Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Цианобактерий гидротерм 9
1.1.1. Систематическое положение и распространение 9
1.1.2. Структура цианобактериальных сообществ 15
1.1.3. Адаптации цианобактерий к условиям гидротерм 16
1.2. Ультраструктура клеток цианобактерий 18
1.3. Молекулярно-биологические методы в систематике цианобактерий 21
1.4. Биоминерализация кремнезема цианобактериями 24
1.4.1. Биоминерализация кремнезема в термальных источниках . 25
1.4.2. Современные представления о механизмах биоминерализации кремнезема 29
1.5. Сохранность ископаемых цианобактерий 33
1.6. Общая характеристика гидротерм Байкальской рифтовой зоны . 34
1.7. Заключение по обзору литературы 36
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Отбор проб и культивирование цианобактерий 41
2.2.2. Световая и эпифлуоресцентная микроскопия 42
2.2.3. Сканирующая электронная микроскопия 43
2.2.4. Трансмиссионная электронная микроскопия 43
2.2.5. Молекулярно-биологические методы 44
2.2.6. Эксперименты по окремнению цианобактерий 46
ГЛАВА 3. Видовое разнообразие цианобактериальных сообществ гидротерм 48
ГЛАВА 4. Морфология и ультраструктура культивируемых цианобактерий 60
ГЛАВА 5. Сравнительный и филогенетический анализ последовательностей штаммов, выделенных из гидротерм байкальской рифтовой зоны 77
5.1. Сравнительный анализ 77
5.2. Филогенетический анализ 83
ГЛАВА 6. Роль цианобактерий в осаждении кремнезема 93
6.1. Исследование с помощью сканирующей электронной микроскопии 93
6.2. Исследование с помощью трансмиссионной электронной микроскопии 97
6.3. Динамика окремнения цианобактерий по данным химического анализа 101
Выводы 106
Список литературы
- Адаптации цианобактерий к условиям гидротерм
- Биоминерализация кремнезема в термальных источниках
- Световая и эпифлуоресцентная микроскопия
- Филогенетический анализ
Введение к работе
Актуальность темы. Цианобактерии являются древнейшими фотосинтезирующими организмами на планете, возраст которых по находкам окаменевших строматолитов определяется 3,5 млрд. лет назад (Walsh, 1992; Allwood et al, 2006). Цианобактериальные пленки или маты, сходные с ископаемыми сообществами, в массе развиваются в современных термальных источниках, являясь моделью для реконструкции процессов, происходивших в докембрии (Орлеанский, Раабен, 1996; Бактериальная палеонтология, 2002; Заварзин и др., 2003). Исследование строматолитов, кремневых туфов, травертинов и других минеральных отложений в гидротермах показало, что в них наряду с абиогенным отложением происходит биоминерализация соединений кремния, кальция, фосфора, железа и марганца цианобактериями (Герасименко и др., 1999; Konhauser et al, 2001; Sigler et al., 2003). Показано, что из всех минералов кремнезем лучше фиксирует структуру клеток, сохраняя морфологию микроорганизмов (Бактериальная палеонтология, 2002; Walsh, 1992). Для изучения процесса биоминерализации кремнезема цианобактериями предпринят ряд лабораторных экспериментов, после которых механизмы и динамика окремнения остаются невыясненными (Крылов, Тихомирова, 1988; Westall et al, 1995; Phoenix et al, 2000; Yee et al, 2003; Benning et al, 2004). Геомикробиологические исследования важны не только для задач изучения современного воздействия микроорганизмов на геологическую среду, но и как актуалистический материал для интерпретации ископаемых объектов.
В пределах Байкальской рифтовой зоны известно более 50 групп термальных источников (Кустов, Лысак, 2000). Данным исследованием охвачены гидротермы, находящиеся на побережье озера Байкал и в Тункинской долине, имеющие важное рекреационное и бальнеологическое значение. Цианобактерии гидротерм Байкальского региона изучены недостаточно. В исследованиях микробных сообществ Котельниковского, Давшинского и Хакусского источников цианобактериальной составляющей уделено мало внимания, литературные сведения о цианобактериях других источников отсутствуют (Компанцева, Горленко, 1988; Белькова и др., 2005). Цель и задачи. Целью работы было исследование видового разнообразия цианобактерии в термальных источниках Байкальской рифтовой зоны и изучение отложения кремнезема цианобактериями -модельными объектами для исследования фоссилизированных остатков. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить видовой состав цианобактерии термальных источников Котельниковский, Змеиный, Хакусы, Сухая, Давшинский, Горячинский, Аршан и Жемчуг.
Сформировать коллекцию чистых культур цианобактерии из термальных источников, описать их морфологию и ультраструктуру клеток, установить систематическое положение.
Определить филогенетическое положение культивируемых цианобактерий по 16S рибосомному гену.
Исследовать способы, локализацию и динамику отложения кремнезема в экспериментах с цианобактериями разных видов, используемых как модельные объекты для исследования фоссилизированных остатков.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика цианобактерий термальных источников Байкальской рифтовой зоны. В работе приводятся данные микроскопических и молекулярно-биологических исследований цианобактерий в культурах и природных пробах. Выявлено значительное видовое разнообразие цианобактерий в термальных источниках. Описаны особенности ультраструктуры девяти штаммов цианобактерий. С помощью молекулярно-биологических методов проведен сравнительный анализ цианобактерий исследованных гидротерм с цианобактериями из различных гидротерм мира.
Практическая значимость. Сформирована коллекция культур цианобактерий, изолированных из термальных источников, которая используется в учебных и научных целях. Охарактеризована их морфология и ультраструктура, определено систематическое положение, получены и внесены в мировую базу данных GenBank 16 последовательностей 16S рРНК генов. Выявленные в работе морфологические и ультраструктурные признаки цианобактерий могут быть использованы при составлении определителей. Результаты изучения видового состава позволяют дать оценку качества вод термальных источников, широко применяемых в бальнеологии. Данные об ультраструктуре силифицированных цианобактерий могут быть использованы при анализе ископаемых остатков.
В диссертацию вошли результаты, полученные при финансовой поддержке грантов Президиума РАН № 18.4; НШ-2195.2003.4 (поддержка ведущих научных школ), гранта 2006-РИ-112/001/007 и Фонда содействия отечественной науке.
Защищаемые положения:
В сообществах термальных источников Котельниковский, Змеиный, Хакусы, Сухая, Давшинский, Горячинский, Аршан и Жемчуг доминируют цианобактерий родов Phormidium, Leptolyngbya, Chroococcus, Geitlerinema и Pseudanabaena. Видовой состав цианобактерий варьирует в зависимости от условий обитания и географического расположения источников.
По данным филогенетического анализа большинство выделенных из исследованных термальных источников штаммов являются родственными термофильным цианобактериям из различных гидротерм мира.
Нитчатые цианобактерий способны к осаждению кремнезема с формированием трубок с гладкими и неравномерно утолщенными стенками и состоящих из наносфер.
4) Окремнение ограничивается чехлами цианобактерий, полисахариды
которых адсорбируют частицы аморфного кремнезема и являются матрицей
для окремнения. Живые клетки цианобактерий, находясь в окремненных
чехлах, не подвергаются минерализации, сохраняют типичную ультраструктуру и способность к размножению.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международном симпозиуме "Живые клетки диатомей" (Иркутск, 2004), на III международной конференции "Климатические изменения в Центральной Азии" (Улан-Батор, Монголия, 2005), на международном рабочем совещании "Происхождение и эволюция биосферы" (Новосибирск, 2005), на 19-ом международном диатомовом симпозиуме (Иркутск, 2006), на III, IV и V Всероссийских научных школах молодых ученых-палеонтологов (Москва, 2006, 2007, 2008), на международном симпозиуме "Происхождение и эволюция биосферы" (Лутраки, Греция, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 18 научных работ, из них 6 - статьи, 1 - глава в монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 126 страницах, содержит 14 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 186 наименований, в том числе 148 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю Ольге Ивановне Белых, сотрудникам отдела ультраструктуры клетки, сотрудникам центра коллективного пользования "Электронная микроскопия" за совместную работу и полученные результаты.
Определение химического состава воды источников провела М.В. Сакирко (лаборатория гидрохимии и химии атмосферы ЛИН СО РАН). Определение нуклеотидных последовательностей выполнил к.б.н. Р.В. Аделыпин (приборный центр "Секвенирование"). Анализ и фотографирование образцов в SEM-EDAX провели д.б.н. Е.В. Лихошвай и д.х.н. В.В. Анненков (отдел ультраструктуры клетки). Определение количества кремния в биомассе цианобактерий выполнили д.х.н. В.В. Анненков и к.х.н. Е.Н. Даниловцева. Автор искренне благодарит всех упомянутых участников работы.
Адаптации цианобактерий к условиям гидротерм
Основным экологическим фактором, ограничивающим существование живых организмов в горячих источниках, является температура термальных вод. Цианобактерии имеют высокий оптимум по этому показателю - многие из них хорошо растут при 25-30С. Самую высокую температуру (более 73С) выдерживают некоторые штаммы Synechococcus lividus, их выделение в культуры ведут при 60-70С (Castenholz, 1969). При температуре до 60-64С возможен рост Fischerella sp. (Mastigocladus laminosus) и Phormidium laminosum. Многие цианобактерии растут при 45-50С. К ним относятся представители родов Synechococcus, Gloeocapsa, Oscillatoria, Lyngbya (Кондратьева и др., 1989). Некоторые нитчатые цианобактерии (например, О. terebriformis) при изменении интенсивности извержения и направления течения термальных вод могут перемещаться на участки с более походящей для них температурой (Castenholz, 1968).
Вторым немаловажным фактором, влияющим на структуру сообществ гидротерм, является рН. Чаще всего встречаются щелочные источники с рН вод около 9. Они привлекают внимание исследователей самыми высокими показателями температуры на Земле, при которой живут микроорганизмы. Именно в щелочных гидротермах наиболее разнообразен видовой состав цианобактерии и велика их биомасса, поскольку данное значение рН для цианобактерии является оптимальным (Fogg et al., 1973; Кондратьева и др., 1989).
Основу матов обычно составляют нитчатые осциллаториевые цианобактерии. Это связано с наличием у них ряда уникальных особенностей, дающих им преимущества при росте в экстремальных условиях. Синтез мощных полисахаридных оболочек защищает трихомы цианобактерии от неблагоприятных факторов окружающей среды. Отмечают, что в химическом составе цианобактерий высоко содержание углеводов (до 24% от сухого веса), основных компонентов клеточных стенок и слизистых чехлов. Показано, что существует прямая положительная корреляция (г = 0,67) между содержанием органического вещества микробных матов и температурой воды в источнике (Брянская, Калашникова, 2004). Помимо защитной функции, полисахаридные оболочки обеспечивают формирование плотной слоистой структуры мата за счет склеивания нитей.
Значительное число цианобактерий могут фиксировать молекулярный азот. Известно более 200 штаммов азотфиксирующих цианобактерий, принадлежащих к разным родам. Среди них есть одноклеточные формы (Gloeothece, Synechococcus) и многоклеточные формы с гетероцистами родов АпаЪаепа, Nostoc, Fischerella. Обнаружена также способность к фиксации N2 у многоклеточных цианобактерий из числа Oscillatoria, Psendanabaena, Lyngbya, Phormidium, которые гетероцист не образуют (Кондратьева и др., 1989). Повышение температуры культивирования до 28-3 0С в некоторых случаях увеличивает интенсивность азотфиксации (Fogg, Thanun, 1960).
При участии цианобактерий в биогенном образовании минералов, важной адаптацией к недостатку света является способность к гетеротрофному питанию. Выявлено, что в кремневом туфе фотосинтетически активная радиация проникает только сквозь верхние 2 мм минерала, а жизнеспособные цианобактерий, находят и глубже 3 мм (Konhauser et at., 2001; Pentecost, 1995). Способность к гетеротрофному росту в темноте отмечалась для штаммов Oscillatoria, Lyngbya, Phormidium, Calothrix и Fischerella (Кондратьева и др., 1989; Rippka et al., 1979; Whitton, 1987).
Важной особенностью цианобактерий, способствующей их выживанию в экстремальных условиях, является подвижность. Благодаря способности нитчатых цианобактерий к скользящему и ползающему движению они могут менять свое положение в мате, выбирать наиболее благоприятные условия окружающей среды (освещенность, температура, аэрация) (Castenholz, 1968). Неподвижные во взрослом состоянии ветвящиеся формы цианобактерий родов Calothrix, Fischerella имеют в своем жизненном цикле подвижную стадию -гормогонии. Изменения экологических условий индуцирует образование гормогониев у таких видов (Rippka et al., 1979). После неблагоприятного периода выжившие цианобактерий поднимаются из нижележащих слоев мата, перезаселяя его поверхность (Konhauser et al., 2001). При фоссилизации полисахаридных оболочек цианобактерий способны покидать их и продолжать свою жизнедеятельность (Герасименко и др., 1999). Благодаря подвижности трихомы осциллаториевых цианобактерий переплетаются и сцепляются друг с другом, образуя стратифицированные маты с множеством слоев. В отличие от них, сообщества одноклеточных цианобактерий эфемерны и легко разрушаются (Сергеев и др., 2002; Konhauser et al., 2001).
Биоминерализация кремнезема в термальных источниках
Осаждение аморфного кремния, фосфора и кальция — один из наиболее важных геологических процессов в современных горячих источниках, однако, роль микроорганизмов в нем окончательно не определена. В настоящее время доказано биогенное, т.е. в результате деятельности бактерий, происхождение фосфоритов, доломитов, горючих сланцев, кремневых туфов (Герасименко и др., 1999; Konhauser et al, 2001; Sigler et al, 2003). Способность цианобактерий осаждать кремнезем привлекает внимание с эволюционной точки зрения в контексте исследования метаболизма кремния и генов, контролирующих этот метаболизм у эукариотических водорослей — хризофитовых и диатомовых, которые используют кремний для построения цист, чешуек и панцирей.
Окремненные цианобактерий находят в горячих источниках Исландии, США, Новой Зеландии, Китая, Японии, Мексики (Phoenix et al, 2000; Guidry, Chafetz, 2003; Mann et al, 1991; Jones et al, 1997; XiaoTong et al, 2007; Tazaki, 1997; Canet et al, 2005). Предположение об участии микроорганизмов в формировании кремнеземных отложений в Иелоустоне впервые было высказано в 1889 году, но долгое время исследователи игнорировали его, считая происхождение минералов исключительно абиотическим процессом (Guidry, Chafetz, 2003). Анализ отложений у источника Стимбоут, Иелоустон, показал, что цианобактерий «...являются в лучшем случае, только второстепенным фактором, вызывающим полимеризацию и осаждение кремнезема...» (White et al, 1956). Позднее исследователи выявили, что цианобактерий могут концентрировать кремний в клетках и чехлах (Ferris et al, 1986; Mann et al, 1991). Показано также, что цианобактерий в источниках Исландии способствуют осаждению кремнезема, обеспечивая сайты нуклеации (Konhauser, Ferris, 1996). Накопление кремния в цианобактериях in situ подтверждается рентгеноспектральним микрозондовым анализом. Сравнивая содержание различных элементов в цианобактериальных матах и водах источника Абисс Пул, Иелоустон (Mann et al., 1991), авторы делают вывод о способности цианобактерий концентрировать кремний из окружающей среды. Помимо кремния, в цианобактериях обнаружили кальций, натрий, магний, алюминий, железо, медь, титан, хром, никель, кобальт, селен, платину. Другие элементы, напротив, содержались в цианобактериях в меньших количествах, чем в воде (бор, германий, ртуть, сурьма, йод, молибден). К. Тадзаки и X. Ишида (Tazaki, Ishida, 1996) в цианобактериальных матах японских гидротерм обнаружили относительно высокие концентрации мышьяка и стронция (0,2-3,7%). Большое количество стронция зафиксировано и в биоматах источника Жемчуг Байкальской рифтовой зоны (Tazaki et al., 2001). В горячих источниках вулканической зоны Таупо, Новая Зеландия, было отмечено накопление ртути и таллия микроорганизмами, тогда как мышьяк и сурьма включались в состав кремневых туфов абиогенно (McKenzie et al., 2001). Микробные маты из Котельниковского источника Байкальской рифтовой зоны (Белькова и др., 2005) накапливают кремний, кальций, железо. В их составе также детектировались магний, фосфор, калий, марганец, сера, алюминий, титан. На клеточных стенках гетеротрофных бактерий Bacillus sp. были зафиксированы начальные стадии минералообразования в виде частиц с аморфной структурой богатых кремнием и кальцием (Белькова и др., 2005).
С развитием электронной микроскопии окремненные цианобактерий обнаруживают в строматолитах и кремневых туфах в горячих источниках по всему миру.
В кремневом туфе источника Крисувик, Исландия (Konhauser et al., 2001), отмечены окремненные цианобактерий родов Calothrix и Fischerella. Туф наполовину состоял из минерализованных цианобактерий и имел слоистую структуру. Чередование слоев биогенного происхождения со слоями абиогенного кремнезема исследователи объясняли различиями в сезонном росте цианобактерий. При окремнении вокруг клеток цианобактерий образовались чехлы толщиной от 5 мкм и до нескольких десятков микрометров в тех случаях, когда цианобактерий были скреплены вместе в единый аморфный матрикс. Окремнение захватывало только наружную часть клеток — полисахаридные чехлы и клеточную стенку, цитоплазма сохраняла прижизненную структуру. Полностью минерализованные клетки, которые встречались в туфе, вероятно, были мертвыми к началу окремнения. В электронном микроскопе биогенная минерализация выглядела как сферические гранулы от нескольких сотен нанометров до 2 мкм в диаметре.
Подобная слоистая структура строматолита с чередованием слоев кремнезема биогенного и абиогенного происхождения обнаружена во Фраин Пен Лэйк, Новая Зеландия (Jones et al., 2005), где в составе окремненных микроорганизмов доминировали Phormidium, и, местами, Fischerella laminosus. Анализ поперечных срезов Phormidium показал, что осаждение аморфного кремнезема происходит вокруг чехла. В просвете между окремненным чехлом и клеточной стенкой кремнезем отсутствовал. Хорошая сохранность цитоплазмы дает авторам основание утверждать, что окремнение начиналось, пока клетки оставались живыми.
Световая и эпифлуоресцентная микроскопия
Цианобактерия Pseudanabaena sp. 0411 была выделена из термального источника Котельниковский, Leptolyngbya laminosa 0412 - из источника Змеиный. Эти цианобактерий имеют длинные трихомы диаметром около 2 мкм, заключенные в тонкие полисахаридные чехлы. При росте на жидкой среде Z-8 цианобактерий этих штаммов образуют слоистые кожистые пленки - маты. Цианобактерия Synechococcus bigranulatus 0431 была выделена из термального источника Котельниковский. На жидкой среде представляла собой суспензию светло-зеленого цвета. Клетки штамма палочковидной формы, иногда слегка изогнутые, без слизистых капсул, размер клеток составляя 1.5-2.0 мкм в ширину и 3.6-7.7 мкм в длину. Культуры для эксперимента выращивались в течение 3 недель. Затем пленки измельчали на кусочки размером 2-3 мм2 и добавляли в пробирки равные объемы гомогената; суспензию одноклеточных цианобактерий гомогенизировали пипетированием. Для эксперимента по окремнению инактивированных цианобактерий клетки выдерживали 10 мин в растворе 2% глутарового альдегида, затем центрифугировали и трижды промывали дистиллированной водой.
Опыты по окремнению цианобактерий проводились в пластиковых планшетах для микрокультивирования с плоскодонными лунками объемом 400 мкл («Linbro, ICN Biomedicals») и в пластиковых пробирках объемом 1,6-2 мл при температуре 36С в термостате. Среда для экспериментов по окремнению готовилась следующим образом: растворы Na2Si03 х 5Н20 («Fluka Chemika», Германия) концентрацией 10,7, 20 и 50 тМ нейтрализовали 2 М НС1 до рН 7,0-7,2 («Microprocessor рН Meter, Hanna Instruments», США), затем добавляли среду Z-8, так, что ее конечная концентрация в культуральной среде составляла 10%. Полученную среду добавляли в лунки (пробирки) с измельченной культурой цианобактерий, ресуспендировали и культивировали в течение 26 дней с заменой раствора через два дня на свежий.
Контроль жизнеспособности цианобактерий в течение опыта производили, используя эпифлуоресцентную микроскопию. Живые клетки цианобактерий имели ярко-оранжевую флуоресценцию при возбуждении зеленым светом. Для изучения динамики окремнения образцы отбирали на 1, 2, 3, 6, 10, 15, 20, 25 день эксперимента, и готовили препараты для СЭМ и ТЭМ по методикам, описанным выше. Химический состав определяли с помощью зондирования SEM-EDAX на базе Объединенного института геологии, геофизики и минералогии им. А.А. Трофимука СО РАН, г. Новосибирск (Титов А.Т.) и Хельсинского университета, Финляндия (University of Helsinki, Laboratory of Polymer Chemistry, Karesoja M.).
Определение содержания кремния в биомассе цианобактерий проводилось методом молибденовой сини. Биомасса цианобактерий, промытая водой 3 раза высушивалась в вакууме ( 0,1 мм.рт.ст.) в течение 8 ч. Навеску высушенной биомассы (1-2 мг) помещали в пластиковую пробирку, добавляли 1,5 мл 0,3 М NaOH, пробирки взвешивали и выдерживали 15-20 ч при комнатной температуре, после чего нагревали при 100С 30 минут. В пробирки после нагревания добавляли воду для компенсации потерь при испарении, основываясь на данных взвешивания до и после нагревания. Из полученных растворов отбирали по 3 пробы объемом 0,2 мл и определяли в них содержание кремния методом молибденовой сини (Айлер, 1982). Полученные результаты пересчитывали на содержание кремния в сухой биомассе. Статистическую обработку данных (расчет стандартного отклонения) проводили в программе Excel for Windows 2000. Фазу кремнезема аморфный/кристаллический определяли на световом микроскопе Olympus DP 12 в поляризованном свете (Институт земной коры СО РАН, аналитики: чл.-корр. РАН Скляров В.К. и к.г.-м.н. Меныпагин Ю.В.).
Исследованные термальные источники располагаются в порядке убывания щелочности воды. Змеиный источник Развитие цианобактерии в Змеином источнике наблюдалось при температуре 45-34С. Воды источника щелочные низкоминерализованные, содержат сероводород (табл. 5). Таблица 5. Физико-химические условия в точках отбора проб Змеиного источника Точка отбора пробы Описание мата Т воды,С ЕС25 мСмм рН о2 Р043" Si NH4+ N02" N03" мг/л Сруб на изливе Темно-зеленая пленка на досках 45 542 9,41 0,0 0,557 20,69 4,64 0,004 0,12 Ручей от сруба к Байкалу Двуслойный мат,сверху сине-зеленый, снизу — оранжевый 40-34 535 9,33 0,0 0,652 22,73 5,08 0,004 0,08
На дереве сруба, окружающем район выхода термальных вод, при температуре 44-45С наблюдали темно-зеленые обрастания, в составе которых доминировала Leptolyngbya laminosa (Gom.) An. et Кот. В составе обрастаний в небольшом количестве обнаружены цианобактерии Leptolyngbya halophila (Hansg. ex Gom.) An. et Kom., Spirulina meneghiniana Zanardini ex Gom., Synechococcus lividus, Aphanocapsa thermalis (Copeland) An. et Kom. Плавающие и прикрепленные к субстрату биопленки развивались в ручье ниже сруба при температуре 40С, они разделялись на слои - верхний зеленого цвета толщиной 1-3 см и нижний пурпурный (1-2 мм). В верхнем зеленом слое мата доминировали L. laminosa и Geitlerinema lemmermannii (Wolosz.) An., встречался Synechococcus bigranulatus (рис. 2a, б). Единично отмечались Geitlerinema sulphureum (Strzesz.) An. и G. amphibium (Ag.) Anagn.
При температуре 34С, у впадения ручья в Байкал в составе мата были обнаружены L. thermalis, G. lemmermannii, G. amphibium, S. bigranulatus. Из проб цианобактериальных матов были выделены штаммы L. laminosa 0412, Pseudanabaena sp. 0512, Leptolyngbya sp. 0612. Таким образом, наименьшим видовым разнообразием при наибольшей степени развития отличался цианобактериальный мат, формировавшийся при температуре 40С.
Филогенетический анализ
В результате амплификации и секвенирования участка хромосомной ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, были определены частичные нуклеотидные последовательности: 430 п.н. для штамма Synechococcus bigranulatus 0431, 640 п.н. для штамма Pseudanabaena sp. 0411 и 600 п.н. для штамма Leptolyngbya sp. 0511 (Сороковикова и др., 2008).
Сравнительный анализ штамма Synechococcus bigranulatus 0431 показал, что ближайшими родственниками в GenBank являются только некультивируемые цианобактерии, последовательности которых получены молекулярными методами (см. Приложение 2). Самый высокий процент гомологии (98%) был получен с последовательностью цианобактерии (DQ001391, Lau et ah, 2006) из термальных источников Центрального Тибета, Китай и последовательностями (AY787616, AY787607, Hongmei et ah, 2005) из гидротерм Таиланда. Следует отметить, что еще три последовательности (DQ001388-DQ001390, Lau et ah, 2006), полученные из источников Центрального Тибета, имеют процент гомологии 97%. Остальные родственники имеют процент сходства ниже 96% - это последовательности изолята Synechococcus sp. (AY884060, Allewalt et ah, 2006) и цианобактерии (AF445722, AF445693), полученные из микробных матов и травертинов гидротерм Йелоустонского НП, США.
Последовательность штамма Pseudanabaena sp. 0411 имела высокий процент гомологии (99%о) с последовательностями штаммов 19-2 и 11-3 (AF317504, AF317503, Miller, Castenholz, 2001), выделенных из термальных источников Новой Зеландии и определенных авторами как Oscillatoria amphigranulata Van Goor - синоним Pseudanabaena amphigranulata (Van Go or) Anagn. Следует отметить, что данный вид является единственным культивируемым организмом среди ближайших родственников Pseudanabaena sp. 0411. По мнению авторов, P. amphigranulata характерна только для гидротерм Новой Зеландии (Miller, Castenholz, 2001). Однако высокий процент сходства последовательностей этих штаммов с полученной нами последовательностью позволяет предполагать, что география этого вида гораздо шире, и он встречается в других термальных источниках мира. На это также указывает высокий процент гомологии (99%), который имеет последовательность некультивируемой цианобактерии (AY236476, Lacap et ah, 2005) из цианобактериальных матов термальных источников Вандер Лэйк, Филиппины. Следующие ближайшие родственники штамма Pseudanabaena sp. 0411 имеют процент гомологии ниже 93%. Это последовательности (AY874091, Ng et al., 2006; AY151728, Taton et ah, 2003), полученные молекулярно-генетическими методами без культивирования из туфов гидротерм Тароко, Тайвань, и микробных матов оз. Фрикселл, Антарктика. Последовательность штамма Leptolyngbya sp. 0511 имела максимальное сходство (98%) с последовательностями штаммов Schizothrix sp. (AY790862, AY790868, AY790869, Norris, Castenholz, 2006), выделенных из травертинов гидротерм Йелоустона, США. Для других ближайших родственников процент гомологии составлял 94% и менее. Среди них были культивируемые Leptolyngbya sp. (DQ431005 и EF088339, Roeselers et ah, 2007), выделенные из термального источника Гренландии и из пресного водоема Бразилии, и некультивируемые организмы (EF032782, EF032789, AY874085, Ng et al, 2006) из матов лавовой пещеры Гавайского вулканического НП, США, и туфов термального источника, Тайвань. Источник Аршан
В результате амплификации и секвенирования участка хромосомной ДІЖ, кодирующего ген 16S рРНК, были определены частичные нуклеотидные последовательности: 644 п.н. для штамма Anabaena variabilis 0441, 607 п.н. для Phormidium corium 0415, 610 п.н. для P. corium 0416 и 608 п.н. для Mastigocladus laminosus 0423.
Последовательность штамма Anabaena variabilis 0441 была идентична последовательностям штаммов A. variabilis КСТС AG10059 (DQ234826), A. variabilis АТСС 29413 (СР000117), A. variabilis IAM М-204 (АВ074502), A. flos-aquae UTEX 1444 (AY271842), выделенных из почв и пресных водоемов Кореи, Японии, США и Бразилии.
Последовательности штаммов P. corium 0415 и P. corium 0416 были близки на 99%. Высокая степень гомологии данных последовательностей (99-98%) отмечена с последовательностями некультивируемых цианобактерий (АВ254249 и EF662969), полученных из почв сельскохозяйственных полей Японии и США. Остальные родственники имели степень сходства ниже 94% и были представлены штаммами P. murrayi (AY493627, AY493598 и AY493626, Taton et al., 2006) и Microcoleus glaciei UTCC 475 (AF218374, Casamatta et ah, 2005), выделенными из арктических озер.
