%-ным спиртовым раствором уранил-ацетата (15 мин) и дополнительно окрашивали 30 мин раствором цитрата свинца (Reynolds, 1963; Geyer, 1973). Полученные срезы просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100 или Tesla при ускоряющем напряжении 75-90 кВ.
Для выявления запасных полисахаридов срезы после фиксации инкубировали в парах 2%-ного йода и 3%-ного иодида калия (растворенных в 90%-ном этаноле) при 55С в течение 1,5 ч.
Для иммуноцитохимического определения локализации RuBisCO, клеточный материал фиксировали 2,5%-ным глутаровым альдегидом в 0,15 М Na-фосфатном буфере (рН 6,5) при 5С 18 ч, после чего инкубировали 30 мин с 0,15%-ным глицином в 0,15 М Na-фосфатном буфере (рН 6,5) при комнатной температуре. После этого материал иммобилизовали в 1%-ной агарозе, окрашивали рутением красным и обезвоживали серией спиртов возрастающей концентрации, после чего заключали в полимеризационную смолу LR-White (Sigma). Полученные ультратонкие срезы обрабатывали 40 мин 1%-ным бычьим сывороточным альбумином с 0,1%-ной желатиной в PBS-буфере (137 мМ NaCl; 2,7 мМ КС1; 1,5мМКН2Р04; 8 мМ Na2HP(V, рН 7,3). Затем срезы инкубировали 60 мин с поликлональными антителами кролика против L-субъединицы RuBisCO Synechococcas sp. PCC 6301 и обрабатывали 60 мин антикроличьими антителами крысы, конъюгированными с частицами коллоидного золота (диаметр 10 нм, Sigma). Все антитела были любезно предоставлены д-ром Матхайсом (Амстердамский ун-т, Нидерланды). Проинкубированные срезы умеренно контрастировали цитратом свинца (10-15 мин) и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100.
Культуры выращивали в колбах на 50 мл с 30 мл жидкой среды при комнатной температуре и освещенности 700 лк. К одинаковому количеству посевного материала в среде wBG-11 добавляли стерильный раствор NaCl до конечной концентрации 50, 100, 200 и 400 мМ. Влияние уровня солености среды оценивали по динамике роста суспензионных культур. Оптическую плотность регистрировали с помощью спектрофотометра СФ-26.
Культуры выращивали в колбах на 50 мл с 35 мл жидкой среды при 16, 22 и 26С и освещенности 700 лк. Изменение рН в суспензии культур P. hollandica РСС 9006 и Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 регистрировали при заданной температуре и освещенности на авторской модельной установке. Динамику фотоиндуцированного изменения рН прослеживали с помощью самописца, присоединенного к электродной паре, помещенной в стеклянную камеру объемом 5 мл, при постоянном перемешивании и термостатировании. Источником света служила точечная лампа (10 В/100 Вт), снабженная конденсорной линзой и стационарным водяным фильтром. Уровень дополнительной освещенности (300, 700, 1300 и 2700 лк) изменяли при помощи стандартных кварцевых фотофильтров. Продолжительность предварительной адаптации культур составляла 15 мин, освещения — 2 мин, релаксации — 15 мин.
Для изучения причин обратимых фотоиндуцированных изменений внеклеточного рН использовали ингибитор мембранной БҐ-АТФазьі — N, Ni-дициклогексилкарбодиимид (DCCD, Serva), ингибитор карбоангидразы — сульфодиметоксин (4-амино-п-2,6-диметокси-4-пиримидинил-бензосульфонамид), а также релаксаторы протонного градиента — карбо-нилцианид /я-хлорфенилидразон (СССР, Serva) и NH4CI. Влияние 2 мМ DCCD, 6 мМ суль-фодиметоксина, 0,5 мМ СССР и 500 мМ NH4CI определяли непосредственно после добавле ния действующего реагента в клеточную суспензию. Динамику изменения рН в присутствии ингибиторов и релаксаторов протонного градиента регистрировали при освещенности 5500 лк.
Спектры поглощения интактных клеток и клеточных гомогенатов регистрировали с помощью спектрофотометра Aminco DW-2000 или СФ-26. Флуоресценцию при комнатной температуре или 77К измеряли с помощью спектрофлуориметра Aminco-Bowman АВ2. Спектры флуоресценции, полученные при комнатной температуре (20±2С), получали без применения фильтров с добавлением к материалу дихлорфенилдиметилмочевины (DCMU, Sigma), что позволило сравнить тестируемые штаммы при максимальном уровне флуоресценции. При получении низкотемпературных (77К) спектров флуоресценции, культуры выдерживали 1 ч в темноте, а затем помещали в стеклянные капилляры (диаметром 1 мм) и немедленно замораживали. Низкотемпературную флуоресценцию регистрировали с использованием защитных фильтров РМТ или OG590 (Schott).
Сферопласты, т.е. частично лишенные наружной мембраны и пептидогликанового слоя клетки, получали по методу Брэдли (Bradley, 1983). При этом, клетки осажденные центрифугированием (4000 об/мин, 20 мин) и отмытые 25 мМ трис-HCl буфером (рН 7,2), обрабатывали 4-5 ч при 35С лизоцимом (Sigma, 60 ед. активности/мл; конечной конц. 500 мг/мл) в 25 мМ трис-HCl буфере (рН 7,2) с 0,5 М маннитом. Для получения бесклеточных препаратов разрушеные клетки центрифугировали (8000 об/мин, Юмин), а оставшиеся в супернатанте мембранные частицы дополнительно осаждали при 18000 об/мин, 60 мин.
Для выявления ФБП в бесклеточных препаратах использовали модифицированный метод Глэзера (Glazer, 1988). Осажденные клетки ресуспендировали в 0,6 М Na-фосфатном буфере (рН 7,5) и разрушали в прессе Френча под давлением 800 кг/см2. В гомогенат добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 3,5% (по объему) и перемешивали 30 мин на магнитной мешалке. После центрифугирования (8000 об/мин, 20 мин) материал расслаивался на водную и детергентную фазы. Водную фазу отбирали шприцем со дна пробирки и повторно центрифугировали 30 мин при 8000 об/мин. Спектр поглощения водной (цитозольной) и детергентной фазы регистрировали с помощью спектрофотометра СФ-26 при 450-700 нм.
Морфология и ультраструктура представителей p. Prochlorothrix
Длинные ( 250 мкм) неветвящиеся , трихомы Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 состоят из недифференцированных цилиндрических клеток (рис. 13 и 14). Апикальные клетки по форме не отличаются от интеркалярных. В области межклеточного контакта клетки сужаются на 1/8-1/5 ширины, как у цианобактерий рода Limnothrix. В отличие от них представители p. Pseudanabaena имеют более глубокие перетяжки - 1/2-1/5 диаметра клетки (Castenholz, 2001).
Размножение Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 происходит путем случайной фрагментации трихомов или при участии некридиальных клеток. Образование гормогониев у представителей рода Prochlorothrix не наблюдается (Burger-Wiersma et al., 1989; Pinevich et al., 1999).
Согласно классификации Риппка с соавторами (Rippka et al., 1979), Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 можно отнести к группе LPP (Lyngbya-Plectonema-Phormidium). Однако, в отличие от родов Lyngbya и Phormidium у представителей у. Prochlorothrix отсутствует чехол (Burger-Wiersma et al., 1989; Golecki, Jurgens, 1989; Pinevich et al., 1996; Pinevich et al., 1999). По классификации Anagnostidis и Komarek, трпред-ставители p. Prochlorothrix принадлежат к сем. Pseudanabaenaceae, пор. Oscillatoriales (Anagnostidis, Komarek, 1988). В частности, их общая морфология совпадает с описанием цианобактерий p. Limnothrix (Komarek, 2003).
Таким образом, подобно другим цианобактериям Субсекции III {Oscillatoriales) представители p. Prochlorothrix обладают прямыми трихомами с недифференцированными клетками.
Во втором издании «Руководства Берги по систематике бактерий» (Castenholz, 2001) в Субсекции III для трихомных прохлорофитов, на основании хемотаксономического критерия — наличия в составе пигментов хл Ъ, выделен род Prochlorothrix.
С помощью компьютерной морфометрии впервые определили линейные параметры клеток Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и уточнили размер клеток P. hollandica РСС 9006.
В результате проведенных измерений установлено, что клетки Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 имеют длину 7,4±0,7 мкм и ширину 2,1 ±0,1 мкм. Соотношение длина/ширина составляет 3,5.
По литературным данным, длинный ( 400 мкм) трихом P. hollandica РСС 9006, состоит из цилиндрических клеток размером 0,5-1,5x3-10 мкм (Burger-Wiersma, 1991). Согласно нашему результату, длина клеток P. hollandica РСС 9006 составляет 11,8±0,9 мкм, ширина — 1,6+0,1 мкм, а соотношение длина/ширина — 7,4.
С помощью -критерия Стьюдента и F-критерия Фишера (при уровне значимости р 0,05) показано, что линейные параметры клеток Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 достоверно различаются. Линейные параметры клеток Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica РСС 9006 в виде средних значений со стандартным отклонением приведены в таблице 2. Статистически обработанные морфометрические данные представлены графически нарис. 15 и 16.
Общий план строения клеток Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 и P. hollandica PCC 9006 сходен. Он включает параллельно-периферическое расположение тилакоидов (по отношению к клеточной стенке), центральную зону нуклеоида и полярные агрегаты газовых везикул (рис. 17 и 18). Микрофотографии ультратонких продольных и поперечных срезов клеток и сферопластов цианобактерий p. Prochlorothrix, полученные с помощью методов электронной микроскопии представлены на рис. 17-28.
Клеточная оболочка. В составе клеточной оболочки цианобактерий p. Prochlorothrix обнаружены наружная мембрана ( 8 нм) и цитоплазматическая мембрана (7,5-8 нм). Они разделены электронопрозрачным периплазматическим пространством ( 20 нм), содержащим тонкий муреиновый слой (рис. 19; 21 А). Необходимо отметить, что в случае Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 толщина муреинового слоя составляет не более 20 нм, а у P. hollandica PCC 9006 достигает 20-40 нм (Golecki, Jurgens, 1989; Pinevich et al., 1999).
Таким образом, представители p. Prochlorothrix, как и остальные цианобактерий имеют клеточную оболочку грамотрицательного типа, что подтверждается результатами биохимических исследований (Jurgens, Speth, 1991).
Деление клеток. Клетки большинства одноклеточных и многих трихомных цианобактерий делятся способом перетяжки. При этом в процессе внутренней инвагинации участвуют все слои клеточной оболочки. Напротив, деление осциллаториоподобных цианобактерий осуществляется септированием, т.е. путем врастания поперечной перегородки, состоящей из муреинового слоя и СМ, без участия ОМ (Кондратьева, 1996; Castenholz, 2001).
Согласно полученным данным, клетки Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 делятся бинарно, комбинированным способом перетяжки и септирования. Этапы деления клетки Prochlorothrix sp. NIVA-8/90 показаны на рис. 20. Вначале в центре клетки происходит совместная инвагинация ОМ и СМ, т.е. клетки начинают делиться способом перетяжки (рис. 20А). Однако затем деление продолжается способом септирования, поскольку ОМ не принимает активного участия в формировании межклеточной перегородки. При этом, между двумя слоями СМ синтезируется муреиновый слой, а затем центральная область цитоплазмы с ти-лакоидами рассекается фронтом врастающей с противоположных сторон септы (рис. 20Б).
Похожие диссертации на Исследование цианобактерий рода Prochlorothrix
