Содержание к диссертации
Введение
1.0. Обзор литературы 11
1.1. Нормальная микрофлора организма человека 11
1.2. Условно-патогенные микроорганизмы в аутофлоре человека, их роль в возникновении заболеваний 18
2.0. Результаты собственных исследований 30
2.1. Способы решения поставленных задач 30
2.2. Клиническая характеристика обследуемых групп людей 31
2.3. Методика исследования микрофлоры 32
2.4. Изучение факторов вирулентности стафилококков 36
2.4.1. Определение плазмокоагулазной активности 36
2.4.2. Определение гемолитической активности 36
2.4.3. Определение лецитиназной активности 37
2.4.4. Определение гиалуронидазной активности 38
2.5. Методика изучения адгезивных свойств бактерий 38
2.6. Методика определения антилизоцимной активности бактерий 39
2.7. Методика определения антиинтерфероновой активности бактерий 39
2.8. Определение индекса вирулентности 40
2.9. Выделение плазмидной ДНК 42
2.10. Анализ генетического полиморфизма штаммов методом 43
амплификации с произвольными праймерами
2.11. Выявление гена тесА, детерминирующего устойчивость 44
к Р-лактамам
2.12. Статистическая обработка полученных результатов 45
3.0. Эколого-гигиеническая оценка территории региона обследования 46
4.0. Аутофлора практически здоровых людей и больных хирургических стационаров 2-х модельных районов города волгограда 51
4.1. Аутофлора условно-здоровых людей 51
4.1.1. Микрофлора кишечника практически здоровых людей, проживающих в районах с различным экологическим прессингом 51
4.1.2. Микрофлора кожи практически здоровых людей, проживающих в районах с различным техногенным прессингом 57
4.2. Аутофлора больных хирургических стационаров 60
4..2.1. Микрофлора кишечника больных, поступивших на оперативное лечение в больницы 2-х модельных районов 60
4.2.2. Микрофлора кожи больных хирургических стационаров,находящихся на лечении в больницах 2-х модельных районов 62
4.2.3. Уровень, структура и динамика послеоперационных .гнойно-воспалительных заболеваний у больных хирургического профиля 67
5.0. Микрофлора гнойных ран больных хирургических стационаров 69
6.0. лекарственная устойчивость условно патогенных бактерий, колонизирующих лиц обследуемых групп- 73
6.1. Чувствительность к антибиотикам стафилококков колонизирующих больных хирургического стационара при поступлении , 73
6.2. Влияние'экологических факторов на антибиотикорезистентность стафил ококков 77
6.3. Метициллинрезистентные стафилококки в биоценозе лицо бследуемых групп 79
6.4. Чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, колонизирующих больных хирургического стационара 85
7.0. Биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов 89
7.1. Вирулентные свойства метициллинрезистентных стафилококков 89
7.2. Прогнозирование благополучия аутофлоры 90
8.0. Характеристика плазмидного профиля и днк условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из различных экологических ниш 93
Заключение 107
Выводы 117
Указатель литературы 119
- Условно-патогенные микроорганизмы в аутофлоре человека, их роль в возникновении заболеваний
- Методика изучения адгезивных свойств бактерий
- Микрофлора кишечника практически здоровых людей, проживающих в районах с различным экологическим прессингом
- Чувствительность к антибиотикам стафилококков колонизирующих больных хирургического стационара при поступлении
Введение к работе
з
Актуальность темы
Процесс микробного заселения приводит к формированию комплексных сообществ различных популяций микроорганизмов в определенных биотопах - как в окружающей среде, так и в организме человека (С.Д. Митрохин, 1994; Б.А. Шендеров, 2004; J. Now, 2002; Tah et al., 2003; Т. Haushi, 2005).
В результате указанных событий формируется экосистема, при этом обнаруживается определенная иерархия между микробными популяциями (О.Ю. Кузнецов, 2005; N. Vindel a. oth., 1993).
Взаимодействие человека с микроорганизмами, заселяющими его кожные покровы и слизистые оболочки открытых экосистем - процесс сложный и недостаточно изученный (А.А. Воробьев с соавт., 2002).
Установлено, что различные виды бактерий проявляют заметную избирательность анатомической локализации. В связи с этим каждому биотопу организма свойственна своя относительно постоянная флора (АЛ. Красильников, 1986; G.W. Tannock, 1988).
Микрофлора, являясь одним из защитных механизмов организма, может быть неисчерпаемым резервуаром возбудителей экзо- и эндогенных инфекций (В.И. Стручков, 1982; СИ. Сытник, 1984; И.А. Ерохин с соавт., 2005).
Установлено, что в каждом биоценозе регистрируются как резидентные, так и транзиторные микроорганизмы, среди которых немаловажное значение имеют условно-патогенные представители.
До настоящего времени дискутируется вопрос о роли отдельных видов условно-патогенных микроорганизмов в формировании нормальной микрофлоры тела человека, участии их в этиологии и патогенезе ряда заболеваний (Н.В. Никешина, 2003; Л.В. Гоян, 2004).
При самых разнообразных внешних воздействиях (техногенное загрязнение окружающей среды), экстремальных условиях, стрессовых ситуациях, развитии в желудочно-кишечном тракте патологических состояний происходят качественные и количественные изменения нормальной микрофлоры (И.В. Лиманская, 2006).
Обитание человека в конвенционных условиях сопряжено с постоянным заселением организма посторонними микроорганизмами, результатом этого явилось формирование ряда мощных защитных систем, необходимых как для поддержания эффективного контроля за эндогенными популяциями, так и для предотвращения негативных последствий экзогенной микробной контаминации (Л.П. Зуева, 2006; J. Stephen et al., 2002).
Проблема госпитальных инфекций в настоящее время стала одной из наиболее острых в ряду неотложных задач, стоящих перед здравоохранением, как в нашей стране, так и за рубежом (Г.Г. Онищенко, 1999; 2004; Б.Л. Черкасский, 1999; Е.Н. Ковалева с соавт., 2002; Т.П. Крючкова, 2005), которые возникают вследствие реализации механизмов естественной и артификальной передачи инфекции среди пациентов и медперсонала и развиваются в специфических социальных условиях при концентрации восприимчивого к инфекциям контингента и циркуляции в стационарах госпитальных штаммов и (Р.Х. Яфаев с соавт., 1989; Н.А. Семина, 2001).
По мнению Г.С. Коршунова (2002), Д.Д. Меньшикова с соавт. (2003), М. Shaheeu (2003), для подразделений лечебных учреждений характерна локальная особенность пейзажа госпитальной среды и превалирования тех или иных видов микроорганизмов из числа потенциальных возбудителей.
Однако, несмотря на большое количество работ, посвященных профилактике внутрибольничных инфекций, в хирургических стационарах эта проблема остается весьма актуальной. В частности, до настоящего времени остаются недостаточно глубоко изученными роль и участие
микроэкологии потенциального пациента хирургического стационара, который может быть причиной возникновения госпитальной инфекции у самого себя и источником для окружающих его людей.
Следует заметить, что в литературных обзорах доступной нам литературы указан анализ микрофлоры человека либо одного биотопа, часто лишь при патологических состояниях, что препятствует формированию целостного представления о составе микробиоценозов организма человека, живущего в районах с различным экологическим прессингом, и ее влиянии на развитие инфекционных процессов.
Важность и многообразие функций, которые присущи микрофлоре, с одной стороны, и возможные негативные последствие для здоровья человека в случае нарушения ее целостности, с другой стороны, определяют актуальность изучения этой проблемы.
Учитывая вышеизложенное, целью работы явилось определение особенностей микробной колонизации больных, проживающих в районах, неравнозначных по техногенной нагрузке, и поступивших на лечение в хирургические стационары; определение значимости условно-патогенных микроорганизмов нозокомиального и внебольничного происхождения.
Для выполнения поставленной цели представлялось необходимым решение следующих задач:
1. На основе анализа многолетних данных территориального
распространения условно-патогенных микроорганизмов установить их
структуру и особенности сукцессии в популяции людей, проживающих в
районах с различным техногенным прессингом.
2. Изучить колонизацию условно-патогенными микроорганизмами
больных хирургических стационаров в процессе лечения до и после
оперативного вмешательства.
3. Выявить гетерогенность популяций условно-патогенных
микроорганизмов, используя факторы персистенции, биологические
свойства и генотипические маркеры.
4. Провести микробиологический локальный анализ аутофлоры
больных поступивших на оперативное лечение в больницы,
расположенные в районах с различным техногенным прессингом, оценить
динамику фенотипических и генотипических свойств условно-патогенных
микроорганизмов, потенциальных возбудителей внутрибольничных
инфекций.
5. Обосновать тактику профилактических мероприятий,
направленных на комплексное оздоровление больного человека,
находящегося на лечении в хирургическом стационаре.
Научная новизна
Впервые определена колонизация условно-патогенными микроорганизмами открытых экосистем человека, проживающего в районах с различным техногенным прессингом крупного промышленного города.
Установлено, что наибольшая обсемененность макроорганизма условно-патогенными микроорганизмами регистрируется у людей южного топрдема города, при этом в процессе сукцессии УПМ занимают ниши, которые были колонизированы у здоровых нормальными симбионтами (лакто и бифидобактерии).
Выявлено, что больные, поступающие на лечение в хирургическое отделение, достоверно чаще и более массивно заселены условно-патогенными микроорганизмами, чем практически здоровые люди.
Показано, что энтеробактерии, составляющие биоценоз послеоперационных ран, не имеют общих плазмид и однотипного генотипа с таковыми, выделенными от персонала и внешней среды, что свидетельствует о наличии у больных штаммов клебсиелл, эшерихий, псевдомонад, не имеющих отношения к больничной среде, то есть обусловлены эндогенными патогенами.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере аутофлоры в популяции людей, живущей в крупном промышленном городе. Выявленные нарушения микрофлоры и разнонаправленное влияние на течение послеоперационного осложнения в зависимости от выраженности факторов персистенции S. aureus и условно-патогенных энтеробактерий дают основание разработать рациональную этиотропную терапию данной патологии, которая должна быть направлена на элиминацию стафилококков из больничной среды и коррекцию собственной микрофлоры.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Техногенное загрязнение окружающей среды влияет на
микроэкосистему открытых полостей организма человека, живущего в
районах экологического прессинга крупного промышленного города.
2. Одним из условий, направленных на оздоровление микрофлоры
человека после оперативных вмешательств, является биокоррекция
микрофлоры открытых экосистем в до и в первые дни послеоперационного
периода.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на межвузовской конференции студентов и молодых ученых (2007), а также конференции молодых ученых ВолГМУ (2005, 2007, 2008, 2009). По теме кандидатской диссертации опубликовано 11 работ, из них одна - в журнале, рецензируемом ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация написана на русском языке. Ее текст размещен на 121 странице. Она состоит из 2 глав литературного обзора и 3 разделов собственных исследований, включающих 8 глав, заключение, общие выводы, рекомендации для внедрения результатов в науку и практику. Материалы диссертации проиллюстрированы 24 таблицами и 23
рисунками. Диссертация завершается указателем литературы, содержащим 245 источников, в том числе 180 отечественных и 65 иностранных.
Условно-патогенные микроорганизмы в аутофлоре человека, их роль в возникновении заболеваний
В результате действия внешних и внутренних факторов качественный и количественный состав биоценоза постоянно меняется. Известно, что в состав микрофлоры человека, кроме нормальных симбионтов, входят и транзиторные виды, относящиеся к категории условно-патогенных, которые из транзи горных при определенных условиях могут переходить в ранг резидентных (А.А. Адарченко, 1998). Взаимодействие организма с условно-патогенными микроорганизмами, колонизирующими его кожные покровы и слизистые оболочки открытых экосистем, - процесс сложный и малоизученный (В.Г. Акимкин, 2000, 2005). Местом обиіания условно-патогенных бактерий традиционно считаются все органы и ткани, сообщающиеся с внешней средой (В.М. Коршунов с соавт., 1985). Так, вся поверхность кожи человека покрыта биопленкой из микроорганизмов, прикрепившихся благодаря специфической адгезии к клеткам рогового слоя (Л.А. Леванова, 2001; D.A. Goldmann, 1981). Довольно часто в этой экосистеме присутствуют кокки. Так, частота высева золотистого стафилококка в первые дни жизни ребенка равна 78-82% и составляет 26,09±5,5 КОЕ/см2 (В.Г. Лиходед, 1998, 1999, 2005). В ясельном и дошкольном возрасте процент носительства стафилококков у детей снижен до 18-20 и к периоду полового созревания составляет 32,7±7,38.
В группе молодых людей, а в дальнейшем и у людей 40-50 лет колонизация золотистым «стафилококком кожи увеличивается и составляет 40-45% (СИ. Сытник, 1991; 1989; Н.Л. Ткаченко, 1991; ЕМ. Рындина, 2001; Y.Choi etal., 2008). Дрожжеподобные грибы рода Кандида как представители микрофлоры здоровых людей не имеют патогенной роли, за исключением условий, когда нормальное состояние организма хозяина каким-либо образом нару-шается. Липофилъные дрожжеподобные грибы представлены в микрофлоре кожи родом Fitirosporum, нелипофильные виды - родом Candida, которые считаются компонентом нормальной флоры пищеварительного тракта, но не являются обычными представителями микрофлоры кожи, так как не способны заселять неповрежденную здоровую, сухую кожу (СИ. Сытник, 1991; J.V. Song etal., 2002). В настоящее время частота обнаружения грибов рода Кандида неуклонно возрастает и связана, по данным Р.Н. Ребровой (1989), со снижением неспецифической резистентности людей, обусловленной ухудшением питания, нерациональным использованием антибиотиков и другими факторами. Стрептококки не относят к резидентной флоре кожи;- однако они характерны для некоторых ограниченных участков и занимают экологическую нишу на слизистых оболочках ротовой полости, нижней трети носовых ходов (А.Н. Куркина, 2003), откуда может происходить их распространение.
Весь желудочно-кишечный тракт представляет собой открытую сие-тему, имеющую постоянный контакт с внешней средой, микрофлора пищеварительного тракта характеризуется относительной стабильностью (А.А. Воробьев с соавт., 1995, 2000, 2001). Однако факультативная группа микроорганизмов толстого кишечника очень обширна. Сведения о частоте обнаружения и количественном их содержании до настоящего времени носят противоречивый характер. Так, по данным А.П. Подобуевой с соавт. (1988), стафилококки, протеи, эшс-рихии с гемолитическими свойствами, кандиды выделяются в 15-20% случаев, составляя в сумме не более 10-15% аэробной флоры. . Г.И. Гончарова с соавт. (1987, 1988) сообщает, что частота выявления кандид в микробиоценозе кишечника здоровых людей составляет 14,3, стафилококка - 2,9, гемолизирующих эшерихий - 17,6, эшерихий с измененными ферментативными свойствами - 19,3, протея - 5,0, клебсиелл -5,9, цитробактера — 20,2, энтеробактера - 11,8%. Противоречивы сведения о частоте обнаружения этих микроорганизмов у детей раннего возраста. По данным Г.А. Четвертновой (2008), у детей до года, находящихся на естественном вскармливании, стафилококки выделяются в 28,0%о наблюдений, протеи- в 48,0, дрожжеподобные грибы - в 15,0, клостридии — в 21,0. Однако, несмотря на все разнообразие приведенных литературных данных, большинство исследователей относят стафилококки, протеи, дрожжи, клебсиеллы, цитробактер, энтеробактер, клостридии, аэробные бациллы и другие микроорганизмы к остаточной флоре, составляющей менее 1,0% (И.Е. Минкевич, 1948; С.Д. Митрохин, 1997, 2000; Н.С. Морозова, 2000; Н.П. Карпинская, 2006). Многие представители этой группы, микроорганизмов являются потенциально патогенными, так как при благоприятных условиях они способны проявлять свои агрессивные свойства (Д. Ван-дер-Ваай, 1992).- Являясь, по мнению ряда авторов, транзиторной микрофлорой, не выполняя физиологических функций, УПМ способны нанести большой вред макроорганизму, так как активизируются в период снижения его сопротивляемости (А.Ф. Билибин, 1978; О.П. Селькова с соавт., 1997, 2002; О.М. Абрамзон с соавт., 2004). В.И. Покровский (1999, 2000, 2001, 2003} установил, что как у детей, так и у взрослых носительство грамнегативных бактерий встречается довольно часто и составляет 5-10% на коже межпальцевых промежутков, в t і « ... 5% - на слизистой оболочке носа. Микроорганизмы, обитающие в кишечнике человека, встречаются на коже промежности в качестве транзиторных представителей микрофлоры. У больных различными общими заболеваниями численность грамотрицательных бактерий на коже и слизистых оболочках может значительно увеличиваться (И.К. Нобл, 1986; Н.А. Поликарпов с соавт., 1985, 1986; И.В. Николаева с соавт., 2000; Н.Г. Петрова с соавт., 2003; P.L. Conway, 1994; С.Н. Chen et al., 1996; S. Branger et al., 2005).
Основным резервуаром и местом обитания условно-патогенных бактерий в организме человека традиционно считается энтеральныи тракт, где обнаруживается до 500 видов микроорганизмов (Э.А. Степанов с соавт., 1998; Г.И. Гончарова с соавт., 1987, 1988; И.Б. ]Куваева, К.С. Лад одо, 1991; G.J. Simen et al., 1985; Y. Benno et al., 1984; J.J. Fanner et al., 1999; S.V. Rana, 2008). Слизистая оболочка кишечника постоянно находится в контакте с микроорганизмами, присутствующими в окружающей среде. Главными входными воротами для микроорганизмов из окружающей среды является полость рта. Человек с пищей, водой, слюной в течение суток проглатывает до 1 млрд микробов (Г.А. Четвертнова, 2008; D. Dai et al., 1999; M.W. Cohninghaw, 2000; К. Leugh et al., 2000). Заполняя экологические пиши, предназначенные для нормальной кишечной микрофлоры, УПМ не только представляют реальную угрозу, развивая патологический процесс, но и лишают макроорганизм индиген-ной микрофлоры, выполняющей и регулирующей многочисленные функции (В.М. Бондаренко с соавт., 1987, 1989, 1991; Г.А. Самсыгина с соавт., 1988; О.М. Абрамзон с соавт., 2004; J.J. Farmer et al., 1999; A. Brysker, 2002). В последние годы проводятся широкие исследования по изучению роли условно-патогенных микроорганизмов в возникновении воспалитель
Методика изучения адгезивных свойств бактерий
Гиалуронидазную активность определяли по методу Мак-Клина в модификации М.Ш. Могилевского и Л.С. Коган. Для количественного определения гиалуронидазы первоначально устанавливали рабочую дозу раствора гиалуроновой кислоты. Затем к обьему гиалуроновой кислоты, соответствующему рабочей дозе, добавляли в убывающих количествах (0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 мл) 2-миллиардную взвесь суточной агаровой исследуемой культуры. Затем исследование проводили, как указывалось ранее. Отсутствие сгустка в большем или меньшем числе опытных пробирок свидетельствовало о степени активности гиалуронидазы и оценивалось от «+» до «+++++» по числу опытных пробирок. Низкой активностью гиалуронидазы обладали штаммы, для которых отсутствовал сгусток только в первой пробирке, содержащей 0,5 мл исследуемой культуры, высокой в 4-5-ти опытных пробирках. Штаммы, в которых отсутствовал сгусток в первых 3-х пробирках, расценивали как обладающие средней степенью активности. Образование сгустка во всех опытных пробирках указывало на ее отсутствие. Изучение адгезивных свойств бактерий проводилось по методу В.И. Брилиса (1983) с использованием формализированпых эритроцитов человека 0 (I) группы Rli (+). Клеточным субстратом служили суточные бульонные культуры (рН—7,4) изучаемых УПБ и штаммов кишечных палочек. Качественное наличие и количественная выраженность признака антилизоцимной активности микроорганизмов определялись по методике О.В. Бухарина с соавт. (1984). С этой целью готовили разведения лизоцима яичного белка (АО «Феррейн», регистрационный номер 76/506/6) в концентрациях от 10 до 250 мкг/мл с интервалом 10 мкг. К 0,5 мл каждого из указанных разведений лизоцима добавляли по 4,5 мл расплавленного и остуженного до 45 С 1,5%-ного питательного агара и разливали равномерным слоем на чашки Петри. Таким образом, в агаровой среде создавали концентрации лизоцима от I до 25 мкг/мл с интервалом 1 мкг/мл.
На поверхность застывшей и подсушенной среды с разными концентрациями лизоцима наносили репликатором капли суточных агаровых культур (109 бактерий в 1 мл) исследуемыех штаммов. После суточной инкубации в термостате при температуре 37 С выросшие макроколонпи обрабатывали парами хлороформа в течение 30 хминут, а затем вторым слоем заливали 3 мл 0,7%-ного питательного агара, содержащего 0,1 мл одномиллиардной взвеси индикаторной культуры Micrococcus lysodeikticus (штамм № 2665 ГИСК им. Т.А. Тарасевича). Результаты опыта учитывали после 18-24-часовой инкубации. Количественная оценка антилизоцимной активности культур проводилась по максимальной концентрации лизоцима, при которой отмечался рост микрококка вокруг колоний, и выражалась в мкг инактивированного лизоцима в среде. Антиинтерфероновая активность (АИА) определялась по методу В.Ю. Соколова (1990), согласно которому готовили ряд разведений препарата человеческого лейкоцитарного интерферона (ПО «Биомед») и добавляли в расплавленный и остуженный 1,5%-ный питательный агар.
На поверхность приготовленной среды засевали репликатором капли (0,05 мл) суточных агаровых культур (109 бактерий в 1 мл) исследуемых штаммов. После суточной инкубации посевов в термостате при температуре 37 С выросшие колонии бактерий инактивировали парами хлороформа в гечение 30 минут и заливали вторым слоем 0,7%-ного питательного агара, содержащего одномиллиардную взвесь тест-культуры Corynebacterium xerosis (штамм № 181 ГИСК им. Т.А. Тарасевича). Учет результатов производили после 18-24 часовой инкубации при 37 С. .О наличии антиинтерферонового признака у бактерий судили по росту тест-культуры, свидетельствующем о нейтрализации интерферона в среде. Используя принципы нумерической обработки полученных данных, мы рассчитывали индекс вирулентности для всех штаммов. Выраженность каждого признака оценивалась в баллах. Балльный показатель активности плазмокоагулазы и гиалуропидазы равнялся числу знаков «+» при оценке их активности по системе «+++++» («+++++» соответствовали 5 баллам, «++++» - 4, «+++» - 3, «++» - 2, а «+» - 1). Балльная оценка гемолитической и лецитиназной активности рассчитывалась по формуле где D — диаметр зоны гемолиза или радужного венчика; d - диаметр петли (2 мм). Таким образом, индекс вирулентности для штамма, у которого плаз-мокоагулазная активность была «++» (2 балла), активность гиалуронидазы — «+++» (3 балла), зона гемолиза 6 мм (2 балла), а диаметр радужного венчика 10 мм (4 балла), рассчитывали так: 2 + 3+2 + 4=11. При идентификации стафилококков представляло интерес знание устойчивости к метициллину (оксациллину). С этой целью изучалась не только устойчивость, но и ее минимальная подавляющая концентрация (МГЖ), величину которой определяли методом серийных разведений согласно методическим указаниям 4.2.1890-04. Для приготовления основного раствора антибиотика использовали оксациллин (ОАО «Биосинтез», г. Пенза). Расчет массы антибиотика для приготовления серийных разведений препарата в диапазоне от 0,5 до 1000 мкг/мл производили по формуле где m-reop - теоретическая масса навески с учетом активности с)бстанщш; С макс - максимальное разведение препарата; V осн _ объем базового раствора;
А - активность субстанции, выраженная в процентах. Рабочий раствор антибиотика готовили из основного с использованием жидкой питательной среды таким образом, чтобы получить двукратные разведения от 1000 до 0,5 мкг/мл. Для инокуляции стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0,5 по стандарту McFarland (1,5 х 108 КОЕ/мл), разводили питательным бульоном (производство НИИ «Питательная среда», г. Махачкала, Дагестан) до концентрации 106 КОЕ/мл. После внесения инокулюма в пробирки с раствором антибиотика конечная концентрация микроорганизмов достигала с і 5 х 10 КОЕ/мл. Одновременно ставили «отрицательный» контроль с питательным бульоном без антибиотика. Посевы инкубировали при температуре 35 С в течение 24 часов. Учет результатов проводили визуально. За МГЖ принимали минимальную концентрацию оксациллина, при которой подавлялся видимый рост исследуемого штамма. Скрининг штаммов на наличие плазмидной ДНК проводили с использованием методики, предложенной Т. Маниатис с соавт. (1984). Культуру выращивали при 37 С в течение 16-18 часов на скошенном агаре BHI («Difco»), и бактериальную массу тщательно ресуспендиро-вали в низкосолевом буфере: 40 мМ Трис-ацетата, 2 мМ ЭДТА (рН 8,0). После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 минут при 10000 об/мин ресуспсидировали осадок в 100 мкл буферного раствора, со-держащего 50 мМ глюкозы, 100 мМ ЭДТА, 25 мМ Трис, 5 мг/мл лизоцима, рН 8,0. После охлаждения клеток на льду в течение 15 минут добавляли 200 мкл лизирующего раствора: 0,2М NaOH, 1% ДСН. Встряхивали и оставляли во льду на 5 минут. К охлажденному лизату бактериальных клеток добавляли 150 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 4,8) и охлаждали пробы во льду в течение, 30 минут. Центрифугировали на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4 С. К супернатанту добавляли 1 мл охлажденного этанола и выдерживали 15 мин при —20 С. После центрифугирования осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора, содержащем 0,1М ацетата натрия и 50мМ Триса (рН 8,0). После добавления 250 мкл этанола пробирки выдерживали при -20 С в течение 15 минут и центрифугировали на микроцентрифуге 5 минут при 10000 об/мин при 4 С. Осадок промывали 70 этанолом и растворяли в 30 мкл буфера ТЕ (ЮмМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).
Микрофлора кишечника практически здоровых людей, проживающих в районах с различным экологическим прессингом
Для реализации поставленных задач изучена микрофлора кишечника 174 практически здоровых людей, из которых 87 человек проживали в центральном топодеме (1 группа), 87 - в южном (2 группа). Обследуемые были в возрасте от 18 до 65 лет, не болевшие в те чение трех последних лет и не принимавшие антибиотики. Учитывая колебания значений результатов, полученных при исследовании микробной колонизации кишечника, понятие «нормальная микрофлора» определено как среднефизиологическая величина микробной об семененности лиц практически здоровых людей, при этом были установлены основные закономерности микробной экологии изучаемого биотопа у жителей двух модельных районов. Анализируя микрофлору кишечника обследуемых первой группы, выявили, что основными представителями симбионтной флоры являются бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии (табл. 2). Из данных табл. 2 видно, что бифидобактерии высевались у всех обследуемых с колебанием величин от 1-Ю5 до 1-Ю8КОЕ/г со средним значением равным 1-Ю ±0,2 КОЕ/г. Лактобактерии были выделены также у всех наблюдаемых в титрах от 102 КОЕ/г (6,9%) до 10ю КОЕ/г (1,2%). Среди; аэробной флоры толстой кишки значительная физиологическая роль принадлежит кишечной группе бактерий. Нам представлялось целесообразным провести анализ качественному и количественному составу в биоценозе эшерихии. В работе установлено, что Е. coli обнаруживались у всех обследуемых (100%), при этом содержание их было от 200 000 до 10 млн. Наряду с нормальными эшерихиями, которые были выделены у 63 человек, встречались кишечные палочки со сниженной ферментативной активностью (27,59%; Ы07±1,35 КОЕ/г) и гемолитическими свойствами (2,3%; 1-107±0;79 КОЕ/г) (табл. 3). Анализ данных, представленных в табл. 3, показал структуру микробиоценоза кишечника и выявил ряд особенностей качественного и количественного срстав этой экосистемы. Лактобактерии в кишечном биоценозе присутствовали у 100,0% обследуемых, бифидобактерии — в 100,0% на-блюдений.
При этом их содержание составило 1-10 ; 10 КОЕ/г соответственно. При оценке колонизации кишечника установлено, что у подавляющего числа обследуемых (30,0%) бактерии вегетируют в виде ассоциаций. Наиболее часто анаэробные представители микробиоценоза здоровых людей составляли трехвидовые ассоциации (40,0%), в 2 раза реже выявляли совместное вегетирование 4-х анаэробных видов (25,0%). Ассоциации из двух представителей обнаруживались у 10,13%, из пяти — у 5,7% обследуемых. Видовой состав факультативной группы бактерий был разнообразным. Среди условно-патогенных микроорганизмов обнаруживались стафилококки, при этом S. aureus высевался у 8 (9,2%) наблюдаемых с плотно-с гью колонизации равной 9-10JKOE/r,KOC были обнаружены у 13 (14,9% ) человек со среднеарифметической величиной обсеменеиности равной 7-Ю3 КОЕ/г. Грибы рода Candida регистрировались у 4 (4,7%) наблюдаемых. Кроме названных микроорганизмов, в биоценозе кишечника практически здоровых были обнаружены и условно-патогенные энтеробактерин: протей (4,7), клебсиеллы (3,6), энтеробактер (3,6), цитробактер (2,3). Важно отметить, что условно-патогенные бактерии определялись преимущественно в монокультуре (от 3 до 13,8%) и лишь у 5,8%) в ассо циациях. ,. Таким образом, состав микробиоценоза кишечника здоровых людей, проживающих в экологически благоприятном районе, довольно разнообразен.
Микробный спектр фекалий этой группы людей характеризовался доминирующим положением лакто-, бифидобактерий. Учитывая неравнозначность экологической обстановки в дальнейшем представлял интерес анализ микрофлоры кишечника у здоровых жителей южного топодема. Микрофлора изучена у 87 человек в возрасте от 17 до 65 лет, условно-здоровы и в последнце три года не принимавших антибиотики. Из данных табл. 4 явствует, что у проживающих в южном топодеме наблюдается снижение содержания эшерихий до 500 млн в 1 г у 42,5% (36), а у 50 из них (57,5%) зарегистрировано резкое увеличение ( 1 млрд). В биоценозе обследуемых наряду с полноценными кишечными па-дочками встречались эшерихий со сниженной ферментативной активностью (24,1%о) и гемолитическими свойствами (26,4% ). Частота встречаемости их была достоверно выше, чем у лиц группы сравнения (р 0,05). Кроме названных микроорганизмов, в микрофлоре зарегистрированы также различные виды условно-патогенных энтеробактерий (УПЭБ). Суммарно УТТЭБ были обнаружены у 46,7±3,7%, при этом выделялись бактерии рода Citrobacter у 8,7±1,2, у 6,9±2,9 - рода Enterobacter, 13,9±1,9 - Proteus, 17,2±1,8 - Klebsiella. Важно подчеркнуть, что УПЭБ обнаруживались в виде монокультуры и только у 7,0% лиц они встречались в ассоциациях. Обнаруженный у здоровых жителей города Волгограда качественный и количественный состав флоры позволил говорить о неоднородности кишечного биоценоза.
Учитывая отсутствие перенесенных заболеваний в анамнезе и клинической симптоматики, установленные сдвиги были расценены как варианты нормы, сформировавшиеся в конкретных экологических условиях среды обитания. Это позволило нам выделить 4 ценотипа (нормоварианты) микрофлоры кишечника у жителей двух модельных районов г. Волгограда. 1 ценотип (наиболее физиологичный) - характеризуется высоким титром содержания бифидо- и лактобактерий (выше 10 и 10 соответст-венно) и эшерихий в количестве 10-10 КОЕ/г, с отсутствием атипичных форм. 2 ценотип - проявляется снижением титра бифидобактерий на 1-2 порядка логарифма либо лактобацилл без изменения других параметров. 3 ценотип - выражается изменениями в составе эшерихий - увеличением их количества свыше 108 либо снижением ниже 106 КОЕ/г, появлени ем гемолитических или лактозонегативных вариантов в количестве не более 20% общего числа популяции кишечных палочек при низком содержании молочнокислых бактерий. 4 ценотип — характеризуется наличием в микрофлоре условно-патогенных микроорганизмов в титре 10" -10 КОЕ/г при изменении в составе симбионтов (лакто- ,и бифидобактерий или эшерихий). Анализ распространенности различных вариантов микрофлоры в популяции здоровых жителей города позволил утверждать, что в центральном топодеме Волгограда преобладающим был ценотип 1 порядка — 69,4±4,7%, тогда как у жителей южных районов обнаружены минимальные его показатели (25,1±5,1%) (р 0,05). Ценотип 2 порядка регистрировался в 12 ,9±1,8% наблюдений в центральном топодеме, тогда как в южной части города его удельный вес составил 18,5±1,4%. У жителей южного топодема в структуре микробиоцено-ца кишечника преобладал 3 тип нормофлоры (42,8±12,9%), кроме того был установлен также 4 ценотип (13,6±2,4%). Таким образом, было выявлено, что для экологически благополучного центрального топодема были характерны наиболее физиологичные варианты биоценозов в виде ценотипов 1 и 2 порядков, а доля 3 и 4 не превышала 18%о. В южном топодеме глубина микроэкологических сдвигов была высокой: первый ценотип регистрировался у 25,28% здоровых людей, а удельный вес 3 и 4 ценотипов увеличивался до 42,5±12,9% и 13,6±2,4% соответственно. Полученные данные показывают, что с ухудшением экологической ситуации в районе экологического неблагополучия формирование физиологичных вариантов микробиоценоза кишечника у здоровых людей снижается.
Исследования бактериальных сообществ, кожи начали с рассмотрения их структуры с последующим изучением связей со средой и функциональной характеристикой. Обследованию подвергнуто 174 практически здоровых людей, из ко-торых 87, живущих в центральном топодеме, и 87 - в южном, изучено 1080 биоценозов, проведена идентификация 1044 штаммов аэробных и анаэробных культур микроорганизмов, что дало право отнести полученные штаммы к 31 видам, входящим в 14 родов и 8 семейств. Полученные данные свидетельствуют, что ведущую роль в формировании нормального биоценоза кожи практически здоровых людей играют коагулазоотрицательные стафилококки (КОС), микрококки, коринеформ-ные бактерии. Среди них первое место по частоте выделения занимают микрококки (100%), что согласуется с данными СИ. Сытника (1992), который обнаруживал эти микроорганизмы у подавляющего большинства здоровых людей. Высеваемость микрококков с поверхности исследуемого биотопа составляла в среднем 2,2-10" КОЕ/см . Коагулазоотрицательные и коринеформные бактерии (резидентные виды) колонизировали условно-здоровых довольно часто (74,7 и 55,1% соответственно) в количествах 2,4-103 - 2,5 103 КОЕ/см2 (табл. 5).
Чувствительность к антибиотикам стафилококков колонизирующих больных хирургического стационара при поступлении
Анализ данных табл. 12 показал наличие высокой устойчивости стафилококков к антибиотикам группы пенициллинов. Так, число культур, ус-тойчивых к пенициллину, составило 90,5, метициллину - 22,9%. Весьма незначительным было количество штаммов, умеренно резистентных к данным препаратам - 2,7 и 3,3 %. Полученные данные практически не отличались от показателей контрольной группы (95,0% стафилококков, резистентных к пенициллину, и 19,9% - метициллину). При изучении чувствительности к макролидам установлено, что клиндамицин эффективно подавлял рост 64,6% стафилококков, значительно ниже этот показатель был у эритромицина (34,7%). В целом клиндамицин задерживал рост 83,0% штаммов, что было сопоставимо с показателя-ми группы сравнения (83,4%), тогда как к эритромицину культуры, выделенные от больных, были менее чувствительными (51,7 и 40,0% резистентных изолятов). !
К ванкомицину оказались чувствительными 82,3% стафилококков, что было несколько выше, чем в группе сравнения (75,0%о). Установлена высокая резистентность к доксициклину (64,6%), при этом количество промежуточных культур было также весьма незначительным (8,2%) (в контрольной группе 58,3 и 10,0% соответственно). Из данных указанной выше табл. следует, что процент стафилококков, резистентных к фторированным хинолонам (ципрофлоксацину и ле-вофлоксацину), составил 23,1 и 16,4%, тогда как в группе сравнения их было 40,0 и 25,0%. Нами, не было обнаружено различий по чувствительности тестируемых штаммов к фузидину и рифамштцину - 51,7 и 86,7%) (55,1 и 84,3%), в группе сравнения). Тогда как к левомицетину, линезолиду и ко-тримоксазолу стафилококки, колонизирующие больных, имели высокие показатели резистентности (84,4, 41,2 и 59,2%; 75,0, 31,7 и 55,0%о соответственно в группе сравнения). При анализе полирезистентности к антибактериальным препаратам было выявлено, что популяция стафилококков была представлена как штаммами, имеющими минимальный набор признаков, так и полирезистентными культурами. Более половины тестируемых изолятов (54,5%) имели от 5 до 7 признаков резистентности. При этом обнаруживались штаммы, имеющие большой набор факторов резистентности (10 - 11) -5,4%). . . ,
Распределение стафилококков, выделенных от лиц групп сравнения, по количеству маркеров резистентности представлено на рис. 6. Из данных рис. 6 следует, что в обеих группах кривая имеет вид нормального распределения, характерного для случайной, выборки. При этом достоверных различий по преобладанию в какой-либо группе более резистентных культур не прослеживается. Это дало основание заключить, что при поступлении больные заселены стафилококками, циркулирующими среди городских жителей. В первые дни пребывания в стационаре популяция стафилококков, колонизирующая больных, в целом имеет ту же структуру антибиотикорезистентно-сти, что и у здоровых людей, однако для отдельных препаратов, таких как эритромицин, линезолид, ко-тримоксазол, левомицетин, уже на этом э гапе пребывания наблюдаются более высокие уровни устойчивости.
Оценка маркеров резистентности показала значительную гетерогенность исходной популяции по признакам антибиотикочувс гвительности. Этот факт является предпосылкой для последующей селекции стафилококков по признакам антибиотикочувствительности с формированием госпитальных полирезистентных штаммов. Рост антропогенного воздействия на окружающую среду неизбежно накладывает отпечаток на экологию самых различных биологических объектов, начиная с высших растений и животных и заканчивая представителями микромира. В работах последних лет доказано, что из всех форм деградации среды в больших городах наиболее опасным является загрязнение атмосферного воздуха выбросами вредных веществ от стационарных источников промышленных предприятий и автотранспорта. Нами выдвинуто предположение о том, что антропогенные факторы территории проживания влияют на изменение механизмов агрессии потенциально патогенных микроорганизмов, одним из которых является способ-ность противостоять действию антибактериальных препаратов. Для подтверждения этой гипотезы нами проведено изучение чувствительности к антибиотикам 143 штаммов стафилококков, колонизирующих людей,лтроживающих в неравнозначной экологической обстановке. Распределение культур выглядело следующим образом: 103 - у лиц, проживающих в его южной части (1 группа); контрольную (II группу) составили 40 изолятов, полученных у лиц, проживающих в экологически благоприятной центральной части города. Анализ полученных данных показал, что абсолютное количество тестируемых культур оказались резистентными к пенициллину. Число умеренно резистентных штаммов также было невелико и варьировало от 1,9 на юге до 10,0% в центре города.
Анализ чувствительности стафилококков к ванкомицину показал, что штаммы, циркулирующие в южной части города, были наиболее чувствительными к препарату (29,1%). Минимальное количество было зарегистрировано в центральном топодеме (5,0%). Выявлено, что половина тестируемых культур стафилококков показала высокую устойчивость к линезолиду, который подавлял рост 53,4% изолятов, выделенных в южном топодеме, тогда как стафилококки, циркулирующие в центральной части города, в 95,5% случаев были резистентны к препарату. Резистентность изучаемых стафилококков к макролидам, аминогли-козидам, рифампицину и левомицетину представлена на рис. 7.
