Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Инфекции, вызываемые буркхольдериями 12
1.2. Принципы идентификации буркхольдерий 21
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Штаммы микроорганизмов, используемые в работе 35
2.2. Питательные среды и условия культивирования 38
2.3. Постановка биохимических реакций 40
2.4. Постановка серологических реакций .47
2.5. Определение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам, детергентам и красителям 49
2.6. Определение вирулентности и иммуногенности буркхольдерий для лабораторных животных 50
2.7. Идентификация штаммов буркхольдерий по системе Nefermtest24 50
2.8. Генетическоя трансформация у буркхольдрий 52
2.9. Постановка ПИР 53
Глава 3. Результаты исследований 55
3.1. Сравнительное изучение роста буркхольдерий на питательных и селективных средах 55
3.2. Биохимические тесты 62
3.3.Серологические исследования 70
3.4. Резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам и разного рода ингибиторам 77
3.5. Вирулентность и иммуногенность буркхольдерий для лабораторных животных 80
3.6. Идентификация штаммов буркхольдерий по системе Nefermtest24 83
3.7. Трансформация хромосомной ДЬЖ у различных видов буркхольдерий 87
3.8. ПЦР в идентификации буркхольдерий 88
3.9. Принципы и схема идентификации буркхольдерий, наиболее значимых в медицинской практике 88
Заключение 95
Выводы 104
Список литературы 106
- Инфекции, вызываемые буркхольдериями
- Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
- Сравнительное изучение роста буркхольдерий на питательных и селективных средах
- Резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам и разного рода ингибиторам
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время борьба с инфекциями во всем мире приобретает особый характер, так как расширение международных контактов создает большие возможности для распространения из эндемичных природных очагов даже редко обнаруживаемых патогенных видов микроорганизмов, в том числе возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к роду Burkholderia (В.И.Илюхин, 1985,1999; Yang S, 2000; Leelarasamee А, 2004).
Большинство бактерий рода Burkholderia относятся к сапрофитам, для медицинской практики определенное значение имеют четыре вида -Burkholderia mallei, B.pseudomallei, B.cepacia, B.thailandensis. Два из них являются патогенными и их обычно выделяют в самостоятельную группу. Это В.mallei и B.pseudomallei - возбудители сапа и мелиоидоза опасных инфекционных заболеваний, эндемичные очаги которых имеются на сопредельных с Российской Федерацией территориях (Монголия, Иран, Китай, Турция) (Howe С, SampathA, Spotnitz М, 1971; MaggeH.R. et al 1967). Оба вида обладают выраженными патогенными свойствами для человека и животных.
Патогенные буркхольдерии (возбудители сапа и мелиоидоза), вызывают тяжелые инфекционные заболевания человека и многих видов животных и относятся к потенциальным агентам биотерроризма, как возбудители особо опасных инфекций. Плановых лабораторных исследований, направленных на выявление данных возбудителей в нашей стране практически не проводится. Диагностические препараты (как иммунологические, так и генетические) имеются на разных фазах разработок только в специализированных научно-исследовательских учреждениях и фактически не доступны для практических медицинских и ветеринарных лабораторий, в которых автоматические системы идентификации из-за своей дороговизны также отсутствуют. Учитывая высокую патогенность данных микроорганизмов для человека и многих видов животных, многообразие клинических форм заболеваний, отсутствие средств
\ оэ mffao/rS I
"**' і ті»
специфической профилактики и недостаточную эффективность химиотерапии, очевидна актуальность разработки и совершенствования схем идентификации возбудителей мелиоидоза и сапа - Burkholderiapseudomallei и B.mallei.
Представленные в диссертации материалы получены в ходе выполнения в ВолгНИПЧИ плановой государственной тематики по лабораторной диагностике и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, в частности тем№ 2-027 -98 и №084-3 -01.
Цель работы - изучение культуральных, биохимических и патогенных свойств культур B.pseudomallei, B.mallei, В.серааа и B.thailandensis для выявления набора тестов имеющих значение в разработке дифференциальных схем идентификации.
Задачи исследования
-
Оценить значимость различных идентификационных тестов, применяемых при дифференциальной диагностике буркхольдерий.
-
Изучить вирулентность штаммов буркхольдерий, филогенетически расположенных в системе сапрофит {В.cepacia, B.thailandensis), незавершенный паразит {B.pseudomallei), паразит {B.mallei).
-
Сопоставить резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам, красителям и детергентам.
-
Изучить различия по отдельным углеводородам, используемым различными видами буркхольдерий в качестве источника углерода и энергии.
-
Разработать схемы идентификации буркхольдерий, имеющих медицинское значеннєва различных таксономических уровнях (род, вид, биовар).
Научная новизна
Охарактеризованы гено — и фенотипические свойства буркхольдерий, необходимые для разработки диагностических и профилактических средств, а
также для расшифровки механизмов реализации патогенности возбудителей сапа и мелиоидоза
Впервые в основу разработки схемы идентификации патогенных
буркхольдерий заложены принципы полифазной. таксономии,
предусматривающие сочетанное применение генетических, биохимических, иммунологических методик при окончательном определении таксономической позиции изучаемого штамма.
Выявлены наборы основных дифференциальных тестов фенотипических свойств буркхольдерий, позволившие составить диагностические ключи для определения рода, вида и биоваров идентифицируемых культур возбудителей сапа мелиоидоза и близкородственных им буркхольдерий.
Впервые в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза для учебных целей (курсы бактериологов, учения по индикации возбудителей ООИ) вместо убитых клеток B.pseudomallei предложена живая культура гетерологичного непатогенного вида B.thailandensis, имеющего высокую степень идентичности биохимических культуральных и антигенных свойств с возбудителем мелиоидоза.
Практическая значимость
Определены наборы идентификационных признаков различных видов буркхольдерий, позволяющие создать практические схемы их дифференциальной диагностики, пригодные для микробиологических лабораторий.
Написаны "Методические рекомендации по постановке диагностических тестов, необходимых для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)", утвержденные директором института д.м.н. Алексеевым В.В. 25. 06. 2003 г, протокол № 6.
Материалы настоящего исследования использованы при написании глав "Практического пособия для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму", утвержденного Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора РФ С.И.Ивановым 06.11.03.
Штамм Burkholderia thailandensis В-9 депонирован в Саратовском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», как. B.thailandensis КМ 161 с формулировкой: перспективный в качестве учебного штамма-имитатора возбудителя мелиоидоза. Документация на оформление патента на этот штамм отправлена в Российское агентство по патентам «и товарным знакам. «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM - 161 авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза»: заявка № 2004112706 от 26.04.04.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Предложенная схема идентификации буркхольдерий, имеющих значение в
медицинской практике, позволяет на основе известных лабораторных тестов
определить принадлежность культур к видам, входящим в группы
pseudomallei и cepacia.
-
Степень идентичности' В.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis в биохимических, иммунологических и генетических диагностических тестах позволяет считать их биоварами одного вида, целесообразность сохранения их видового статуса в медицинской микробиологии определяется практическими (эпидемиологическими) задачами.
-
Идентификацию буркхольдерий с помощью автоматических тест- систем и упрощенных диагностических ключей на заключительном этапе необходимо дополнять набором специфических для каждого вида тестов, включающих определение вирулентности, антибиотикограмму, постановку
иммунологических и генотипических тестов, чтобы соответствовать основным положениям полифазнойтаксономии.
-
Принадлежность к особо опасным видам (В.mallei и B.pseudomallei), предопределяет целесообразность на ранних этапах проведение ускоренных идентификационных иммунологических и генетических методик (РА, МФА, ПЦР) с последующим подтверждением диагноза стандартными бактериологическими методами.
-
Штаммы B.thailandensis по своим биохимическим и антигенным свойствам, учитывая их непатогенность, могут быть рекомендованы как имитаторы возбудителя мелиоидоза при проведении учений и занятий по диагностике и индикации ООИ.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены на научных институтских конференциях ВожНИПЧИ в 2001 и 2002 гг., а также представлены на 4-ой интернациональной конференции по "Emerging zoonoses" (Ames, Iowa, USA, September 18-21,2003).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Объем и структура диссертации
Инфекции, вызываемые буркхольдериями
Выделенные в 1992 году в самостоятельный род Burkholderia псевдомонады, относящиеся ранее ко 2-ой группе ДНК - рРНК - гомологии, включают в настоящее время около 28 видов, большинство из которых являются сапрофи-тами или фитопатогенами. [87, 109, 184]. Они относятся к большой группе микроорганизмов, характеризующихся рядом общих признаков. Это грамотрица-тельные, одноклеточные, прямые или изогнутые бактерии размером 0,5 - 1,0 х 1,5 - 5,0 мкм, подвижные (за исключением В.mallei) за счет одного или нескольких полярных жгутиков, у некоторых видов жгутик может быть расположен латерально или быть меньшей длины. Содержание ГЦ пар в составе ДНК варьирует в пределах 65 - 70 моль%. Бактерии не образуют спор. Они аэробы с окислительным неферментативным типом дыхания. Обычно оксидазо— и ката-лазопозитивные, не способны использовать одноуглеродные органические соединения в качестве единственного источника углерода и энергии, относятся к хемоорганотрофам.
Из всех видов буркхольдерий только 4 вида — B.mallei, B.pseudomallei, B.thailandensis и В.серасіа имеют значение для медицинской практики. Особое внимание среди них уделяают В. mallei и B.pseudomallei, возбудителям особо опасных инфекционных заболеваний - сапа и мелиоидоза, эндемичные очаги которых имеются на сопредельных с Российской Федерацией территориях. Для России сап и мелиоидоз не являются эндемичными заболеваниями и относятся к числу «экзотических инфекций», но расширение транспортных связей с различными странами, в которых регистрируются случаи сапа и мелиоидоза, не исключают заноса данных инфекций на территорию России. Возбудители сапа и мелиоидоза относятся к потенциальным агентам биотерроризма, как возбудители ООИ [59, 137, 159]. В.серасіа и B.thailandensis — бактерии, генетически и фенотипически близкие к возбудителям сапа и мелиоидоза, но при этом не патогенные для человека и животных. Однаком В.cepacia вызывает оппортунистические заболевания у больных с иммунодефицитными состояниями, данных о выделении B.thailandensis от больных людей не имеется.
Мелиоидоз - эндемичное для ряда стран влажных субтропиков инфекционное заболевание людей и животных, вызываемое B.pseudomallei. Это единственное заболевание, распространение которого в природе имеет определенные географические границы. Впервые само заболевание, а впоследствие и свойства его возбудителя были описаны в 1912 году в Бирме английским патологом A.Whitmore [180], поэтому эта инфекция в отдельных зарубежных публикациях до сих пор именуется болезнью Уитмора. Окончательное наименование - мелиоидоз (сапоподобное заболевание) - было дано в 1921г A.Stanton и A.W.Fletcher [40, 151], хотя таксономическое положение возбудителя постоянно изменялось. До 60-х годов XX века в литературе утвердилось представление о мелиоидозе, как о фатальном заболевании, приводящем к летальному исходу даже в условиях клиник 95% заболевших. В последующем стало ясно, что более легкие формы тогда не регистрировались, а эффективные антибиотики еще не были открыты. Однако мелиоидоз остался в списке особо опасных инфекций. Этому способствовали послевоенные публикации с сообщениями из Форт-Детрика и Окленда. В них показана способность возбудителя мелиоидоза, довольно быстро повышать свою вирулентность при пассажах и пробивать иммунитет при аэрозольном методе заражения животных [10,24,44,138,148].
До начала семидесятых годов существовало твердое убеждение, что мелиоидоз эндемичен лишь для влажных субтропиков стран Юго-Восточной Азии. Регистрация единичных случаев в Австралии, странах Южной Америки и Западной Африки рассматривалась как следствие пребывания людей на эндемичных территориях или импорта инфицированных животных [40, 105, 128, 171]. Но в 70-х годах произошло существенное изменение точки зрения на географию и эпидемиологию этой инфекции. Заболевание мелиоидозом людей и животных и выделение культур B.pseudomallei из внешней среды в Австралии, Чили, Сальвадоре, Франции, Италии и других странах показали всю серьезность проблемы диагностики, лечения при почти непредсказуемых последствиях завоза воздудителя в страны с умеренным климатом [37, 136, 176, 188].
Существенно изменилось отношение к мелиоидозу ив странах с эндемичными районами. Так, в Австралии, Сальвадоре, Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом [73, 74, 128]. А обширные исследования, проведенные в Таиланде местными врачами совместно с японскими и английскими специалистами, показали ошибочность мнения об относительной уникальности этой патологии для эндемичных стран. Речь идет всего лишь о недостаточном количестве средств диагностики, общем низком уровне медицинского обслуживания и отсутствии должной настороженности у медработников [136, 171, 172]. До начала работы по специальной программе в Таиланде за все предыдущее время было зарегистрировано всего трое больных с мелиоидо-зом, а при интенсивном обследовании только за один 1986 год выявили более 800 бактериологически и серологически подтвержденных случаев этого заболевания. Показано, что основной причиной нескольких десятков так называемого «неожиданного необъяснимого смертельного синдрома» также является мелио-идоз [186, 187]. Принципиально важное значение имеют публикации по особенностям формирования вторичных очагов мелиоидоза во Франции (Париж), связанных с завозом в зоопарк больной лошади Пржевальского [99, 101, 136].
Не вызывает сомнения, что существенное увеличение числа регистрируемых в разных странах случаев мелиоидоза связано не столько с расширением ареала распространения этой инфекции в мире, сколько с хорошо налаженной в развитых странах бактериологической службой, располагающей компьютерными системами диагностики. Именно это привело к тому, что практически во всех странах Западной Европы, включая Скандинавию, за последние годы за 15 регистрированы случаи мелиоидоза среди лиц, побывавших в качестве туристов или специалистов в эндемичных зонах [67, 77, 175].
Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
Иммунологические диагностические исследования проведены по стандартным методам, адаптированным к условиям работы с патогенными бурк-хольдериями [23, 24]. В работе использовали стандартную агглютинирующую сыворотку («Difco», USA Pseudomonas pseudomallei antiserum) и агглютинирующую сыворотку, полученную в лаборатории при иммунизации кроликов живой культурой B.pseudomallei VPA [1].
Для реакции преципитации использовали преципитирующие экспериментальные серии, приготовленные при иммунизации кроликов с использованием полного адьюванта Фрейнда по следующей методике. Для иммунизации лабораторных животных применяли высушенные ацетоном микробные клетки. Для этого культуру засевали во флаконы с мясо-пептонным бульоном, инкубировали при 37С 24 ч. Затем бульонной культурой засевали матрацы с МПА с добавлением 4% глицерина и выращивали при 37С 48 ч. Выращенную культуру смывали при помощи шпателя 0,9% NaCl раствором рН 7,2 и переносили в термостойкую колбу. К этой суспензии добавляли 3 объема охлажденного до -30С ацетона при постоянном перемешивании. Полученную взвесь бактериальной массы в ацетоне выдерживали при +4С до прохождения контроля стерильности. Затем клетки осаждали на центрифуге ОМТ-8 в течение 25 мин при 8000g. Бакмассу высушивали и растирали в фарфоровой ступке. Полученный порошок помещали в пробирки и хранили при +4С. Суспензию сухих клеток в концентрации 20 мг/мл в физиологическом растворе подвергали воздействию ультразвука мощностью 100Вт, частоте 20000Гц. Всего проводили 5 циклов (1мин воздействия ультразвука, 3 мин - охлаждение).
Сыворотки получали в результате иммунизации кроликов массой 2 - 3 кг в возрасте до двух лет в два цикла. Каждый цикл включал в себя по 4 внутри-кожных паравертебральных иньекций в месяц по 0,1мл антигена в 8 точек каждая. Интервал между иньекциями 7 сут, между циклами 30 сут. Антигены готовили на 0,15М растворе NaCl с добавлением полного адьюванта Фрейнда ("Difco", USA) в соотношении 1:1 в общем объеме 1мл с нагрузкой антигена 1мг на одну суммарную инъекцию. В работе использовали сыворотки, имеющие в РДЦ титры не ниже 1:32, а в РА -1:1600.
Реакцию двойной иммунодиффузии в геле (РДЦ) выполняли в 1% Agar Purified ("Difco", USA) на 0,9% NaCl с добавлением мертиолата натрия 1:10000. Толщина гелевого слоя составляла 3 мм; диаметр лунок и расстояние между ними - 5 мм (метод Оухтерлони).
Для МФА (метод флуоресцирующих антител) использовали иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные адсорбированные (серия С-19, рабочее разведение 1:32). Мазки-препараты готовили из взвесей с концентрацией 5х108м.к./мл по стандарту мутности. При НМФА (непрямой метод флуоресцирующих антител) использовали антивидовой коньюгат флуоресцирующих антител против иммуноглобулинов кролика - коммерческий препарат производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и сыворотку кроличью против антигенов В.cepacia 25416, титр антител в РДД 1:32, приготовленную в лаборатории сапа и мелиоидоза, описанным выше методом. Постановка реакции и учет результатов проведен по стандартным методам [28, 49, 51].
Активность антибактериальных препаратов определяли двумя способами - методом кратных разведений в жидкой питательной среде и методом диффузии в агар (метод дисков) [42].
Результат учитывали после инкубации при 37С в течение 48 ч, определяя наличие или отсутствие роста микробов в среде, содержащей различные разведения антибиотиков. Последняя пробирка с задержкой роста — прозрачный бульон соответствует минимальной подавляющей концентрации (МІЖ) антибиотика в отношении испытуемого штамма и указывает на степень его чувствительности. Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из пробирок с отсутствием видимого роста производили посев на агар Antibiotic medium 2. Через 48 ч инкубации при 37С отмечали наименьшую концентрацию антибиотика в пробирке, посев из которой не дал роста на чашке с агаром, и принимали ее за МБК.
При определении активности антибактериальных препаратов вторым методом (метод дисков), на поверхность агара Antibiotic medium 2, засеянного испытуемыми микробами, помещали диски, пропитанные антибиотиками. Результат учитывали путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска через 24 — 48 ч инкубации при 37С. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска говорит о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибиотику. Если диаметр зоны задержки роста бактерий превышает величину, указанную в проспектах к фирменным дискам, то штамм оценивается, как чувствительный к данному антибиотику.
Антибактериальную активность препаратов, не относящихся к химиоте-рапевтическим средствам (красители, спирты, детергенты и т.п.), оценивали только первым методом (кратных разведений).
Инфицирование и иммунизация животных. Бактериальную суспензию суточной культуры исследуемых штаммов вводили в объеме 0,5 мл 0,85% NaCl подкожно в паховую зону бедра. Вирулентность культур изучали на золотистых хомячках и морских свинках. LD5o рассчитывали по Керберу [5]. Иммуно-генность — только на морских свинках. Заражающую дозу вводили через 28 дней после иммунизации. Доза заражения 200 LDso культуры вирулентного штамма B.pseudomallei 100. Результаты опыта оценивали через 60 дней с учетом данных аутопсии выживших лабораторных животных. Оценка достоверности различий выживаемости между иммунизированными и контрольными группами животных проведена по методу Фишера [5].
Сравнительное изучение роста буркхольдерий на питательных и селективных средах
В диагностических иммунологических реакциях (РА, РДД, МФА) с использованием сывороток (иммуноглобулинов) как к B.pseudomallei, так к к В. thailandensis выявлен высокий уровень родства антигенных структур этих микроорганизмов. Все культуры B.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis агглютинировались мелиоидозной сывороткой в диагностических титрах (1:200), из 10 штаммов В.cepacia только культура 8235 в РА имела титр 1:40, остальные давали отрицательный результат.
Высокая степень родства изученных буркхольдерий подчеркивается наличием множественных общих преципитатов в РДД, проявляющихся при использовании сывороток, полученных к ультразвуковым лизатам ацетоновых клеток как B.pseudomallei, так и B.cepacia (рис. 3.6. и рис. 3,7.). С одной стороны это свидетельствует о высокой степени родства видов семейства Burkholderiaceae, являющихся в отличие от псевдомонад монофилетической таксономической группой [109], с другой стороны это предопределяет сложности разработки видоспецифических диагностикумов. Особенно это проявляется внутри групп близкородственных видов. Так применяемая на этапах идентификации [101, 104, 105, 134] мелиоидозная агглютинирующая сыворотка не позволяет дифференцировать буркхольдерий близкородственных видов (B.mallei и B.thailandensis) и имеет поэтому только ориентировочную ценность при отборе подозрительных колоний. Дальнейшая идентификация культур до вида требует постановки ряда дополнительных тестов.
Еще более сложная трактовка серологических исследований в группе ге-номоваров В.cepacia, четко различающихся на уровне ДНК-ДНК гибридизации, но не имеющих при этом корреляции с антигенной структурой отдельных видов (геномоваров), что показывает отсутствие связи между геномоварами и фа-го - и серотипами штаммов B.cepacia [129].
Различия в О-агглютинации могут быть использованы при эпидемиологических исследованиях (табл.3.7. и табл.3.8.). Так среди штаммов В.pseudomallei выделяют 2 серовара (азиатский и австралийский), а штаммы B.cepacia подразделяют, по меньшей мере, на 12 сероваров. Однако, учитывая отсутствие видовой специфичности, в эти серовары входят штаммы различных близкородственных видов в обеих группах буркхольдерий (pseudomallei и cepacia).
Как известно, МФА входит в число наиболее распространенных методов экспресс-диагностики и индикации опасных инфекционных заболеваний, так как он позволяет с высокой степенью уровня специфичности и чувствительности определять вид возбудителя в материале от больных и из внешней среды задолго до выделения его в чистой культуре [28, 51]. В наших опытах использовались как прямой, так и непрямой методы.
При использовании в опытах мелиоидозных диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов, все исследумые штаммы В.pseudomallei и В.mallei, выявлялись в МФА при использовании препарата в рабочих титрах (1:256), штаммы B.thailandensis выявлялись только при использовании иммуноглобулинов в разведении в 3-4 раза меньшем (1:32 - 1:64), штаммы гетерологичных культур, в том числе и B.cepacia, этим препаратом не выявлялись.
В случае использования МФА для выявления культур B.cepacia (табл.3.9.) видно, что уровень свечения различных штаммов в непрямом методе варьирует в широком диапазоне. Причем, если даже принять за рабочий титр разведение 1:800, то выпадают 2 штамма В.серасіа, а титр сыворотки, дающий положительную реакцию с гетерологичными культурами, отличается всего на 1-2 разведения. Более ценные диагностические результаты получаются в прямом методе, в котором отчетливо отсекаются гетерологичные виды. Что же касается отрицательных результатов с 3 штаммами В.серасіа, то следует отметить, что штамм 8239, как уже отмечалось ранее, вообще не может быть отнесен к видам группы В.серасіа по своему фенотипу, а штаммы 1934 и 8236 требуют более глубокого исследования их антигенной структуры. Нельзя не учитывать широкое варьирование антигенного набора в комплексе геномоваров В.серасіа [129]. Постановка опытов по МФА и получение коньюгатов проведены на базе отдела иммунологии, зав. отделом д.м.н. Н.П. Храпова.
Примечание: в таблице приводятся минимальные разведения сыворотки, обеспечивающие получение положительного результата НМФА; в колонке МФА с иммуноглобулинами флуоресцирующими к Я. cepacia знаком (+) обозначено наличие свечения в интервале 3+ или 4+ при использовании рабочего разведения коньюгата (1:16), знаком (-) обозначены результаты с отсутствием специфического свечения с этим разведением
При сопоставлении резистентности буркхольдерий к красителям, детергентам и другим антисептикам, применяемым в микробиологии, обращает на себя внимание, что практически во всех случаях наименьший уровень МПК ! среди буркхольдерий отмечается для культур B.malleU а наивысший - для Вхерасіа. Особенно контрастны соотношения этих показателей (более чем на 5 разведений) в случаях дезоксихолата натрия, цетримида, метилового синего, фуксина основного, тимолового синего (табл. 3.10.).
Результаты опытов с гетерологичными видами грамотрицательных микроорганизмов, проведенные только на одном штамме, приведены в качестве не столько сравнения между различными видами, сколько в виде контроля адекватности метода постановки, учитывая более высокую степень изученности этих видов в медицинской литературе.
Резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам и разного рода ингибиторам
Столь же важна интерпретация генетических исследований и для таксономии возбудителей сапа и мелиоидоза. Так уже в первой основополагающей наименование рода Burkholderia статье EYabuuchi et al [184], при обосновании выделения 7 видов псевдомонад в самостоятельный род Burkholderia, подчер I кивается, что при ДНК-ДНК гибридизации и секвенировании 16S рРНК различия между В.mallei и B.pseudomallei не выявляются. Если ранее на основе сопоставления фенотипа возбудитель сапа предлагали считать биоваром B.pseudomallei [21, 156], то на основании мультилокусного сиквенс-типирования [112] вообще пришли к выводу, что B.mallei является лишь клоном B.pseudomallei и не может иметь статус самостоятельного вида. Понятно, что подобное утверждение не может быть приемлемым с позиций эпидемиологии и экологии, к тому же фенотип этих возбудителей, имеет четкие дифференциальные тесты (подвижность, устойчивость к температуре и антибиотикам).
Смена таксономической основы в классификации бактерий существенно отразилась и на Вхерасіа. Если к 70-м годам в один вид были объединены сходные по фенотипическим свойствам P.cepacia, P.multivorans и PMngii выделяемые ранее в отдельные виды по экологической нише обитания [111, 151]. В 90-е годы по данным методик молекулярного исследования нуклеиновых кислот штаммы B.cepacia были разделены на 9 геномоваров, 6 из которых приобрели собственные видовые обозначения, тем не менее, в таксономических исследованиях объединенные в суправидовой таксон Вхерасіа complex [113, 118, 152, 173].
В практических лабораториях, даже хорошо оснащенных современной техникой, в настоящее время выделение и идентификация В.cepacia имеет труднопреодолимые проблемы - фактически нет общепризнанного "золотого стандарта" [152]. Генетические методы (ПЦР, РАПД, ДНК-ДНК гибридизация и др.) довольно трудоемки и пока неприменимы для практических целей, к тому же имеются проблемы с определением специфичности отдельных геномоваров, например I, III, IV и VII - геномовары не различаются при анализе 16S рРНК в РФЛП [118], а в системе API 20 NE B.cepacia, B.stabilis и B.fungorum не различаются по своему нумерическому профилю. В конечном счете, на сегодняшний день для проведения относительно достоверной идентификации представителей группы В.cepacia рекомендуется поэтапно делать посев на селективную среду, идентификацию в системе типа APL 20NE и для окончательного подтверждения вида (геномовара) проводить ПЦР с последующим анализом рибо-сомальных фрагментов в РФЛП [152].
Сложности идентификации B.cepacia с использованием автоматических систем связаны, как с недостоверностью отличий с рядом гетерологичных видов {S.maltophilia, B.gladioli, Ralstonia spp.), так и с отсутствием в ряде случаев достоверных критериев различий, между вновь обозначенными видами В. cepacia complex, что вполне объяснимо, учитывая, что системы API ведут свою историю с 1975 г и с тех пор добавляется только список кодов идентифицируемых видов, стремительно увеличивающийся с каждым годом [126, 158, 174].
Распространенные в западных странах системы АРІ в практике работы баклабораторий РФ не имеют реального внедрения прежде всего в силу дороговизны, кроме того, в случае работы с ООИ, к которым относятся возбудители сапа и мелиоидоза, эти системы весьма опасны с позиций соблюдения режима работы (очень трудно исключить контаминацию поверхности пластин, особенно при снятии предохранительной пленки).
Принципиальным является также тот момент, что и при наличии этих систем для окончательной идентификации культур, подозрительных на патогенные буркхольдерии, требуется постановка дополнительных тестов. Поэтому в лабораторной диагностике буркхольдерии по-прежнему используются идентификационные ключи [53, 66, 70, 131], которые составлены из стандартных тестов, характеризующих видовые особенности по альтернативным признакам. Особенно для дихотомических ключей имеют значение признаки, присущие или отсутствующие у подавляющего большинства, данного вида. Собственно из таких признаков и состоит принцип первичного группирования исследуемых культур буркхольдерии, которые относятся к глюкозу неферментирующим, ок-сидазоположительным, грамотрицательным бактериям. При дальнейшей дифференциации этих культур принципиальное значение имеет изучение пигмен-тообразования (исключение флуоресцирующих псевдомонад), рост на минимальной среде (прототрофность), наличие декарбоксилаз, рост при 4С и при 42С, устойчивость к 2,5% NaCl и полимиксину, определение р- галактозидазы. Культуры, идентифицированные по ключевым видовым признакам, в дальнейшем в случае принадлежности их к группе pseudomallei необходимо исследо-эать на патогенность для биопробных животных (лучшей моделью является золотистый хомячок).
Серологические методы в идентификации буркхольдерии имеют безусловное значение в общем комплексе дифференциальных признаков. К сожалению, в РФ не выпускаются стандартные (производственные) видоспецифиче-ские сыворотки ни для одного вида буркхольдерии. В свое время мелиоидозные сыворотки для реакции агглютинации выпускали фирмы "Difco" и "Institut Pasteur Production". Эти препараты с успехом использовались при исследовании культур, выделяемых в эндемичных по заболеванию регионах из материала от больных или из селективных сред при обследовании проб внешней среды.
В условиях специализированных лабораторий для постановки диагностических иммунологических реакций используют собственные антисыворотки, полученные к антигенным комплексам референтных штаммов. По понятным причинам подобные сыворотки содержат комплекс иммуноглобулинов, как ви j доспецифических, так и минорных, перекрестнореагирующих. Поэтому при учете реакции преципитации по характеру общих линий с референтной культурой можно давать лишь ориентировочную оценку степени родства изучаемого штамма, так как могут выявляться так называемые общие антигены, в виде единичных, минорных преципитатов [14, 47]. Учитывая, что результаты в РДЦ и РА имеют в общей схеме идентификации характер дополнительных тестов, интерпретация результатов в этих реакциях происходит только по характеру общих преципитатов с референтным штаммом и общая оценка может носить только предварительный характер. При этом отрицательный результат имеет больший диагностический вес, а положительный указывает на необходимость дополнительных исследований.
