Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Проблемы оценки генетического риска 11
1.1.1. Стратегия исследований генотоксичности отдельных компонентов и комплексных природных систем 11
1.1.2. Оценка генотоксичности в бактериальных
тест-системах 14
1.2. Почва как комплексная система накопления и трансформации антропогенных загрязнений 18
1.2.1. Экологические функции городских почв 18
1.2.2 Факторы и процессы, обеспечивающие токсический и мутагенный потенциал почвы 21
1.2.3. Естественная динамика состава и численности микробных почвенных сообществ 31
1.3. Регуляция физиологической активности микробного сообщества 35
1.3.1. Регуляция тина клеточного ответа в зависимости от концентрации эффектора 35
1.3.2. Индукция анабиотического состояния микроорганизмов 37
1.4. Общая и экологическая характеристика городов Казань и Улан-Батор 40
ГЛАВА 2. Материалы и метод
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы 50
2.1.1. Исследуемые образцы почв и приготовление почвенных вытяжек 50
2.1.2. Бактериальные штаммы з
2.1.3. Микросомные фракции 54
2.1.4. Химические индукторы анабиоза бактерий и прочие реагенты 54
2.2. Химические методы анализа 54
2.2.1. Измерение содержания общего органического вещества в почве 54
2.2.2. Определение свободного гистидина в образцах почвы 54
2.2.3. Количественное определение алкилрезорцинолов 55
2.3. Микробиологические методы анализа 56
Определение родового состава и численности микробных сообществ 56
2.4. Методы биотестирования 57
2.4.1. Оценка токсического действия почвенных вытяжек по отношению к тестерным микроорганизмам 57
2.4.2. Тест на прямое повреждение бактериальной ДНК 58
2.4.3. Тест Эймса на выявление генных мутаций 58
2.4.3.1. Тест Эймса без метаболической активации 58
2.4.3.2. Тест Эймса Salmonella/микросомы 60
2.5. Математическая обработка результатов 60
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Токсичность почвенных образцов Монголии и Татарстана по отнощению к Salmonella typhimurium 61
3.2. ДНК-повреждающий эффект образцов городских почв Монголии и Татарстана 65
3.3. Мутагенная активность образцов почв Монголии и Татарстана в микробных тест-системах 69
3.4. Динамические изменения состава микробного биоценоза образцов городских почв Монголии и Татарстанав модельных условиях 79
3.5. Изменение мутагенной активности образцов городских почв Монголии и Татарстана в модельных условиях 84
3.6. Химический анализ образцов почв Монголии и Татарстана 88
3.6.1. Результаты измерения содержания общего органического вещества в исследуемых почвах 88
3.6.2. Оценка содержания свободного гистидина в образцах почв Монголии и Татарстана 90
Заключение 92
Выводы 102
Литература
- Стратегия исследований генотоксичности отдельных компонентов и комплексных природных систем
- Микросомные фракции
- Мутагенная активность образцов почв Монголии и Татарстана в микробных тест-системах
- Химический анализ образцов почв Монголии и Татарстана
Стратегия исследований генотоксичности отдельных компонентов и комплексных природных систем
Не касаясь проблем тестирования на генотоксичность биологических жидкостей организма (кровь, моча и др.), а также оставляя вне рассмотрения аналогичный анализ техногенных и природных вод, только в рамках почвенной тематики можно привести ряд примеров успешного и полезного с практической точки зрения определения генотоксического потенциала различных почв.
Введение в практику оценки экологического состояния почв такого показателя, как генотоксичность, во многом поможет предсказать отдаленные эффекты использования почв. Выбор простого теста, адекватно отражающего генотоксические свойства комплексной природной системы, каковой в данном контексте выступает почва, позволит анализировать долгосрочные последствия антропогенных загрязнений по отношению к естественным биоценозам и конкретно к человеку. 1.1.2. Оценка генотоксичности в бактериальных тест-системах
Тесты на мутагенность обычно используются для предсказания канцерогенных свойств химических веществ. Чувствительность теста отражает ту часть канцерогенов, которые позитивны в пробе на мутагенность, а специфичность - содержание некарциногенов, которые дают отрицательный ответ при проверке на мутагенность. Наиболее часто для выявления генных мутаций используются следующие бактериальные тест-системы: тест Эймса по реверсии ауксотрофных по гистидину штаммов Salmonella typhimurium к прототрофности [Мarоп, Ames, 1983], тест по реверсии ауксотрофных по триптофану штаммов E.coli WP2 к прототрофности (оба регистрируют обратные мутации) и тест на устойчивость к арабинозе у Salmonella (прямые мутации) [Jurado et al., 1994]. В качестве иных показателей генетических нарушений при действии мутагенов на бактерии применяют пробу на избирательную гибель дефектных по различным путям репарации штаммов Bacillus subtilis в сравнении с диким типом (rec-тест) и пробу на индукцию SOS-функций клетки при повреждении ДНК у E.coli [Quillardet, Hofnung, 1985, 1993].
Тест Эймса Salmonella/ишросомы является бесспорным лидером по частоте использования вследствие высокой чувствительности. Если учесть известные факты плохой регистрации в тесте Эймса эффектов карциногенных металлов [Barret, 1993], неактивных галогенированных соединений, как то диоксинов, полибромированных бифенилов, хлордана (так называемые негенотоксичные или эпигенетические канцерогены), и не включать соединения такого рода в статистический анализ, то чувствительность теста составит 93% для канцерогенных по отношению к одному виду животных - либо к мышам, либо к крысам - соединений, и 100% для канцерогенов, выявляемых в обоих видах [Ashby, Tennant, 1991]. Хотя прогностические возможности проб на генотоксичность определяют обычно сравнением с пробами на канцерогенность в грызунах, само установление канцерогенных свойств варьирует между опытами с мышами и крысами на 61% [Tennant et al., 1987]. Принимая во внимание известные недостатки тестирования на канцерогенность с животными, а именно недостаточную статистическую достоверность, высокий спонтанный уровень опухолеобразования у грызунов, отсутствие повторностей в дорогостоящих биопробах, трудности с режимом дозирования и пр. [Prival, Dunkel, 1989], можно считать тест Эймса абсолютно необходимым для выявления мутагенных свойств соединений, которые с большой вероятностью можно считать канцерогенными. Есть и другие факты, подтверждающие значимость теста Salmonella/микросомы. Например, результаты этого теста на 87% коррелировали с регистрацией структурных изменений ДНК, а те вещества, которые некорректно регистрируются в тесте как канцерогены или некарциногены, практически не удается классифицировать и в других краткосрочных тестах [Ashby, Tennant 1991]. Анализ крупной базы данных, включающей 351 канцероген испытанный также в тесте Эймса показал 81%о между мутагенностью и индукцией опухолеобразования [Gold et al 1993]
Микросомные фракции
В работе использованы лиофилизованные микросомные (S9) фракции печени крыс и плаценты человека (получены из Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г.Пермь). При приготовлении микросомной фракции печени использованы самцы крыс Wistar весом 150-200г. Для индукции ферментов животным ежедневно вводился фенобарбитал (80мг/кг) за 3 суток до забоя. Гомогенаты печени и плаценты человека приготовлены согласно методу, описанному Maron and Ames [1983]. Микросомная фракция представляет собой супернатант, полученный при 20-минутном центрифугировании гомогената печени при 9000g.
Использовали химический аналог индукторов анабиоза бактерий факторов di Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus - C6-алкилоксибензол (гексилрезорцин, М.в.=196, Sigma) Вещество вначале растворяли в ДМСО, затем делали соответствующие разведения в воде.
Если не указано специально, другие использованные в работе реактивы высокой степени очистки были производства объединения «Химреактив», г.Москва. 2.2. Химические методы анализа Общее количество органических компонентов было определено в СCL4- экстрактах путем регистрации спектров поглощения (Т,%) в области 2900-3000 см" (Specord, 75IR, Carl Zeiss, Jena, BRD), которое характеризует присутствие -СН2-СН2- и СН3-СН2- групп. Расчет содержания органического вещества проводили в условных единицах оптической плотности но формуле: Допт. = 1/lg Т%.
Повышенное содержание гистидина в пробах может стать причиной ложноположительных результатов в тесте Эймса. Доза гистидина, необходимая для удвоения ревертантов, равна 150 нмоль/чашку (232 мкг/мл) [Nylund, Einisto, 1993]. Минимальная обнаруживаемая концентрация гистидина методом тонкослойной хроматографии составляет 7 мкг/мл.
Количественное содержание гистидина определяли по методу, разработанному Ильинской и др. [2001].
Подготовленный образец почвенной вытяжки и стандартные растворы гистидина наносили на хроматограмму в количестве 10 мкл/пятно. Пластинки хроматографировали трижды в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (30:6:14). После каждого прогона пластинку подсушивали на воздухе. По окончании разделения пластинку сушили при 40"С, обрабатывали 0.2% раствором нингидрина в ацетоне и нагревали 5 мин. 80С. Гистидин проявляется в виде рыжекоричневых пятен на желтоватом фоне. 2.2.3. Количественное определение алкилрезорцинов
Методика обнаружения алкилрезорцинов основана на их способности взаимодействовать с диазотиевой солью 1,3 - диметоксибензидина с образованием окрашенных в красный цвет продуктов реакции, представляющих собой азосочетание. В работе применяли коммерческий реактив, известный под названием Fast Blue В salt (FBB) [Мулюкин и др., 1996].
2.5 мг FBB растворяли в 5 мл 5% уксусной кислоты (раствор А) и хранили в холодильнике при 0С в темной посуде. Рабочий реактив В получали разбавлением 1 части реактива А в 4-х частях я-пропанола (до 25 мл). Для определения алкилрезорцинов брали 1.8 мл реактива В и 0.2 мл исследуемого раствора. Оптическую плотность проб измеряли на ФЭКе при длине волны 490 им. Для построения калибровочного графика готовили растворы нескольких концентраций 4;г-гексилрезорцина ("Sigma", США) и измеряли их. Нижний предел чувствительности метода - 2мкг алкилрезорцина на пробу.
Для выявления, изучения и учета численности различных почвенных микроорганизмов использовали методы посева из почвенной суспензии на специфические плотные и в жидкие питательные среды [Мишустин, Емцев, 1987; Бабьева, Зенова, 1989].
Для выделения бактерий из почвы использовали глюкозо-пептонный агар (ГПА), для микроскопических грибов - сусло-агар (СА). 0.1мл почвенной суспензии (1г почвы на 1мл стерильной водопроводной воды) высевали на плотные среды. Чашки Петри инкубировали при 28"С. На ГПА на 1-3-е сутки роста учитывали споровые и неспоровые формы бактерий, на сусло-агаре на 5-7-е сутки роста -колонии грибов.
Колонии бактерий на средах описывали отмечая следующие признаки: размер колонии (колония крупная - 10мм в диаметре; средняя -1-10мм; мелкая точечная - 1мм); профиль колонии (колония выпуклая, конусоидная, плоская, кратерообразная); край колонии (ровный, лопастной, волнистый, зубчатый, бахромчатый, фестончатый); поверхность колонии (гладкая бугристая складчатая морщинистая с концентрическими кругами); цвет колоний; блеск и произрачность; консистенция (тестообразная, густая, слизистая, жидкая, клейкая).
Мутагенная активность образцов почв Монголии и Татарстана в микробных тест-системах
Выявление микроорганизмов, качественно и количественно не свойственных исходной природной зоне, составляет основу микробиологического мониторинга городской среды.
Важность изучения биологических свойств почв города определяется тем, что почва служит основным местом стока урбаногенных веществ, в частности и мутагенных [Скворцова и др., 1989]. Преобразование и обезвреживание этих веществ зависит от состояния микробных сообществ почв. Для налаживания мониторинга биологических свойств почв города необходимо охарактеризовать современное состояние их микробного комплекса в городах и выявить факторы, его обусловливающие [Добровольский, 1997].
Для микробиологического анализа исследуемых почв мы применили стандартный метод посева на агаризованные среды. Полученные данные приведены в табл. 14-17.
Из данных табл.14 видно, что количество колоний бактерий в почвах Монголии колеблется от 800-4000 на 0,1 г почвы. В почве рынка "Shonkhor" и иле очистных сооружении содержание бактерий наиболее велико. В других почвах содержание бактерий практически одинаково.
Установлено, что среди исследуемых образцов в иле очистных сооружений и в почве жилых кварталов высока численность грибов. Таблица 14 Численность отдельных групп микроорганизмов в почвах Монголии П -в модельных условиях в почвах Монголии родовой и видовой состав микроскопических грибов не отличается разнообразием. Обнаружено лишь 3-4 вида (Aspergillus, Trichoderma, Mucor). В исследуемых почвах доминируют представители рода Мисог. Не обнаружено дрожжевых микроорганизмов в образцах, хотя степной биогеоценоз весьма богат ими. Известно, что актиномицеты бедно представлены в северных почвах [Мишустин, 1987], действительно мы не обнаружили их в исследуемых почвенных образцах.
В почвах Татарстана общее число колоний, учитываемых на ГПА, достигает 3000-4000 (табл.15). Оказалось, что в почвах Татарстана обшее число бактерии и грибов значительно выше, чем в Монголии.
В почвах территорий, подвергшихся поверхностному загрязнению (автострады, пищевой и авторынок), количество бактерий возрастает. В модельных условиях искусственной засухи количество всех зарегистрированных групп микроорганизмов уменьшается (таб.15). После обрабатки почв di - фактором (в течение 7 дней) число микроорганизмов не изменяется (образцы 1 и 3). Увеличивается число мелких колонии бактерии, уменьшается количество средних колонии для образца 1. Выявлено, что актиномицеты распространены в почвах автострад и пригородных зонах. Грибы 3-5 видов встречаются во всех исследуемых образцах. В почвах Татарстана также, как и в Монголии, доминирует Мисог. Как видно из приведенных данных, состав микрофлоры богато представлен бактериями. В качестве индикатора на урбаногенез может быть выбрана определенная популяция бактерий, например, доминирующая в урбаноземах за счет соответствия ее потребностей некоторым урбаногенным свойствам почв, или благодаря уменьшению конкуренции со стороны нетолерантных к урбаногенезу микроорганизмов [Добровольский, 1997].
К числу таких доминантов в исследуемых почвах относятся спорообразующие бактерии рода Bacillus (табл.16 и 17, культура 2, 3). Р. Bacillus - хемоорганотрофные, грамположительные, подвижные, каталазоположительные палочки, образующие эндоспоры.
Во всех образцах почв Монголии и Татарстана распространены бактерии, которые дают на питательном среде мелкие, гладкие, белые, блестящие колонии, определенные как Azotobacter (культура 1) по совокупности морфологических и биохимических свойств. Грамотрицательные, каталазоположительные, короткие палочки, хорошо растущие в аэробных условиях. Оптимальная температура 20-30С. рН оптимум 7,0-7,5. Azotobacter фиксирует азот на среде Эшби, продуцирует капсульную слизь, не разжижает желатину.
Значительным можно считать содержание культур 1, 2 и 3 (табл.16 и 17), то есть различные морфотипы Bacillus и Azotobacter. Остальные бактерии в исследуемых почвах малочисленны и не имеют решающего значения для биологической характеристики почвы.
При оценке численности бактерий показательным является не абсолютная, а относительная их численность, возрастающая при усилении признаков загрязнения. Так, в почве пригорода Казани число колоний Bacillus (тип 1)выросших ни чашке, составляет 3, тогда как в почве на загрязненной территории эта цифра достигает 50, а в почве сильно загрязненного участка число колоний индикаторной бактерии достигает 2000.
Экспериментальные данные позволяют сделать заключение, что численность микроорганизмов в исследуемых почвах неодинакова. Показано, что Монгольские почвы в целом беднее по составу и численности микроорганизмов, чем почвы Татарстана. Вероятно, климатические условия Монголии (резкоконтинентальный климат, малая влажность) не способствуют сохранению биоразнообразия микрофлоры
Химический анализ образцов почв Монголии и Татарстана
Главными отраслями промышленности г.Улан-Батора являются легкая (трикотажная, коверная, текстильная, кожаная, меховая, пуховая и др.) и пищевая промышленность. В г.Улан-Баторе работают 3583 компаний, 1220 кооперации, 1381 личных хозяйств и государственных промышленных предприятий.
Сегодня в г.Казани, за исключением нескольких локальных (например, для завода Органического синтеза), и в г.Улан-Баторе работает одно городское базовое очистное сооружение. Образец 5 г.Улан-Батора -ил городских очистных сооружений, находится в промышленной зоне, в р. Khan-Uul, мимо течет река Тула.
Образец 5 г.Казани - ил городских очистных сооружений, куда поступают бытовые и большинство промышленных стоков.
Известно, что в составе сточных вод ежегодно в поверхностные водные объекты поступают разнообразные химические соединения. В частности, для Казани в 1998 г. сброс таких веществ составил следующие величины (в тыс.т.): нефтепродукты - 0,15; сульфаты - 26,3; хлориды -17,9; фосфор общий - 0,5; азот общий - 0,3; азот аммонийный - 1,7; нитраты - 0,3; жиры, масла - 1,5.
По химическому анализу установлено, что из всех исследуемых образцов в илах очистных сооружений обоих городов содержится наибольшее количество органических компонентов (рис.14, 15). Илы очистных сооружений обоих городов проявляют и токсический, и ДНК-повреждающий эффекты (рис.4, 5 и табл.12, 13). Водные вытяжки ила очистных сооружений г.Казани проявили мутагенную активность без метаболической активации. С метаболической активацией илы очистных сооружений обоих городов обладали мутагенностью для всех исследуемых вариантов растворителей (рис.9, 11). В целом можно сказать, что промышленные отходы г.Казани и г.Улан-Батора обладают генотоксичностью и служат важным источником загрязнения почв. Генотоксическое состояние почв на территории жилой зоны г.Казани и г. Улан-Батора. Основным элементом структуры города являются проспекты, улицы. Современная улица - клубок противоречивых городских функций: это и напряженная транспортная артерия, и общественно - парадный фасад застройки, и средоточие пешеходных потоков. И в то же время именно в русле улицы наиболее сложная экологическая обстановка - высокая загазованность, шумовой фон, стрессовые ситуации. Создается парадоксальная ситуация, когда по замыслу градостроителя именно на столичных улицах переплетены инженерно-транспортные и общественно-торговые функции [Бочкарево и др., 1989]
В этой группе объединены результаты исследований следующих образцов: Образец 2 г.Улан-Батора - почва жилой зоны, y.Khangain-21, в p.Sukh-Baatar. Здесь находятся личные дома, киоски и автостоянка; образец 7 г.Улан-Батора - почва жилой зоны, y.Janjnii-22, в районе Bayanzurkh; образец 8 г.Улан-Батора - центр города. Около этого участка находятся клуб, магазины, городская почта.
Образец 2 г.Казани - центр города, в районе площады Тукая, у так называемого транспортного кольца; образец 4 г.Казани - пригородная зона, в Советском районе, на территории лесопосадки возле улицы 8 марта.
Результаты исследования почв центра обоих города показывают большую токсичность. Все образцы, кроме водной вытяжки пригородной зоны г.Казани, демонстрируют отсутствие мутагенности как водных, так и органических экстрактов (рис.10). В центре г.Улан-Батора содержание органического вещества велико, возможно, поэтому органические вытяжки этого участка максимально ингибировали рост Е.сої і wp2 в тесте на повреждение ДНК (табл.8, образец N8).
Генотоксическая активность почв y.Khangain-21 и центра города Улан-Батора выше, чем в других участках города. Это зависит от санитарно-гигиеничесного состояния этих участков, числа населения и автодвижения. Именно около y.Khangain-21 находится автостоянка автомобилей грузовых перевозок.
Для образцов г.Казани показана самая низкая генотоксичность почв улиц и площади среди других участков города. Генотоксическое состояние почв на территории рынков г.Казани и г. Улан-Батора.
Рынок - это один из пунктов уплотнения населения и автотранспорта города. В последнее время число рынков увеличивается. В г.Казани работают более 40 рынков. В г.Улан-Баторе работают 25 рынков, из них 52% пищевых, 20% пищевых и вещевых, 28%) рынков сырья, технических и строительных материалов. 12 рынков работают в закрытых, 13 -открытых местах. Мы отбирали почвенные образцы на территории Зх рынков в г.Улан-Баторе и одного (Колхозного) рынка г.Казани.
Образец 1 г.Улан-Батора - почва на территории рынка строительного материала, расположенного у. 100 ailiin gudamj, p. Sukh-Baatar. Вокруг этого рынка находятся магазины, больницы и дома. Образец 3 г.Улан-Батора - почва на пищевом рынке "Shonkhor". Вокруг расположены частные дома. Образец 9 г.Улан-Батора - почва на пищевом рынке "Bumbugur", который находится не далеко от монастыря, магазинов, киосков и автостоянки.
Образец 3 г.Казани - Колхозный рынок на улице Кирова. Результаты нащих исследовании доказали, что по генотоксическому состоянию рынок "Shonkhor" г.Улан-Батора и Колхозный рынок г.Казани являются самыми опасными местами среди всех исследуемых почв.
Значительный токсический и ДНК-повреждающий эффекты установлены для почв рынка "Shonkhor", рынка строительного материала г.Улан-Батора и ночв на территории Колхозного рынка г.Казани. Водные вытяжки этих почв проявили мутагенность средней силы (рис.8, 10). Это означает, что не только промышленность, но и бытовые загрязнения вносят вклад в генотоксический потенциал почв. Изучение корреляционной зависимости между химическими и биологическими показателями исследуемых почв.
