Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Прорастание спор грибов 5-65
1.1. Эндогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов 6-9
1.2. Экзогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов 9-11
1.3. Механизмы прорастания спор грибов 11-18
ГЛАВА 2. Микробный антагонизм 18-24
ГЛАВА 3. Фитопатогенные микромицеты 24-50
3.1. Биология и экология грибов рода Fusarium 24-3 9
3.2. Биология и экология грибов рода Botrytis 39-46
3.3. Биология и экология грибов рода Bipolaris 46-50
ГЛАВА 4. Грибы рода trichoderma и биологический контроль 51-65
Глава5. Объекты иметоды 66-70
Глава 6. Ауторегуляция прорастания конидий микромицетов рода trrichoderma 71-79
Глава 7. Закономерности прорастания конидий фитопатогенных грибов 80-92
Глава 8. Влияние культуры т.longibrachiatumна прорастание конидий f.oxysporum. 93-97
Заключение 98-101
Выводы 102
Литература 103-122
- Эндогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов
- Экзогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов
- Биология и экология грибов рода Fusarium
- Биология и экология грибов рода Botrytis
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фитопатогенные микроорганизмы -постоянные спутники сельскохозяйственного производства. Значительная часть заболеваний вызывается разнообразными микромицетами. Преимущественное внимание фитопатологов уделяется биологии фитопатогенных грибов и механизмам поражения растений. Изучается и экология фитопатогенных популяций, но в этой области твердоустановленных данных накоплено все еще недостаточно. Между тем современное земледелие требует оптимизации борьбы с заболеваниями посевов, при этом критерии эффективности, экологической безопасности и рентабельности средств защиты растений входят друг с другом в противоречие. Для совершенствования методов подавления фитопатогенных микроорганизмов необходимо знать причины вспышки их численности на тех или иных субстратах, а для этого непременно надо изучать механизмы регуляции численности этих популяций.
Одним из перспективных методов профилактики заболеваний растений является применение живых препаратов микроорганизмов-антагонистов или конкурентов (Papavisas, 1985; Tronsmo, 1986). Этот метод позволяет минимизировать ущерб для окружающей среды и здоровья человека, уменьшая дозировки вносимых фунгицидов.
Промышленные штаммы рода Trichoderma широко используются в сельскохозяйственной практике для контроля размножения популяций патогенных грибов в почве, а также на семенах различных растений, в ризосфере и филлосфере (Tronsmo and Hjeljord, 1998). Рекомендуется также использовать культуры Trichoderma для сохранения убранного урожая (Chet, 1987; Papavizas, 1985; Tronsmo, 1986). Перед потребителем микробных препаратов встает ряд практических трудностей. Экономическая эффективность использования живого микробного препарата определяется вероятностью активной колонизации субстрата популяцией-интродуцентом. Конидии грибов рода Trichoderma чрезвычайно удобны для приготовления сухих препаратов, однако необходимо знать, какими факторами обусловливается прорастание конидий после внесения их в природное местообитание. Активно изучается влияние различных параметров внешней среды на поведение микробных популяций, однако в экологии значительную роль играет внутрипопуляционное взаимодействие. В литературе имеются указания на существование механизмов ауторегуляции процесса активизации покоящихся форм микроорганизмов (Robinson et al., 1989; Триггер и др., 1991; Хохлов, 1988). Но большая часть этих работ посвящена бактериям. В случае грибов информации еще недостаточно.
Логично было предположить, что подобная ауторегуляция свойственна различным видам микромицетов, как фитопатогенных, так и используемых для защиты от патогенов.
Целью настоящей работы является проверка характера внутрипопуляционной регуляции прорастания спор микромицетов и ее влияние на конкурентоспособность грибных популяций.
В задачи исследования входило:
1. Проверка наличия у разных видов грибов ауторегуляции прорастания конидий.
2. Изучение зависимости прорастания конидий этих грибов от популяционной плотности.
3. Установление различий в экологической стратегии между штаммами.
4. Изучение взаимовлияния конидий различных культур на процессы прорастания.
5. Установление влияния ауторегуляции на конкурентоспособность грибных популяций.
Научная новизна. Установлена зависимость прорастания конидий всех изученных культур микромицетов от плотности их популяции. Впервые разработаны и поставлены прямые эксперименты, моделирующие процессы взаимодействия фитопатогенов и культур рода Trichoderma, которые позволяют сделать заключение о типе их взаимодействия. Показано, что для культур рода Trichoderma межштаммовые различия в зависимости прорастания спор от расстояния между ними были более значимы, чем межвидовые. Впервые установлено, что микромицеты рода Fusarium (и, вероятно, большинство фитопатогенов) являются более активными колонизаторами пространства, чем микромицеты рода Trichoderma. В прямых экспериментах продемонстрировано, что при наложении ингибирующего воздействия культуры рода Trichoderma на культуру Fusarium oxysporum, ингибирование прорастания конидий рода Fusarium при высокой плотности популяции сглаживается, и напротив, проявляется кооперативный эффект.
Практическая значимость. Проведенные в работе эксперименты и установленные общеэкологические закономерности механизмов внутрипопуляционной регуляции прорастания конидий могут быть полезны при разработке рекомендаций по использованию культур микромицетов в сельскохозяйственной практике. На основе полученных данных можно рассчитать оптимальные дозы внесения микробных препаратов, таких как «Триходермин». Выявленные различия на штаммовом уровне во внутрипопуляционной регуляции прорастания конидий нужно учитывать при определении оптимальной дозы внесения. Показана значимость предпосевной инокуляции семян растений конидиями микромицетов, использующихся для биологического контроля развития фитопатогенов, что связано со скоростями прорастания конидий.
Эндогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов
Состояние покоя у спор может определяться как внутренними причинами (конститутивный покой), так и внешними (экзогенный). Конститутивный покой обусловлен как морфологическими, так и физиологическими особенностями. К морфологическим относятся, например, толстая, богатая хитином оболочка споры, как у Neurospora tetrasperma. Другой причиной конститутивного покоя может быть наличие в спорах внутренних ингибиторов. Для грибных спор аутоингибиторы -это весьма распространенное явление (Macko et al., 1976). Причем ингибирование может происходить исключительно на клеточном уровне, внутри самой споры, или же культура грибов может образовывать вещества, накопление которых задерживает рост этой культуры. Примерами первой группы служат: Peronospora tabacina, в конидиях которой находится аутоингибитор 5-шо-бутирокси-Р-ионон (киесон), ингибирующий синтез белка; в уредоспорах ржавчинных грибов Uromyces phaeseoU и Puccinia graminis - это метил- /ис-3,4-диметоксицинамат и метил-г/ис-ферулат, соответственно (Мирчинк, 1988, Macko et al., 1970). Ингибитор задерживает прорастание до тех пор, пока не удален из спор, например, при флоатации на воде (Allen, 1955).
Активные агенты - это либо непосредственно метаболиты-ингибиторы, либо вещества, оказывающие сигнальное воздействие, причем во втором случае видоспецифичность эффекта более вероятна. Аутоингибиторы активны в низких концентрациях и очень специфичны, но они не всегда имеют уникальное химическое строение. Это могут быть простые вещества, такие как сера для Promopsis viticola и железо для Colletotrichum muscae, низкомолекулярные, как триметиламин (Мирчинк, 1988; Тригер и др., 1991; Robinson et al., 1989).
При изучении вторичных метаболитов культуры Rhizopus stolonifer был обнаружен ингибитор прорастания спор, выделяющийся в среду (Stadler, 1952). Парк и Робинсон показали, что такие вещества образует большинство грибов и продемонстрировали споростатическое действие культуральных фильтров большого числа сапротрофных видов грибов (Park, Robinson, 1964). Изучение ингибирующих веществ, образуемых F. oxysporum и R. stolonifer привело к идентификации нескольких соединений, часть их них составляли летучие (Garrett, Robinson, 1969; Robinson, Park, 1966; Robinson et al., 1968; Robinson, Garrett, 1969).
У большинства эукариотических микроорганизмов споры плохо прорастают или не прорастают при высокой плотности клеток, а при низкой плотности прорастание эффективно (Хохлов, 1988; Hobot, Gull, 1980). Существует мнение, что торможение прорастания вызывают аутоингибиторы, которых недостаточно или которые вымываются водой или средой при малой концентрации (Hobot, Gull, 1980; Lingappa, Lingappa, 1966; Robinson, Park, 1966; Shephard, Handryk, 1962; Trinci, Whatteker, 1968).
Явление снижения прорастания спор при высокой плотности популяции известно уже давно (Edgerton, 1910) и получило различные интерпретации. Одно из возможных объяснений - голодание. Но простым опытом с добавлением достаточного количества доступных питательных веществ эту версию удалось исключить (Allen, 1976). По другой гипотезе в плотной популяции кислород быстро расходуется на дыхание спор и его концентрация падает ниже оптимальной (Doran, 1922). Этот фактор в некоторых случаях несомненно существенен для объяснения. При плотностях спор 106-107 клеток/мл и выше снижение концентрации кислорода можно считать вероятным фактором (Steele, 1973). Но при концентрации 10 спор/мл есть основания считать, что существуют другие факторы, помимо анаэробиоза (Триггер и др., 1991). Для многих видов грибов имеются прямые доказательства того, что основным фактором популяционного эффекта является поддержание определенного уровня ингибирующих веществ, выделяемых из спор. Некоторые аутоингибиторы выделены и идентифицированы. У ряда микроорганизмов (F. oxysporum, Cunninghomella elegans, Syncephalosporium racemosum и т.д.) роль ингибиторов прорастания играет пеларгоновая (нонановая) кислота. Она обнаруживается в выделениях прорастающих спор и подавляет их набухание и рост, если присутствует в составе питательных сред (Garrett, Robinson, 1969; Hobot, Gull, 1980). Существенно, что это метаболит не является видоспецифичным. Было выделено еще несколько веществ, претендующих на роль аутоингибитора, но в процедуре выделения использовались методы (хлороформ и другие вещества, влияющие на клетки), которые не позволяют считать выделенные регуляторы нативными (Garrett, Robinson, 1969; Hobot, Gull, 1980).
Конидии фитопатогенного дейтеромицета Colletotrichum gleosporidium прорастают в густой суспензии значительно хуже, чем в разбавленной. Это связано с образованием ингибитора. Вещество-ингибитор было выделено в чистом виде и названо глеоспорином (Meyer et al.,1983).
Изучение прорастания артроспор у Geotrichum candidum показало существенное снижение процента проросших спор (от 100 до 30%) с увеличением их концентрации. При детальном исследовании выяснилось, что концентрированная суспензия спор G. candidum образует летучий аутоингибитор - триметиламин. Причем даже 1 мкг его, введенный в чашку Петри с низким содержанием артроспор, задерживает их прорастание на несколько часов (Robinson et al., 1989).
Экзогенные факторы, влияющие на прорастание спор грибов
Для успешного развития споры, как агента размножения, важно, чтобы она была запрограммирована начинать рост в благоприятных условиях и оставаться в покое при неблагоприятных (Allen, 1976).
Многие споры грибов прорастают просто в воде, т.е. уже содержат достаточный запас питательных веществ, другим требуется источники углерода и азота, соли и витамины. Некоторые споры грибов требуют для прорастания специфических веществ, например, споры Memnoniella echinata нуждаются в биотине, а споры миксомицета Dictiostellum discoideum прорастают при добавлении смеси аминокислот: триптофана, фенилаланина, метионина. Возможно, эти вещества активируют метаболические пути, позволяющие спорам прорастать (Мирчинк, 1988). Ряд грибов прорастает только на определенном субстрате, например, на целлюлозе. Известно, что грибы близких родов Bipolaris и Curvularia лучше спорулируют на прдложке из бумаги, чем на агаре (Pratt, 2006).
Другими факторами внешней среды, способными лимитировать прорастание, являются влажность, температура, рН среды, концентрация Ог и СОг, наличие токсинов (в том числе антибиотиков, выделяемых грибами и бактериями) в среде (Мирчинк, 1988).
Хламидоспоры Fusarium oxysporum, инкубируемые в условиях температурного стресса (45-50С 6-72 ч), теряют много углерода в виде СОг. Потом мицелий, выращенный из этих спор, менее жизнеспособен и обладает менее выраженными патогенными свойствами (Arora et al., 1995).
На прорастание спор почвенных грибов, как считают некоторые авторы, значительное влияние оказывает фунгистатический эффект (Dobbs, Hinson, 1953) и перекрывающее фунгистазис совместное действие корней растений и органического вещества (Мирчинк, 1988; Lockwood, 1964). Совокупность этих факторов создает внешний контроль, который играет важную роль в адаптации почвенных грибов к условиям внешний среды. Смит считает одной из возможных причин фунгистазиса действие этилена, который выделяет почвенная микрофлора (Smith, 1973). Он обнаружил корреляцию между фунгистатической активностью почв и содержащегося в низ этилена. Но неясно, прямое ли это действие, т.к. известно, что этилен часто является стимулятором, а не ингибитором прорастания спор грибов (Drew, Lynch, 1980).
Известно, что фунгистазис воссоздается в предварительно простерилизованной почве при инокуляции ее почвенными грибами. Этот процесс сопровождается накоплением ацетальдегида, н-пропана, н-пеларгоновой кислоты до уровня, способного вызывать ингибирование. Непосредственное добавление их в почву в таких же концентрациях приводит к аналогичному эффекту (Garrett, 1972).
В тестах, демонстрирующих фунгистазис, используется такая плотность популяции спор, что уже может играть роль фактор аутоингибирования (Триггер и др., 1991; Griffin, Ford, 1974). Например, споры F. solani var phaseol при плотности 5-Ю6 клеток/г не прорастали, а при плотности 3-Ю3 прорастали почти все. Таким образом, остается неясным, является ли фунгистазис примером экзогенного покоя и обусловлен тем, что в процессе жизнедеятельности или в ходе антибиотических взаимодействий почвенные грибы выделяют вещества, токсичные для спор, или же это пример эндогенного покоя под действием аутоингибиторов, выделяемых в среду. Весьма вероятно, что in situ наблюдается комбинация факторов.
Биология и экология грибов рода Fusarium
У многих видов рода Fusarium имеются только конидиальные спороношения и отсутствует половая стадия. (У других известны телеоморфы). Конидиальное спороношение у фузариев чрезвычайно разнообразно по морфологии и способу образования конидий, имеются макро- и микроконидии. Макроконидии образуются в воздушном мицелии на простых или ветвящихся конидиеносцах, или представляют собой скопления массы конидиеносцев в виде спородохиев, или образуют пионноты. Макроконидии большей частью с 3-5 перегородками, реже с 6-9, веретеновидные, веретеновидно-серповидные, серповидные, реже ланцетовидные. У основания конидий имеется четко или слабовыраженная ножка, или конидии лишены ее. Верхняя клетка макроконидий имеет характерную форму: она удлиненная или заостренная, может быть тупая или клювовидная и другой формы. В массе макроконидии светлоокрашенные (бело-охряные, охряно-розовые, оранжевые, синие, сине-зеленые).
Микроконидии образуются обычно в воздушном мицелии на простых или сложных конидиеносцах, в цепочках или собраны в головки, а также часто в виде скоплений между гифами мицелия. Конидии одноклеточные, реже с одной и еще реже с 2-3 перегородками, обычно овальные, яйцевидные, эллипсовидные, реже шаровидные, грушевидные и веретеновидные (Тахтаджян, 1991).
Кроме того, у отдельных видов рода Fusarium в мицелии (а иногда в конидиях) образуются хламидоспоры — одноклеточные части гиф, обособляющиеся от остальных клеток толстой оболочкой. Они обычно бесцветные, реже окрашены в охряно-коричневые тона, могут быть единичные или собраны в узлы, иногда в виде цепочек (Тахтаджян, 1991). Например, изоляты F. solani f. sp. glycines, вызывающие синдром внезапной гибели сои, продуцируют хламидоспоры из макроконидий латерально и терминально. Хламидоспоры также могут формироваться на прорастающих микроконидиях и гифах гриба. Иногда макроконидия образует несколько хламидоспор. Их число зависит от изолята и температуры инкубирования. Максимальное количество хламидоспор формируется при 30С, а минимальное - при 4С. Чаще всего они одноядерны (Shuxian et al., 1998).
В некоторых случаях у этих грибов образуются склероции — тесное скопление гиф роговидной консистенции беловатого, желтоватого, коричневого или синего цвета. Развиваются они чаще всего в тканях субстрата или в почве и служат у этих грибов, как и хламидоспоры, для перезимовки и перенесения неблагоприятных условий, способствуя тем самым сохранению вида. Мицелий у этих грибов чаще белый, бело-розовый, розово-сиреневый или бурый
Грибы рода Fusarium широко распространены в природе. Обладая большим разнообразием ферментов, они способны разрушать многие органические соединения. Отдельные виды обладают свойством синтезировать различные биологически активные вещества (например, витамины, антибиотики и токсины). Грибы этого рода развиваются преимущественно в почве, однако могут существовать на различных растительных и животных субстратах в воде и других местах обитания (Cherif, Benhamou, 1990; Toyota et al., 1994).
Грибы рода Fusarium сохраняются в почве, на растительных остатках, а частично и в самих растениях в виде мицелия, хламидоспор, а в случае наличия сумчатой стадии — в виде перитециев. Конидии этого гриба могут переноситься водой, насекомыми, орудиями производства и воздушными течениями. Лучшее развитие грибов из рода Fusarium, как и многих других, происходит при повышенной влажности воздуха и почвы. Немаловажным фактором для их существования является также тепло. Сочетание необходимой температуры и влажности обусловливает массовое развитие этих грибов (Toyota et al., 1994).
Род Fusarium в целом представляет обширную биологически неоднородную группу грибов. Среди них есть и достаточно выраженные паразиты растений, и группы полупаразитов, способных поражать только ослабленные организмы, и сапротрофы, живущие на растительных остатках, в почве и на отмерших частях растений. Известны виды, паразитирующие на насекомых, а также вызывающие микозы и токсикозы человека и теплокровных животных (Wadhwani, Srivastava, 1984).
Большинство грибов этого рода — фитотрофы. Грибы одного вида могут поражать растения из самых разнообразных семейств, вызывая у них различные патологические явления — гниль корней, семян, плодов, а также общее угнетение и преждевременное увядание. Тип проявления болезни зависит, с одной стороны, от видовой принадлежности патогенов, а с другой, от экологических условий, в которых они развивались. К наиболее распространенным фузариозным заболеваниям относятся гниль корней и трахеомикозное сосудистое увядание растений.
Биология и экология грибов рода Botrytis
Грибы, относящиеся к роду Botrytis, паразитируют на различных частях растений, вызывая серую гниль. При этом Botrytis образует обильный серый налет, состоящий из мицелия и бесцветных или слабодымчатых одноклеточных конидий, размером примерно около 10 мкм. У многих видов есть также склероции. После перезимовки они либо прорастают в мицелий, либо, у некоторых форм, развиваются в плодовые тела — апотеции. Телеоморфа относится к аскомицетам, группе порядков дискомицеты (Горленко, 1981).
Возбудитель серой гнили — космополит, паразитирующий на разных растениях, относящихся к 45 семействам, растущих в большинстве районов земного шара. Но, вероятно, в составе популяции этого вида гриба существуют формы или расы, преимущественно поражающие какой-то определенный вид растений, а может быть, приуроченные к той или иной климатической зоне. Эволюция в данном случае, видимо, идет по пути сужения специализации. Только некоторые формы возбудителя серой гнили образуют телеоморфу (Дьяков и др., 2001).
Центральное место в роде Botrytis занимает вид В. cinerea, поражающий многие растения в умеренном и холодном климате. Особенно опасны серая гниль ягод винограда и земляники, кагатная гниль, поражающая сахарную свеклу во время хранения в кагатах, серая гниль кочанов капусты, стеблевая гниль гречихи, конопли и ряда других растений, гниль плодов тыквенных растений, фасоли, яблок, киви и других. При высокой влажности этот гриб вызывает серую гниль цветков многих декоративных растений — пионов, гладиолусов и других, особенно при выращивании цветов в оранжереях (Elad, Evenses, 1995; El-Ghaouth et al., 1998; Kapat et al., 1998; Kohl et al., 1999; Tronsmo, Hjeljord, 1989; Vicedo et al., 2006).
Чтобы вызвать некроз живых тканей растения, Botrytis должен сначала поселиться на участке уже отмершей ткани. Выделяя токсины, гриб отравляет соседние живые клетки, затем проникает туда и использует их для своего питания, отравляя следующую группу расположенных рядом живых клеток, постепенно захватывая все новые и новые живые ткани (Kohletal., 1999).
В. сіпегеа - один из самых страшных возбудителей болезней винограда. Поражение серой гнилью начинается уже весной с развитием гриба на отмерших частях цветка (тычинки и т. п.), отмерших участках листовой пластинки, погибших усиках и т. п. Через некоторое время гриб переходит на живые ткани (Tronsmo, Hjeljord, 1989).
Серая гниль широко распространена почти во всех районах виноградарства. Для борьбы с ней применяют опрыскивание виноградников химикатами. В Молдавии выведены сорта винограда, устойчивые к серой гнили. При условии немассовости заболевания, гриб-антагонист Trichoderma harzianum успешно применяется для подавления В. сіпегеа в Италии, Израиле и США.
Для эффективного контроля над В. сіпегеа обычно используют обработку растений и почвы различными химикатами, что не может не отражаться на экологическом равновесии и качестве продукции, и этих мер не всегда достаточно, т.к. постепенно возникают фунгицидоустойчивые штаммы (Vicedo et al., 2006; Lamondia, Douglas, 1997). Использование малотоксичных природных веществ является современной альтернативой синтетическим фунгицидам для борьбы с серой гнилью при обработке урожая до и после уборки. Известно, что растения выделяют некоторые вещества с противогрибными свойствами, например, терпеноиды, азотсодержащие, ароматические и ряд алифатических соединений (Vicedo et al., 2006; Osbourn, 1996). Обнаружено, что этиловый эфир адипиновой кислоты в не фитотоксичных концентрациях ингибирует прорастание спор и рост мицелия В. сіпегеа (Vicedo et al., 2006). Одно из наиболее изученных веществ - транс-ресверантол (3,5,4,-тригидроксистилбен), образуемый Виноградовыми. Его воздействие приводит к цитологическим изменениям: образованию дополнительных ростковых трубок, грануляции цитоплазмы, ретракции на кончиках гиф и загибанию ростковых трубок (Adrian et al, 1997). Обработка ресверантолом поверхности собранного винограда и яблок помогает сохранить урожай (Gonzalez-Urena et al., 2003).
У В. С/яегаэюбнаружены 2 гена устойчивости к фунгицидам: обеспечивающие низкую и высокую устойчивость. Действие их до конца неясно. Но очевидно, что устойчивость к разным фунгицидам обеспечивается разными генами (Pollastro et al., 1996).
Для успешной борьбы важно время обработки. Наибольший эффект наблюдался при обработке в период от цветения и до трех недель перед сбором урожая. Однако подавление происходило и при опрыскивании в начале цветения. Максимальный контроль над заболеванием достигается при совместном использовании агентов биоконтроля, например, грибов Trichoderma spp., и малых доз фунгицидов (Kohl et al., 1999; Tronsmo, Hjeljord, 1989).
