Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 2. Обзор литературы 20
ГЛАВА 2.1. Ядерные топливные циклы 20
2.1.1. Типы ядерных топливных циклов 22
2.1.2. Преимущества и недостатки различных вариантов ЯТЦ 23
2.1.3. ЯТЦ в разных странах 26
2.1.4. Состав типичных отходов 29
ГЛАВА 2.2. Свойства исследованных радионуклидов и тяжелых металлов
2.2.1. Технеций 34
2.2.2. Уран 44
2.2.3. Плутоний 46
2.2.4. Хром 49
ГЛАВА 2.3. Взаимодействие микроорганизмов с долгоживущими радионуклидами
2.3.1.Взаимодействие с актинидами
2.3.2. Взаимодействие технеция с микроорганизмами
ГЛАВА 2.4. Микроорганизмы-редукторы металлов, металлоидов и радионуклидов - современное состояние вопроса
ЧАСТЬ 3. Экспериментальная часть 66
ГЛАВА 3.1. Материалы и методы 66
ГЛАВА 3.2. Сорбция радионуклидов в нейтральных условиях
ГЛАВА 3.3. Восстановление технеция сульфатредуцирующими бактериями в нейтральных условиях
3.3.1. Анаэробная ассоциация сульфатредуцирующих бактерий 81
3.3.2. Удаление технеция из буферных растворов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий
3.3.3. Удаление технеция из раствора иммобилизованной биомассой сульфатредуцирующих бактерий
ГЛАВА 3.4. Восстановление семивалентного технеция в кислых условиях среды
3.4.1. Удаление пертехнетата из раствора при росте A.ferrooxidans 88
3.4.2. Рост ацидитиобацилл с использованием элементной серы и 90 пертехнетата
3.4.3. Резистентность тиобацилл к технецию на примере 91
A, ferrooxidans
ГЛАВА 3.5. Восстановление технеция в щелочных условиях 94
3.5.1. Исследование восстановления пертехнетата в щелочных 97 условиях оптическим и хроматографическим методами
3.5.2. Возможные доноры электронов и токсическое действие технеция на процесс восстановления пертехнетата в щелочных условиях
ГЛАВА 3.6. Восстановление хромата в щелочных условиях 105
ГЛАВА 3.7. Восстановление шестивалентного урана в нейтральных условиях термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens
3.7.1. Восстановление шестивалентного урана термофильной бактерией при использовании различных источников углерода
3.7.2. Рост термофильной бактерии при различных концентрациях урана
3.7.3. Динамика бактериального роста и восстановления шестивалентного урана
3.7.4. Анализ осадков, содержащих уран, до и после восстановления термофильной бактерией Thermoterrabacterium ferrireducens
ГЛАВА 3.8. Влияние микроорганизмов, обитающих в пресных водоемах, на технеций и некоторые трансурановые элементы в случае их попадания в водоем
3.8.1. Удаление радионуклидов илами пресноводных озер 138
3.8.2. Детекция зонального распределения радионуклидов между илами и водной фазой пресноводных озер на примере плутония-238
ГЛАВА 3.9. Токсическое воздействие двухвалентных катионов тяжелых металлов и шестивалентных анионов металлов и радионуклидов на микроорганизмы
3.9.1. Общая характеристика сайта 147
3.9.2. Выделение аэробных микроорганизмов из зараженных почв и характеристика их устойчивости к металлам и радионуклидам
3.9.3. Устойчивость изолятов к никелю и урану 153
ГЛАВА 3.10. Возможные механизмы адаптации микроорганизмов к высоким концентрациям тяжелых металлов
Заключение 165
Выводы 170
Литература
- Преимущества и недостатки различных вариантов ЯТЦ
- Удаление технеция из буферных растворов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий
- Восстановление шестивалентного урана термофильной бактерией при использовании различных источников углерода
- Выделение аэробных микроорганизмов из зараженных почв и характеристика их устойчивости к металлам и радионуклидам
Введение к работе
Актуальность.
Загрязнение окружающей среды токсичными веществами, такими как тяжелые
металлы и радионуклиды, в настоящее время представляет острую проблему для биосферы. Радиоактивные отходы попадают в окружающую среду в ходе переработки продуктов ядерного цикла, медицинских исследований и техногенных аварий типа Чернобыльской (1986) (Balonov, 2003) или Фукусимской (в Японии, 2011 г.) (Bolsunovsky, Dementyev, 2011). В связи с этим необходимы разработка и внедрение процессов, обеспечивающих безопасность окружающей среды и переработку ядерных отходов для дальнейшего развития ядерного топливного цикла. К настоящему времени накоплен значительный материал о биотехнологических методах очистки растворов, содержащих уран, стронций, цезий и йод (Macaskie, 1991), как наиболее экономически выгодных и экологически безопасных. Поэтому микробная трансформация тяжелых металлов и радионуклидов является предметом повышенного внимания многих научных коллективов. Результаты исследований в этой области могут быть востребованы для теории и практики радиохимии, послужат основой новых биотехнологических систем очистки природных объектов и промышленных отходов от тяжелых металлов и радионуклидов.
Современные биотехнологии ориентированы на уменьшение, уничтожение или безопасное хранение отходов. В основе этих технологий лежит широко известная способность микроорганизмов и, в меньшей степени, растений, трансформировать и разлагать практически все химические соединения. Эти процессы многообразны и зависят от физико-химических условий среды, природы загрязнителя, состава микробных сообществ и биоценозов. Биологическая очистка основана на процессах, происходящих в природе, и технологически может быть существенно ускорена внесением специализированных микроорганизмов, добавлением питательных веществ для их развития или соединений, снижающих токсичность металлов и т.д. (NABIR, 2002).
Взаимодействие микроорганизмов и металлов представляет собой сложный комплекс различных по природе процессов и включает: 1) адсорбцию металлов на клеточной поверхности; 2) комплексообразование с компонентами клеточных оболочек; 3) внутриклеточную аккумуляцию металлов; 4) окисление или восстановление металлов; 5) трансформацию, в частности, путем метилирования или 6) образование комплексов с неорганическими лигандами и осаждение комплексов;
7) связывание металлов с экзополимерами. При этом, некоторые типы взаимодействия могут иметь место в случае как мертвых, так и живых клеток, тогда как для других – необходимы активно метаболизирующие микроорганизмы (Macaskie, 1991).
Данная диссертационная работа сфокусирована главным образом на изучении трансформации и иммобилизации различными микроорганизмами таких долгоживущих радионуклидов, как технеций, нептуний, плутоний, америций, кюрий и некоторых других. Период полураспада перечисленных радионуклидов составляет более 105 лет, поэтому разработка теоретических основ очистки окружающей среды от таких опасных загрязнителей является приоритетным направлением. В отличие от большинства работ, где рассматривается обычно только один тип преобразования элементов (Lloyd et al., 1996), наши исследования охватывают как процессы сорбции, так и окислительно-восстановительные процессы, а также их комбинации в природных условиях. Приближаясь к природным системам, мы изучали трансформационные процессы взаимодействия микроорганизмов и металлов/радионуклидов как в стандартных нейтральных условиях, так и при экстремальных (кислых и щелочных) значениях рН среды.
Целью работы было исследовать в широком диапазоне экологических факторов бактериальную трансформацию растворимых форм радионуклидов и тяжелых металлов в нерастворимые, а также биоаккумуляцию микроорганизмами этих загрязнителей для уменьшения их объема.
Основные задачи исследования.
-
Определить способность микроорганизмов различных физиологических групп сорбировать и трансформировать растворимые формы радиоактивных элементов.
-
Исследовать процессы бактериального восстановления технеция (Tc(VII)), хрома (Cr(VI)) и урана (U(VI)), используемых в качестве конечных акцепторов электронов в энергетическом метаболизме бактерий для целей их детоксификации в широком диапазоне значений рН среды.
-
Определить основные продукты бактериальной трансформации радионуклидов и токсичных элементов, образующихся в кислых, нейтральных и щелочных условиях среды.
-
Исследовать иммобилизацию технеция и некоторых трансурановых элементов (Np, Pu, Am, Cm) микробными сообществами илов пресных водоемов.
-
Выяснить возможности снижения токсического воздействия тяжелых металлов и радионуклидов на почвенную микробиоту.
Научная новизна работы.
Показано, что микроорганизмы различных таксономических групп способны сорбировать и трансформировать трансурановые элементы и тяжелые металлы, что обусловливает важную роль микробиоты в процессах самоочистки природных объектов (почв, водоемов) от радиоактивных загрязнений.
Выявлены принципиальные различия в биосорбции микробными клетками элементов с постоянной и переменной валентностью (катионы металлов и включающие их анионы кислотных групп).
Обнаружено существенное повышение трансформирующей (радионуклиды) активности микроорганизмов за счет сочетания их сорбционных свойств и способности восстанавливать ионы трансурановых элементов и металлов.
Впервые установлена способность восстанавливать пертехнетат (TcO4-) в анаэробных условиях в широком диапазоне рН:
-
сульфатредуцирующими бактериями Desulfovibrio desulfuricans в нейтральных условиях среды с образованием нерастворимого оксида TcO2;
-
ацидофильными тионовыми бактериями Acidithiobacillus ferrooxidans и A. thiooxidans в кислых условиях среды с образованием растворимых коллоидов, содержащих восстановленный технеций;
-
галоалкалофильными бактериями рода Halomonas в щелочных условиях среды с образованием растворимого комплекса TcIVO(OH)3(CO3)-, а также образованием трехвалентного технеция.
Впервые показано восстановление хромата в щелочных аэробных условиях галоалкалофильными бактериями рода Halomonas в ходе процесса его
детоксификации. Выделен и описан новый вид Halomonas chromatireducens sp. nov., обладающий этими свойствами.
Показана способность к энзиматическому восстановлению шестивалентного урана у ряда сульфат- и железоредуцирующих бактерий, которые использовали эти реакции для получения энергии. Впервые показано восстановление шестивалентного урана из твердой фазы термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens, использующей его в качестве акцептора электронов c образованием нерастворимого восстановленного соединения.
Выявлена доминирующая роль микробных сообществ анаэробных осадков пресноводных водоемов в удалении технеция и долгоживущих трансурановых элементов из водной толщи в придонные илы.
Продемонстрирована высокая устойчивость почвенных мицелиальных и немицелиальных актинобактерий к сочетанному токсическому действию радионуклидов, тяжелых металлов и химических токсикантов (три- и тетрахлорэтилена). В модельных экспериментах показана эффективность применения гидроксиапатита для снижения токсического воздействия на бактерии тяжелых металлов и радионуклидов.
Практическая ценность исследования.
Доказана и апробирована в лабораторных условиях эффективность использования для очистки растворов от радионуклидов микроорганизмов, обладающих высокой восстановительной активностью, обеспечивающей существенное увеличение сорбционной способности бактериальных клеток.
Для очистки (детоксификации) жидких радиоактивных отходов с низкой активностью разработана и испытана модельная лабораторная система, на основе иммобилизованных клеток сульфатредуцирующих бактерий, обладающих нитратредуктазной активностью. Система обеспечивала в проточном режиме полное удаление пертехнетата из раствора.
Из загрязненных радионуклидами почв выделены новые штаммы актиномицетов, устойчивых к высоким концентрациям двухвалентных катионов (никель, кобальт, кадмий) и шестивалентных анионов (уран и хром).
Полученные результаты могут быть использованы для разработки микробиологических методов очистки промышленных сточных вод, содержащих
технеций, хром, а также природных водоемов, загрязненных технецием и некоторыми трансурановыми элементами.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах: Russian Radiochemical Conference, Dubna, 16 – 23 September 1994; 5-th International Conference on Chemistry and migration behaviour of actinides and fission products in the Geosphere, MIGRATION'95, Saint-Malo, France, 10-15 September 1995; Annual Report of the Centre de Recherches Nucleaires, Strasbourg, France, 1996; Fourth International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe, 15-17 September 1998, Warsaw, Polland; EUROCONFERENCE: Bacterial-Metal/Radionuclide Interaction: Basic Research and Bioremediation, Rossendorf/Dresden, Germany, 2-4 December 1998; The second Japanese-Russian Seminar on Technetium, Shizuoka, Japan, Nov. 29 - Dec.2 1999; International Conference 29 Journets des Actinides. Luso, Portugal, 15-17 April 1999, Luso, Portugal; Migration'99, Seventh International Conference on the Chemistry and Migration Behavior of Actinides and fission Products in the Geosphere, Incline Village, Lake Tahoe, Nevada, USA, September 26-October 1, 1999; EPA/DOE/NSF/ONR Bioremediation Research Program Review, Bloomingdale, IL, USA, 3-5 November 1999; National American Society for Microbiology Meeting, Los Angeles, CA, USA, May 2000; 15th International Biohydrometallurgy Symposium (IBS 2003), September 14-19, Athens, Hellas. “Biohydrometallurgy: a sustainable technology in evolution”; 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (IBBS-13), 4-9 September 2005, Madrid, Spain; Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» Саратов, 14 – 16 сентября 2005; II Российская молодежная школа «Радиохимия-2006», 2-8 сентября 2006, Озерск; 6-я Российская конференция по радиохимии, 23-27 октября 2006, Дубна; Международный симпозиум по современной радиохимии «Радиохимия: достижения и перспективы» в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Москва, 23-28 сентября 2007 г; Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ – Улан-Батор, 5-16 сентября 2011; 7th International Symposium on Technetium and Rhenium, Moscow, July 4-8, 2011.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе 21 экспериментальная статья, 2 обзора и 27 тезисов и докладов конференций.
Структура диссертации
Преимущества и недостатки различных вариантов ЯТЦ
Все стадии функционирования ядерного топливно-энергетического комплекса, такие, как производство топлива для ядерных реакторов, подготовка его к использованию, сжигание топлива в реакторе, утилизация отработанного топлива, промежуточное хранение и т.п. вместе взятые составляют так называемый топливный цикл. Ядерный топливный цикл (ЯТЦ) - путь, по которому топливо попадает в ядерный реактор, и по которому его покидает. Помимо рассмотренного здесь пути урана, как топлива, есть и другой путь попадания урана в окружающую среду, как компонента ядерного оружия. Существует и третий путь урана, как источника оружейного плутония: уран — реактор — плутоний —» ядерный заряд — взрыв на полигоне или над вражеским объектом (или демонтаж). Мы, естественно, ограничимся рассмотрением первого пути - энергетический ЯТЦ, хотя изредка будем упоминать военные направления ЯТЦ, поскольку в развитых странах они - основные.
В зависимости от базового делящегося нуклида (или нуклидов), энергетика использует разные топливные циклы. Различают урановый, торий-урановый, уран-плутониевый и торий-плутониевый циклы (Электронный ресурс http://blogi.rosatom.ru/blograo/201 l/lO/chtoakoe-vadernvioplivnvi-сікІЛ. В настоящее время наибольшее распространение получил урановый цикл, который точнее называть уран-плутоний-нептуниевым ядерно-энергетическим топливным циклом, поскольку именно эти элементы (равно как некоторые другие важные трансплутониевые нуклиды и продукты деления) нарабатываются в реакторах на урановом топливе. Энергетический ядерный топливно-энергетический цикл подразделяется на два вида: открытый (разомкнутый), нацеленный на захоронение отработанного топлива и радиоактивных отходов, и закрытый (замкнутый), предусматривающий достаточно полную переработку отработанного топлива и других отходов предприятий ядерной индустрии с целью выделения ценных элементов (Рис. 1, 2). Для гражданских целей может быть использован как открытый, так и закрытый ЯТЦ, для военных целей ЯТЦ функционирует исключительно в замкнутом режиме.
Начальные этапы замкнутого и открытого ЯТЦ одинаковы, различия имеют место на заключительном этапе (Рис. 1, 2).
В ходе ЯТЦ происходит трансформация ядерного материала (урана и плутония). В установках и системах для конверсии урана может осуществляться одно или несколько превращений из одного химического изотопа урана в другой. Переработка - сложный химический процесс. ОЯТ разрезают на куски и погружают в азотную кислоту. После этого выделяют уран и плутоний, а остальные материалы (отходы) подвергаются дальнейшей обработке. В результате переработки появляются (Кройш и др., 2006): плутоний уран низко-, средне- и высокоактивные отходы радиоактивные выбросы в атмосферу и сбросы в водоёмы
Например, если подвергнуть переработке восемь отработавших урановых топливных элементов, то из полученных материалов можно сделать один МОКС-топливный элемент, что будет сопровождаться образованием огромного количества РАО (Кройш и др., 2006). 2.1.1. Типы ЯТЦ (Электронный ресурс - http://profbeckman.narod.ru/RHO,files/20 2.pdf) Замкнутый ядерный топливный цикл - ядерный топливный цикл, в котором отработавшее ядерное топливо, выгруженное из реактора, перерабатывается для извлечения урана и плутония для повторного изготовления ядерного топлива (Рис. 1).
Этапы замкнутого ЯТЦ включают выдержку отработанного ядерного топлива на территории АЭС в течение 3-Ю лет; временное контролируемое хранение отработанного ядерного топлива в автономных хранилищах при радиохимическом заводе (сроком до 40 лет), переработку ОЯТ с выделением из него отдельных (или суммы) делящихся нуклидов и продуктов деления, представляющих коммерческий интерес, отверждение и захоронение отходов (Рис. 1, Приложение 1).
Переработка отработанного ядерного топлива даёт определённые экономические выгоды, восстанавливая неиспользованный уран и вовлекая в энергетику наработанный плутоний. При этом уменьшается объем высокорадиоактивных и опасных отходов, которые необходимо надлежащим образом хранить, что также имеет определенную экономическую целесообразность. В отработанном ядерном топливе содержится примерно 1% плутония. Это очень хорошее ядерное топливо, которое не нуждается ни в каком процессе обогащения, оно может быть смешано с обедненным ураном и поставляться в виде свежих топливных сборок для загрузки в реакторы. Его можно использовать для загрузки и в реакторы - размножители (коверторы и бридеры). Однако необходимо отметить, что плутоний более радиоактивен, вдыхание менее 0,1 мг плутония смертельно (Кройш и др., 2006).
Разомкнутый ЯТЦ - В разомкнутом (открытом) ЯТЦ отработанное ядерное топливо считается высокоактивными радиоактивными отходами и вместе с остаточными делящимися изотопами исключается из дальнейшего использования - поступает на
Удаление технеция из буферных растворов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий
Первоначальные исследования почв велись в течение коротких периодов времени (часы) (Wildung et al., 1979), поэтому сорбция технеция, вероятно, связана с химическим взаимодействием с органическим веществом, а не с поглощением микрофлорой почв. В дальнейших исследованиях (более длительных по времени, сутки) почвенная микрофлора могла быть важным фактором в сорбции технеция. Показано (Wildung et al., 1986; Landa et al., 1977), что почвы богатые органикой с достаточно большим содержанием микрофлоры хорошо сорбируют технеций. Нагревание почвы или ее стерилизация значительно снижали сорбцию технеция - это говорит о влиянии живой микрофлоры на процесс сорбции пертехнетата почвами.
Восстановленные морские и пресноводные осадки с неопределенной микрофлорой и большим количеством органического вещества, так же как и почвы, хорошо сорбируют технеций (Schreiner et al., 1982; Masson et al., 1980; Milton et al., 1992; Assinder et al., 1993). Стерилизация осадков, как и в случае почв, ведет к значительному снижению сорбции технеция.
Установлено, что аэробные смешанные почвенные ассоциации микрорганизмов не оказывают воздействия на Тс04 (Henrot, 1989). В то же время смешанные анаэробные культуры аккумулировали пертехнетат, при этом фактор концентрирования составил от 50 до 600. В случае чистых культур сульфатвосстанавливающих бактерий этот фактор увеличивался у Desulfovibrio gigas - 7000, у Desulfovibrio vulgaris - 9300. Формы технеция в этом случае оказывались другие, нежели пертехнетат, и были ассоциированы с органикой. Эти результаты дают основание предполагать, что Tc(VII) может использоваться как акцептор электронов в анаэробном дыхании (Henrot, 1989; Lovley, 1993).
Показано, что Tc(VII) восстанавливался в стационарной фазе роста Moraxella и Planococcus sp., когда кислород в среде истощался (Pignolet et al., 1989).
Микрорганизмы по-разному относятся к наличию технеция в среде (Vandecasteele et al., 1981). Несерные пурпурные бактерии были чувствительны уже к концентрации технеция 1 мг/л, в то время как протококковая водоросль Chlorella выдерживала до 600 мг/л (Gearing et al., 1975).
Gamham с соавторами (1993) исследовали сорбцию технеция цианобактериями родов Synechocystis, Synechococcus, Anabaena и Oscillatoria. Из полученных данных следует, что цианобактерии сорбировали технеций. Было исследовано влияние различных факторов на сорбцию технеция: возрастание внешнего осмотического потенциала увеличивало аккумуляцию радионуклида. Катионы К , Cs , Mg , Са и Sr также оказывали положительное влияние на этот процесс. Кроме того, показано, что у некоторых цианобактерии происходило временное увеличение внутриклеточного уровня АТФ, а затем замедление жизнедеятельности. Аналогично, снижалась активность Bacillus subtilis в присутствии технеция (Gearing etal., 1975).
По данным Тихомирова с соавторами (1970) смешанная популяция фитопланктона сорбировала до 57% технеция (при начальной концентрации 20 мМ).
Технеций оказывал отрицательное влияние на азотфиксацию у Anabaena sp. (Pignolet, 1983), а замещение Mo в нитрогеназе Azotobacter chroococcum приводило к инактивации фермента (Vandecasteele et al., 1986). Необходимо отметить, что одним из способов удаления радиоактивного технеция из раствора и его иммобилизации, является микробное восстановление пертехнетата до четырехвалентных форм, которые обладают низкой растворимостью и хорошо сорбируются почвами и породами.
Показано, что при анаэробном росте Е.соїі в присутствии органического вещества происходит образование и накопление Тс-органических комплексов (Stalmans et al, 1986). Предполагается, что смесь анаэробных бактерий непосредственно восстанавливает Тс04", а не создает условия необходимые для восстановления технеция и его комплексообразования. В случае добавления Тс04 в среду после роста и удаления бактерий восстановление технеция не наблюдали, что подразумевает биологическую природу этого процесса. По-видимому пертехнетат-ион используется бактериями как электрон-акцептор в анаэробном дыхании. Наиболее вероятно участие в этом процессе нитрат-феррик или марганец-оксидоредуктаз.
Таким образом, к началу наших исследований имелась весьма ограниченная информация о взаимодействии микроорганизмов и долгоживущих радионуклидов. Как отмечалось выше, опубликовано большое количество работ по сорбции технеция некоторыми растениями, животными и водорослями. В то же время роль микроорганизмов в превращении и сорбции технеция была изучена крайне недостаточно. Это послужило одной из причин активизировать изучение влияния технеция и других долгоживущих актинидов на микроорганизмы и их взаимодействие. В связи с попаданием технеция, плутония, америция в окружающую среду в результате испытаний ядерного оружия, неудовлетворительного хранения радиоактивных отходов атомных станций и биомедицинских отходов метастабильного технеция-99, остро стоит вопрос о разработке методов удаления и концентрирования таких радионуклидов. По нашему мнению, одним из наиболее перспективных методов является биотехнологический, чему посвящена данная диссертация.
Восстановление шестивалентного урана термофильной бактерией при использовании различных источников углерода
Также была измерена динамика восстановления Тс04" суспензией клеток с использованием водорода, формиата или лактата (рис. 5А). Пертехнетат восстанавливался наиболее быстро в случае водорода, причем около 85% было удалено из раствора менее чем за 1 час. Анализ супернатанта с помощью хроматографического разделения показал, что только 5% технеция (по отношению к исходному количеству) остается в семивалентном состоянии, при этом еще 10% обнаруживается на старте хроматограммы (в пятивалентном состоянии). В случае лактата наблюдали значительно более низкую скорость восстановления Tc(VII) (рис. 5А). Необходимо отметить, что отмытые клетки сульфатредуцирующих бактерий сохраняли восстанавливающую активность в течение нескольких недель при хранении при 4С. Более того, 15-минутная продувка воздуха не оказывала отрицательного влияния на восстановление пертехнетата.
Для более точного определения локализации восстановленного технеция были проанализированы срезы клеток в трансмиссионном микроскопе. Клетки бактерий инкубировали 24 ч при концентрации технеция 1 мМ, при этом 89% было восстановлено. Рентгеновский микроанализ подтвердил наличие электронно-плотного осадка восстановленного технеция по периферии клеток (рис. 5Б). В случае отсутствия технеция в инкубационном растворе такого окрашивания клеток не наблюдалось (рис. 5В). Полученные данные предполагают участие периплазматических ферментов в процессе восстановления пертехнетата. Ллойдом с соавторами (1997а, б) была установлена роль гидрогеназы 3 E.coli при восстановлении технеция, поэтому можно предполагать, что периплазматическая гидрогеназа D.de sulfuricons может работать как технеций-редуктаза. Для проверки этого предположения клетки были прединкубированы 10 мин с Cu(II) (0.5 мМ), так как известно, что двухвалентная медь ингибирует периплазматичекую, но не цитоплазматическую гидрогеназу (Fitz, Cypionka, 1991). В итоге, восстановления семивалентного технеция в эксперименте не наблюдалось, что подтверждает роль гидрогеназы в восстановлении технеция. Рис. 5. Исследование восстановления Тс04" в анаэробных условиях клетками D. desulfuricans. А - Восстановление Tc(VII) суспензией клеток при использовании водорода (А), формиата (Д) и лактата (о). В контроле () донор электронов отсутствует. Концентрация технеция - 0.25 мМ. Срез клеток в трансмиссионном микроскопе, инкубированных в присутствии (Б) и отсутствии (В) 1 мМ Tc(VII). Донор электронов - водород. Электронно-плотный осадок восстановленного технеция наблюдали по периферии клеток.
Удаление радионуклидов из раствора иммобилизованной биомассой бактерий имеет ряд преимуществ перед свободноживущими бактериями: клетки расположены на носителе, не вымываются раствором, более длительный срок жизни системы, самовосстановление системы. Нами была создана лабораторная установка с иммобилизованной биомассой Desulfovibrio desulfuricans. Бактерий выращивали на среде Постгейта, отмывали, а затем механически иммобилизовали на трубчатых акриловых фильтрах (12 Romicon ХМ50 acrylic hollow-fibre membranes, Romicon, Massachusetts, USA) внутренний диаметр 1.1 мм (рис. 6А). Количество клеток около 5 г/л реактора. В буферный раствор (MOPS) был добавлен пертехнетат (50 цМ) и формиат (25 мМ). Также был собран контрольный биореактор, где отсутствовал донор электронов (рис. 6А).
Пробы отбирали на выходе из биореактора по 4-5 раз каждые сутки. Эксперимент длился 137 часов. Уже через несколько часов инкубации наблюдали потемнение экспериментального биореактора, а через 72 ч образовывался черный осадок; в течение всего времени эксперимента происходило полное удаление технеция из раствора. В контрольном биореакторе сорбировалось только 1% радиоактивности (рис.6 А, Б).
Также была проверена возможность работы такого лабораторного биореактора при увеличении скорости протока (рис. 6Б). Можно видеть, что в 100 часовых экспериментах до скорости 16 мл/ч происходило полное удаление технеция из раствора иммобилизованной биомассой бактерий, а при более высоких скоростях очистка становилась неполной. При снижении скорости протока система возвращалась к равновесному состоянию и полному удалению технеция из раствора. Этого не происходило в опытах с E.coli (Lloyd et al., 1997 b) (рис. 6Б). Бактерии D. de sulfur leans наиболее эффективно восстанавливали и удаляли из раствора технеций.
Нами была предпринята попытка выяснить, какая еще группа ферментов вовлечена в восстановление пертехнетата у Desulfovibrio desulfuricans, и будет ли наблюдаться конкурентное влияние нитратов на восстановление пертехнетата. При добавлении нитрата в первую очередь потреблялся нитрат, следовательно, в это время не происходило потребление технеция и наблюдалось увеличение остаточной радиоактивности раствора. Только после полного потребления нитрата начиналось
Выделение аэробных микроорганизмов из зараженных почв и характеристика их устойчивости к металлам и радионуклидам
Нами показано, что бактерия С. ferrireducens способна использовать шестивалентный уран в качестве акцептора электронов (рис. 24). При инкубировании с 2.5 мМ урана восстановление U(VI) сопровождалось увеличением числа бактерий -к концу 68 ч инкубирования наблюдали примерно в 2.5 раза больше клеток в присутствии урана по сравнению с контролями без урана (рис. 24). Увеличение числа клеток было одинаковым в основной среде и в среде с восстановителем (0.5 г Na2SAn), свидетельствуя о том, что именно за счет восстановления шестивалентного урана происходило увеличение числа клеток. В качестве сравнения использовали рост термофильных бактерий на фумарате. Необходимо также отметить, что в присутствии урана рост культуры сопровождался 15 ч лаг-фазой, свидетельствуя о токсическом действии урана и адаптации бактерий.
Для анализа полученных в ходе экспериментов осадков был применен целый комплекс методов - рентгеновский микроанализ, Environmental Scan Electron Microscopy (ESEM), EXAFS (Extended X-ray absorption fine structure) и рентгеновский дифракционный метод.
Первый наиболее быстрый метод анализа, позволяющий определить состав осадка, это рентгеновский микроанализ и его модификация ESEM. Обычно, на носитель (электронную сеточку из меди, алюминия или др. материала) помещают каплю исследуемого образца, образец высушивается и анализируется. В нашем случае были получены следующие данные - в варианте контрольных образцов или экспериментальных до инокуляции наблюдали образование кристаллов различной формы (рис. 25). Рентгеновский анализ подтвердил наличие всех компонентов среды Na, Са, К, Р, О, U и другие элементы. В варианте, если таким же образом был приготовлен образец после восстановления урана бактериями, в поле зрения можно было видеть два типа частиц - крупных и мелких - кристаллы и округлые, почти шаровидные частицы (рис. 26а). Элементный анализ кристаллов показал наличие Na и С1, при этом уран обнаруживался только в шаровидных частицах (рис. 26 б).
Чтобы подтвердить образование шаровидных частиц в процессе бактериального роста и доказать, что наблюдаемые частицы не являются артефактом высушивания, использовали метод ESEM, когда каплю исследуемого образца замораживали в жидком азоте. При таком способе подготовки проб проходит довольно короткое время, и кристаллы неорганических веществ не успевают образоваться. Нами показано, что действительно в культуральной жидкости присутствуют шаровидные частицы и уран детектируется только в них (рис. 27).
Полученный бактериальный продукт, содержащий восстановленный уран, является аморфным, который для последующих дифракционных анализов лучше отмывать не водой, а ацетоном. В таком случае элементный анализ свидетельствовал о более чистом образце, по сравнению с другими способами подготовки проб, поскольку на рентгенограмме наблюдали меньше «шумов» (рис. 28).
Отмытый ацетоном образец подвергали анализу рентгеновской дифракции (XRD). Как уже отмечалось, из-за присутствия фосфата в среде изначально образуется желтый рыхлый осадок, содержащий уран, фосфор и некоторые другие элементы. Методом рентгеновской дифракции исходный продукт был идентифицирован как урамфит - [(NH4)(U02)(P04) хЗН20] с характерными линиями 5.557, 3.799, 3.509, 3.279, 2.780, 2.179, 2.160, 1.698 А, с интенсивностью 40% и более (рис. 29 и таблица 24). Полученный бактериальный продукт - серый осадок, содержащий восстановленный уран, и также подвергнутый анализу, идентифицирован как нингиоит - [CaU(P04)2xH20], с пиками при 4.333, 3.022, 2.809, 2.349, 2.128, 1.844, 1.736, 1.691А (рис. 29 и таблица 24). Исходный урамфит содержал шестивалентный уран (U(VI)), тогда как конечный нингиоит содержал четырехвалентный уран U(IV). Этот факт также был подтвержден методом EXAFS (рис. 30). В то же время атомное расстояние между U и О предполагает наличие смеси продуктов четырехвалентного фосфата урана и четырехвалентного оксида урана (расстояние U-O = 2.36 характерно для оксида (таблица 25)).
Что касается визуализации бактериальных клеток, то из-за невозможности применить дополнительное контрастирование их удавалось разглядеть только как слабые тени на фоне исследуемого осадка (рис. 31).
Итак, нами впервые доказано, что термофилы С. ferrireducens используют шестивалентный уран в качестве акцептора электронов в процессе роста (параллельно восстановлению увеличивалось количество клеток), при этом происходило восстановление шестивалентного урана в виде слабо растворимого урамфита с образованием практически нерастворимого нингиоита, содержащего четырехвалентный уран.
