Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика полигонов ТБО 11
1.1. Продукция, состав и утилизация ТБО в России 11
1.2. Характеристика микробных процессов на полигонах ТБО 13
1.3. Эмиссия метана с поверхности полигонов ТБО 16
Глава 2. Метанотрофные бактерии 19
2.1. Классификация и общая характеристика метанотрофных бактерий 19
2.2. Биохимические особенности окисления метана метанотрофными бактериями 22
2.3. Экология метанотрофных бактерий 25
Глава 3. Метанокисляющая активность покрывающей почвы полигонов ТБО 26
3.1. Измерение метанокисляющей активности покрывающей почвы 26
3.1.1. Измерение окисления метана in situ 26
3.1.2. Измерение окисления метана ex situ 29
3.2. Влияние факторов окружающей среды на метанокисляющую активность покрывающей почвы 32
3.2.1. Температура 32
3.2.2. Влажность 36
3.2.3. Концентрация субстратов метанотрофного роста 38
3.2.4. Соединения азота 42
3.2.5. Летучие органические соединения 44
3.2.6. Состав покрывающей почвы 46
3.2.7. Кислотная реакция среды (рН) 48
3.2.8. Растительный покров 49
3.3. Способы снижения эмиссии метана с поверхности полигонов ТБО 50
Глава 4. Численность и состав метанотрофной популяции покрывающей почвы полигонов ТБО 51
4.1. Оценка численности и выделение метанотрофов с помощью методов культивирования 52
4.2. Исследование метанотрофной популяции с помощью анализа состава клеточных жирных кислот 54
4.3. Оценка численности и видового состава метанотрофной популяции методом непрямой иммунофлуоресценции 55
4.4. Количественная идентификация метанотрофов методом флуоресцентной in situ гибридизации 56
4.5. Исследование биоразнообразия метанотрофов методами, основанными на использовании ПЦР 59
Глава 5. Объект и методы исследования 62
5.1. Объект исследования 62
5.2. Определение эмиссии метана 65
5.3. Определение состава порового газа по разрезу покрывающей почвы 65
5.4. Определение физических характеристик покрывающей почвы 66
5.5. Отбор образцов покрывающей почвы 67
5.6. Метод газоадсорбционной хроматографии 67
5.7. Определение метанокисляющей активности покрывающей почвы 68
5.8. Определение численности метанотрофных бактерий 68
5.8.1. Метод предельных разведений 68
5.8.2. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (CARD-FISH) 70
5.9. Выделение накопительных культур метанотрофных бактерий 72
5.10. Определение морфологии клеток микроорганизмов 72
5.11. Идентификация метанотрофных бактерий 72
5.11.1. Метод непрямой иммунофлуоресценции 72
5.11.2. Методы, основанные на использовании ПЦР 74
5.11.2.1. ДНК-экстракция 74
5.11.2.2. ПЦР-амплификация 75
5.11.2.3. Разделение ПЦР-продуктов методом DGGE 77
5.11.2.4. Секвенирование ДНК-фрагментов 78
5.12. Разработка способа снижения эмиссии метана при помощи интродукции
консорциума метанотрофных бактерий 80
Глава 6. Эмиссия метана с поверхности полигона «хметьево» 81
Глава 7. Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона «хметьево» 86
7.1. Влияние факторов окружающей среды на метанокисляющую активность покрывающей почвы 86
7.2. Метанокисляющая активность покрывающей почвы 91
7.3. Сезонные изменения метанокисляющей активности покрывающей почвы 94
7.4. Зависимость метанокисляющей активности покрывающей почвы от температуры инкубации 96
Глава 8. Численность метанотрофов в покрывающей почве полигона «хметьево» 97
8.1. Численность культивируемых метанотрофов 97
8.2. Сезонная динамика численности культивируемых метанотрофов 99
8.3. Сезонная динамика численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ 101
Глава 9. Биоразнообразие культивируемых метанотрофов в покрывающей почве полигона «хметьево» 105
9.1. Идентификация метанотрофных бактерий методом непрямой иммунофлуоресценции 105
9.2. Идентификация метанотрофных бактерий молекулярными методами 106
9.2.1. ПЦР-амплификация образцов ДНК с метанотрофными и универсальными бактериальными праймерами 108
9.2.2. Разделение ДНК-фрагментов методом DGGE 110
9.2.3. Видовой состав бактериальной популяции в накопительных культурах 113
9.2.4. Молекулярный анализ культуры cs20-4 116
9.2.5. Молекулярный анализ образцов покрывающей почвы 118
Глава 10. Снижение эмиссии метана с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции консорциума метанотрофных бактерий 120
Заключение 123
- Характеристика микробных процессов на полигонах ТБО
- Биохимические особенности окисления метана метанотрофными бактериями
- Измерение окисления метана ex situ
- Оценка численности и выделение метанотрофов с помощью методов культивирования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Интерес к изучению микробиологии цикла метана обусловлен тем, что метан является конечным продуктом микробного разложения органического вещества в анаэробных условиях и одним из наиболее опасных парниковых газов. Содержание метана в атмосфере ежегодно возрастает в среднем на 1% за счет дисбаланса между его продукцией и окислением (Заварзин и Кларк, 1987; Blake and Rowland, 1988; Galchenko et al., 1989; IPCC, 2001). Большой вклад в изучение микробных процессов цикла метана принадлежит институту микробиологии им. С.Н. Виноградского, где проводятся комплексные исследования водных (Гальченко, 1995, 2006; Иванов и др., 2001; Ivanov and Lein, 2003, 2006; Пименов, 2004, Пименов и Гальченко, 2006), наземных (Заварзин, 1995; Заварзин и Васильева, 1999, Дедыш, 2004; Коцюрбенко, 2004; Кравченко и Быкова, 2004) и антропогенных (Zavarzin and Nozhevnikova, 1993; Кожевникова, 1994, 1995; Иванов, 2004) экосистем. Среди антропогенных местообитаний важным источником атмосферного метана являются полигоны захоронения твердых бытовых отходов (ТБО), вклад которых в глобальную эмиссию метана составляет 6-12% (IPCC, 2001). В России проблема утилизации ТБО приобрела угрожающие масштабы. В отличие от развитых стран запада, в нашей стране не используется раздельный сбор ТБО, лишь незначительная часть отходов подвергается предварительной механической обработке (прессованию). Не производится сортировка отходов и реутилизация бумаги, металлов, стекла и пластиков, а также отдельная обработка органической фракции отходов с получением компостов. Основным способом утилизации ТБО в России является их захоронение на специальных полигонах, общая площадь которых превышает 40 тыс. га. и ежегодно увеличивается на 2.5-4%. Однако большинство российских полигонов ТБО не соответствует современным нормам организации санитарных полигонов и оказывает негативное воздействие на окружающую среду и здоровье населения (Сборник докладов 4-го Международного конгресса по управлению отходами «ВейсТек», 2005). Полигоны ТБО загрязняют прилежащие почвы и грунты, грунтовые воды и атмосферу тяжелыми металлами и другими токсичными соединениями, включая газообразные и летучие вещества. Помимо отрицательного влияния локального характера, полигоны ТБО являются источником парниковых газов, главным образом СЩ и СОг. При отсутствии систем сбора биогаза, для уменьшения эмиссии метана с поверхности полигонов ТБО чрезвычайно важно его микробное окисление в аэробном покрывающем отходы слое антропогенной почвы, где
развивается плотная популяция метанотрофных бактерий (Whalen et al., 1990; Nozhevnikova et al., 1993a, b; Nozhevnikova and Lebedev, 1995; Bogner et al., 1997a).
Метанотрофные бактерии (метанотрофы) представляют собой уникальную группу микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана в качестве единственного источника углерода и энергии. Метанотрофные бактерии выделены из различных почв, водной толщи озер и морей, болот, горячих источников, антарктических местообитаний, ризосферы растений и органов морских беспозвоночных животных (Hanson and Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Гальченко и Пименов, 2006). Высокая активность метанотрофной популяции обнаружена в покрывающей почве полигонов ТБО (Ножевникова и др., 1993; Jones and Nedwell, 1993; Nozhevnikova et al., 2003a). В отличие от анаэробного микробного сообщества, функционирующего в толще отходов, где температура постоянна, жизнедеятельность метанотрофных бактерий покрывающей почвы существенно зависит от климатических условий. Исследования активности, плотности и состава метанотрофной популяции в холодные и теплые сезоны года особенно важны для полигонов ТБО, расположенных в умеренной климатической зоне России, для которой характерны выраженные сезонные колебания температуры и длительная холодная зима. Изучение влияния факторов окружающей среды на плотность и состав метанотрофной популяции и создание условий, необходимых для максимальной активности метанотрофных бактерий, важно для разработки способов снижения эмиссии метана с поверхности российских полигонов ТБО.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось изучение аэробного окисления метана в покрывающей почве полигона ТБО.
Конкретные задачи исследования включали:
Изучение сезонной динамики эмиссии и аэробного окисления метана, активности и численности метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО.
Выделение накопительных культур метанотрофных бактерий из образцов покрывающей почвы при разных температурах и концентрациях метана.
Изучение биоразнообразия культивируемых метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО.
Разработку способа снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые проведено комплексное сезонное исследование эмиссии и аэробного окисления метана, численности и состава метанотрофной популяции покрывающей почвы полигона ТБО. Зафиксирована крайняя неоднородность потоков метана с поверхности полигона. Показана зависимость эмиссии метана от возраста участка полигона и сезона года. Выявлена обратная зависимость между сезонными изменениями эмиссии метана и метанокисляющей активностью покрывающей почвы. Впервые использован метод CARD-FISH для анализа численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ. Применение данного метода позволило выявить высокую численность метанотрофов, которую не удавалось обнаружить ранее с помощью традиционных методов культивирования. Показан значительный вклад метанотрофов в общую численность бактериальной популяции покрывающей почвы, что может свидетельствовать о важной роли этих бактерий не только в окислении метана, но и в почвообразовании. Сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило исследовать видовой состав метанотрофной популяции покрывающей почвы. Впервые в покрывающей почве полигона ТБО, наряду с известными мезофильными метанотрофами, идентифицированы метанотрофы, близкородственные ацидофильным видам, выделенным из кислых сфагновых болот, психротолерантным видам, выделенным из арктических болотных почв, и термотолерантному виду, выделенному из активного ила очистных сооружений. Эти данные расширяют представление об экологии и распространении метанотрофных бактерий в природе. Результаты работы могут быть использованы при выборе и создании технологий рекультивации полигонов ТБО. Получен патент на способ снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО путем интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на конференциях: "Workshop on Sustainable Landfill Management" (2003); 4-м Международном конгрессе по управлению отходами «ВейстТэк» (2005); "International Conference on Arctic Microbiology" (2004); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология Микробов» (2004); 7l FAO/SREN-WORKSHOP "The future of biogas for sustainable energy production in Europe" (2005); 1-ой Всероссийской и И-ой Международной молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (2005, 2006).
Место проведения работы
Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Молекулярно-биологические исследования проведены на кафедрах науки об окружающей среде и молекулярной биологии факультета биологии и науки об окружающей среде Университета г. Ювяскюля (Финляндия) и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. А.Н. Ножевниковой за общее научное руководство, предоставленную возможность работы за рубежом, помощь в обсуждении результатов и редактирование диссертации и благодарит сотрудников ИНМИ РАН к.б.н. М.В. Кевбрину и В.К. Некрасову за иммунофлуоресцентный анализ накопительных культур метанотрофов и помощь в лабораторных исследованиях, М.В. Глаголева, Н.А. Шнырева, к.б.н. М.В. Чистотина и к.б.н. А.С. Саввичева за помощь в полевых работах, сотрудников кабинета газохроматографического анализа ИНМИ РАН, сотрудника кафедры физики и мелиорации почв факультета почвоведения МГУ д.б.н. А.В. Смагина, директора полигона ТБО «Хметьево» В.Э. Эвальда и зарубежных партнеров: д-ра, проф. Ю. Ринтала, д-ра, проф. М. Куломаа, д-ра Г. Юргенса и Л. Монтонен. Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории антропогенных мест обитания за внимание, всестороннюю поддержку и участие в этой работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов INCO-Copernicus (ICA2-CT-2001-10001 А/144168), правительства г. Москвы (договор № 12-Э/04), РАН (проект №3 безвалютного обмена между РАН и АН Финляндии) и АН Финляндии (№214719).
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 18 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 202 наименований.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (3 экспериментальные статьи, 1 глава в монографии, 1 патент, 3 статьи в сборниках материалов международных конференций и 5 тезисов).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
Экспериментальные статьи;
А.Ю. Каллистова, М.В. Кевбрина, В.К. Некрасова, М.В. Глаголев, М.И. Серебряная, А.Н. Ножевникова. Окисление метана в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов II Микробиология. 2005. Т. 74(5). С. 699-706.
А.Ю. Каллистова, М.В. Глаголев, Н.А. Шнырев, М.В. Кевбрина, В.К. Некрасова, М.В. Чистотин, Е.В. Фаустова, М.И. Серебряная, А.Н. Ножевникова. Эмиссия метана с поверхности полигона захоронения твердых бытовых отходов в зависимости от возраста полигона и от сезона года IIЖ. Эколог. Химии. 2006. Т. 15(1). С. 13-21.
A. Yu. Kallistova, М. V. Kevbrina, V. К. Nekrasova, N. A. Shnyrev, J-K. М. Einola, M.S. Kulomaa, J.A. Rintala and A.N. Nozhevnikova. Enumeration of methanotrophic bacteria in the cover soil of an aged municipal landfill II Microbial Ecology. 2007. (published on-line).
Главы в монографиях:
4. А.Н. Ножевникова, А.Ю. Каллистова, М.В. Кевбрина. Эмиссия и окисление метана
на полигоне захоронения твердых бытовых отходов: сезонные измерения // Труды
Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII.
С. 172-192.
Патент:
5. Гальченко В. Ф., Гонопольский А. М., Каллистова А. Ю., Кевбрина М. В.,
Мурашов В.Е., Некрасова В.К., Новицкий И.Ю., Ножевникова А.Н., Пименов Н.В.,
Саввичев А.С., Серебряная М.И. Способ обработки рекультивируемых полигонов
твердых бытовых отходов и свалок. Решение о выдаче патента РФ на изобретение
по заявке №2005113259 принято 20.06.2006.
Статьи сборниках материалов конференций:
A. Nozhevnikova, A. Kallistova, М. Kevbrina, М. Glagolev, V. Nekrasova, V. Lebedev, J. Einola, К. Sormunen, and J. Rintala. Oxidation of methane in landfills located in cold climate zone: geochemical and microbiological studies II In: Proc. of Workshop on Sustainable Landfill Management. - Chennai, India, 3-5 December 2003. P. 183-190.
A.N. Nozhevnikova, A.Yu. Kallistova, A.S. Savvichev, M.V. Kebrina, V.K. Nekrasova, V.E. Murashov, M.V. Serebryanaya, I.Yu. Novitskiy. Mitigation of methane emission from
landfills by microbial methane oxidation II In: Proc. of Г FAO/SREN-WORKSHOP "The future of biogas for sustainable energy production in Europe". - Uppsala, Sweden, 30 November-2 December 2005. P. 16-23.
8. Kallistova A.Yu., Kevbrina M.V., Einola J-K.M., Kulomaa M.S., Rintala J.A. and
Nozhevnikova A.N. Quantitative identification of methanotrophic bacteria in the cover soil
of an aged municipal landfill II In: Proc. of 7th FAO/SREN-WORKSHOP "The future of
biogas for sustainable energy production in Europe". - Uppsala, Sweden, 30 November-2
December 2005. P. 180-184.
Тезисы конференций:
A. Kallistova. M. Kevbrina, V. Nekrasova, A. Nozhevnikova. Density and activity of methanotrophic bacteria in landfill cover soil: comparison of hot and cold seasons II International Conference on Arctic Microbiology. - Rovaniemi, Finland, 22-25 March 2004. P. 75.
Каллистова А.Ю., Кевбрина M.B., Некрасова B.K., Глаголев М.В., Чистотин М.В., Шнырев Н.А., Ножевникова А.Н. Сезонная динамика микробного окисления метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов // Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов».- Москва, 21-24 октября, 2004. С. 41.
Ножевникова А.Н., Саввичев С.А., Каллистова А.Ю., Кевбрина М.В., Мурашов В.Е., Серебряная М.И., Новицкий И.Ю. Активация микробного образования и окисления метана на полигонах твердых бытовых отходов (ТБО) // 4-й Международный конгресс по управлению отходами «ВейстТэк-2005».- Москва, 31 мая -3 июня 2005. С. 239-240.
Каллистова А.Ю., Ейнола Ю., Ножевникова А.Н. 2005. Количественная идентификация метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов методом флуоресцентной in situ гибридизации // Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». -Москва, 1-3 ноября 2005. С. 34-35.
А.Ю. Каллистова, Г. Юргенс, Л. Монтонен, У. Мюнстер, А. Н. Ножевникова. Биоразнообразие метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО // 11-ая Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». -Москва, 1-3 ноября 2006. С. 60-61.
Характеристика микробных процессов на полигонах ТБО
Средняя плотность ТБО в местах их сбора составляет 140-180 кг м"3, но при специальном механическом уплотнении она увеличивается до 600-800 кг м"3. Тем не менее, толща отходов имеет относительно высокую пористость (объем пустот в 1 кг отходов может достигать 0.6-0.7 л). Именно пористое сложение полигонов и большое количество доступного микроорганизмам органического вещества создают предпосылки для активного развития микробных процессов в толще отходов. Сформировавшийся полигон ТБО представляет собой аналог промышленного твердофазного ферментера геологического масштаба, в котором спонтанно формируется микробное сообщество, осуществляющее деградацию захороненных органических веществ. Толщу такого ферментера по вертикали условно можно разделить на зоны, отличающиеся по характеру микробиологических процессов: аэробную, микроаэрофильную и анаэробную (рис. 1).
Аэробная зона полигона (покрывающая почва и верхний слой отходов) служит геохимическим барьером на пути проникновения атмосферного кислорода в нижние слои отходов и газообразных продуктов, образующихся в анаэробной зоне полигона, в атмосферу. В покрывающей почве происходит окисление метана и других восстановленных газов и летучих продуктов, образующихся в теле полигона. В верхнем слое отходов, куда возможен доступ кислорода, органическое вещество ТБО подвергается микробному окислению до СОг, Н2О, NO3", SO42" и ряда других соединений. Непосредственно под аэробной зоной располагается маломощная зона с переходным окислительно-восстановительным режимом. Основными микробиологическими процессами в этой зоне считаются разложение органических веществ в микроаэрофильных условиях (компостирование) и денитрификация (Горбатюк и др., 1989).
Основной объем полигона занимает наиболее мощная анаэробная зона, где органическое вещество отходов разлагается метаногенным микробным сообществом. Скорость разложения органического вещества, количественный и качественный состав метаногенного сообщества зависят от состава ТБО и условий, которые создаются в системе. Анаэробное разложение органического вещества в природных и антропогенных местообитаниях представляет собой сложный процесс с множеством симбиотических связей между различными группами микроорганизмов, когда продукты жизнедеятельности одних являются субстратами для других. Благодаря этому, биоценоз способен менять используемые им пути разложения органического вещества и функционировать как саморегулирующаяся система, поддерживающая значения рН, окислительно-восстановительного потенциала и других факторов среды. Основными группами микроорганизмов, последовательно осуществляющих стадии анаэробного разложения органического вещества, являются гидролитики, бродилыцики, синтрофы (ацетогены) и метаногены (Заварзин, 1986). Активные метангенерирующие зоны могут находиться в разных местах толщи отходов, однако максимальная метаногенная активность наиболее часто приурочена к верхнему слою анаэробной зоны полигона ТБО (Ножевникова и др., 1993). В образцах грунта, отобранных на разных подмосковных полигонах ТБО, максимальная интенсивность метаногенеза наблюдалась при температуре 35-40С, т.е. метаногенная популяция была представлена мезофильными видами. На крупных полигонах ТБО температура окружающей среды не оказывает существенного влияния на процессы образования метана, т.к. она относительно постоянна в анаэробной зоне полигона и колеблется от 25 до 35С, иногда достигая 50-55С. Однако образование метана может происходить и при пониженных температурах 5-6С (Ножевникова и др., 1993; Ножевникова, 1995; Nozhevnikova and Lebedev, 1995). В отличие от температуры, влажность грунта является важным фактором, контролирующим образование метана на полигонах ТБО. С увеличением влажности увеличивается скорость метаногенеза в анаэробной зоне полигона (Ножевникова и др., 1989; Bogner and Spokas, 1993). В очагах активного метаногенеза развивается разнообразная по составу популяции метаногенных архей. В накопительных культурах, выделенных из грунта подмосковных полигонов ТБО на ацетате, метаноле и метиламине, наблюдался рост представителей родов Methanosarcina и Methanothx {Methanosaeta). При использовании в качестве субстратов формиата и смеси Н2/СО2 развивались представители рода Methanobacterium (Ножевникова и др., 1993). На различных полигонах ТБО идентифицированы ацетокластические, гидрогенотрофные и формиат-использующие метаногены, отнесенные к родам Methanoculleus, Methanofollis, Methanosaeta, Methanobacterium, Methanosarcina и др. (Luton et al., 2002; Uz et al., 2003; Могу et al., 2003; Chen et al., 2003). В анаэробной зоне полигона наряду с метаногенезом может происходить сульфатредукция. Однако для подмосковных полигонов ТБО характерно довольно низкое содержание сульфата, редко превышающее 0.5 г л"1 фильтрационных вод (личатов), которые выделяются из толщи полигона вследствие уплотнения отходов, выпадения атмосферных осадков и потоков грунтовых вод. Личаты содержат разнообразные промежуточные органические продукты разложения, тяжелые металлы и другие токсичные микрозагрязнения. Личаты полигонов ТБО могут быть охарактеризованы как сточные воды с высоким ХПК и содержанием азота (Kalyuzhnyi et al., 2003). В отличие от развитых стран запада, в России до настоящего времени не применяется специальная обработка личатов. Иногда часть личатов возвращается в залежь отходов или собирается в пруды-испарители. Основное же их количество инфильтруется в почву, грунты и водоемы.
На полигонах ТБО образуется широкий спектр газообразных соединений, основным из которых является биогаз. Биогаз преимущественно состоит из CRj (40-60%) и СОг (30-45%), нескольких процентов N2, а также большого количества микропримесей. В биогазе идентифицировано присутствие NH3, H2S, оксидов азота, нормальных, изоциклических, циклических (до СЮ), галогенсодержащих и ароматических углеводородов, карбонильных и серосодержащих органических веществ, сложных органоминеральных комплексов, в том числе, содержащих тяжелые металлы и т.д. По своему составу биогаз не имеет аналогов среди газовых смесей, образуемых природными геологическими и биокостными телами. Активное газообразование на полигоне ТБО начинается после его закрытия, обычно через несколько лет, когда сформировался сбалансированный метаногенез, и продолжается на протяжении 20-30 лет, постепенно затухая (Горбатюк и др., 1989; Ножевникова и др., 1993; Ножевникова, 1995; Ward et al., 1996; Pohland and Kim, 2000; Schuetz et al., 2003).
Несмотря на то, что СОг и ( образуются на полигонах ТБО примерно в эквивалентных количествах, метан вызывает большее беспокойство. Это связано с его значительным вкладом в «парниковый эффект», поскольку метан аккумулирует энергию инфракрасного излучения в 30 раз эффективнее углекислоты. Метан присутствует в атмосфере в достаточно низких концентрациях (1.58-1.68 ппм), однако его атмосферное содержание ежегодно возрастает в среднем на 1% за счет дисбаланса между продукцией и окислением (Заварзин и Кларк, 1987; Blake and Rowland, 1988; Galchenko et al., 1989; IPCC, 2001). Количество метана, поступающего в атмосферу из различных источников, значительно варьирует.
Биохимические особенности окисления метана метанотрофными бактериями
Поток (эмиссия) метана с поверхности почвенного покрова в атмосферу, отражает разницу между количеством метана, образуемого в анаэробной зоне, и количеством метана, окисленного метанотрофными бактериями в верхнем (аэробном) слое почвы. Почва может являться как источником биогенного метана, так и его стоком, причем даже в одной и той же почве могут возникать различные условия, при которых метан будет выделяться или поглощаться. В последнем случае будет наблюдаться отрицательный поток или «негативная» эмиссия метана, количественно выражающая скорость окисления метана in situ. На полигоне ТБО, где за счет работы системы извлечения биогаза эмиссия метана отсутствовала, проводили оценку скорости окисления метана по величине отрицательного потока метана, измеренного in situ с помощью камерно-статического метода (Bogner et al., 1997b, 1999).
Метод удаления окисляющего слоя основан на сравнении измеренного камерно-статическим методом потока метана с поверхности исследуемого ненарушенного участка и потока, измеренного на том же участке после удаления верхнего метанокисляющего слоя (Frenzel and Karofeld, 2000). К недостаткам метода относятся: (1) изменение температурного режима и режима аэрации в нижнем метангенерирующем слое после удаления верхнего метанокисляющего, т.е. происходит изменение значений факторов среды, а также (2) отсутствие абсолютно четкого разделения между зонами образования и окисления метана, т.е. при удалении некоторого слоя почвы может происходить снижение не только окисления, но и образования метана (Смагин и Глаголев, 2004).
Метод ингибирования основан на сравнении измеренного камерно-статическим методом потока метана с поверхности исследуемого участка и потока, измеренного на том же участке после внесения в атмосферу камеры ингибитора бактериального метанокисления (метилфторида, пиколиновой кислоты или ацетилена). Считается, что разница между вторым (с ингибитором) и первым (без ингибитора) измерениями потока дает интенсивность метанокисления (Ерр and Chanton, 1993). К недостаткам метода относятся: (1) сложность определения времени, необходимого для полного ингибирования метанокисления, которое зависит от кинетики процесса ингибирования и от кинетики массопереноса ингибитора внутрь почвы; (2) возможность влияния ингибитора метанокисления на метанобразование; (3) отсутствие данных о глубине проникновения ингибитора в почву, т.е. о толщине слоя, в котором ингибируется метанокисление (Смагин и Глаголев, 2004).
Метод стабильных изотопов широко используется при балансовых расчетах содержания метана и его потоков в атмосфере. В зависимости от природы источников метана изотопный состав его углерода варьирует от -25 до -80%о. С помощью материально изотопного баланса рассчитан средневзвешенный изотопный состав углерода метана, поступающего в атмосферу, который характеризуется величиной 8 С = -54.7%о. Поскольку бактериальное потребление метана сопровождается фракционированием изотопов углерода (в метаболизм бактерий включается преимущественно 12С-СЬІ4), то изотопный состав может служить своеобразным индикатором биогеохимических процессов, протекающих в различных местообитаниях (Лебедев и др., 1993; Зякун, 2006). В процессе метаногенеза образуется метан, обогащенный легким изотопом углерода с величинами 513С от -50 до -80%о и ниже, и СОг, обедненный легким изотопом с 5 3С от +10 до -10%о. Метан, образующийся на полигонах ТБО, несколько обогащен тяжелым изотопом углерода относительно метана бактериального происхождения природных объектов (иловые газы водоемов, болотный газ, биогеохимические газы осадочных отложений). Это может быть связано с происходящим наряду с метаногенезом окислением некоторого количества метана в микрозонах техногенных генерирующих отложений, которое может приводить к утяжелению углерода метана (Лебедев и др., 1993). Интерпретация масс-спектрометрических измерений осложняется еще и тем, что на изотопный состав метана кроме окисления влияет изотопный состав разлагаемого органического вещества, изотопный состав непосредственного предшественника метана, путь образования метана (ацетокластический и/или гидрогенотрофный) и др. (Bogner et al., 1996). Оценка окисления метана в покрывающей почве полигонов ТБО методом стабильных изотопов основана на измерении разницы между величиной 513С в метане, образуемом в анаэробной зоне полигона, и метане, выделяемом в атмосферу с его поверхности. Процент окисленного метана определяется по уравнению (3), которое описывает изотопное фракционирование в открытой системе: где fo% - процент метана, окисленного в процессе транспорта через слой покрывающей почвы, 8Е - значение 813С-СН4, выделенного полигоном в атмосферу, ЗА - значение 513С-СН4, образованного в анаэробной зоне, аох - коэффициент фракционирования изотопов углерода метана при бактериальном окислении, (Хщш - коэффициент фракционирования, ассоциированный с газовым транспортом. Коэффициент фракционирования а определяется как отношение констант фракционирования легкого ( С) и тяжелого ( С) изотопов углерода метана (Chanton et al., 1999; Chanton and Liptay, 2000).
Измерение содержания изотопа 13C в пробах порового газа, отобранного с различных глубин подмосковных полигонов ТБО, показало, что вверх по разрезу покрывающей почвы метан утяжелялся (от -57 до -30%о), а СОг - облегчался (от +4 до -32%о), что свидетельствовало об интенсивном микробном окислении метана (Nozhevnikova et al., (Jones and Nedwell, 1993). Использование этого метода ограничено неоднородностью покрывающей почвы, что приводит к большим погрешностям определения.
Метод краткосрочной лабораторной инкубации (от нескольких часов до нескольких суток) наиболее часто используют для определения метанокисляющей активности покрывающей почвы. Метод основан на инкубации почвенных образцов в герметично закрытых флаконах в строго контролируемых лабораторных условиях. Условия варьировали по температуре, влажности, концентрациям СНц и СЬ, источникам азота и т.д. (раздел 3.2). Скорость окисления метана рассчитывали по убыли метана из газовой фазы флакона; концентрацию метана в газовой фазе определяли газохроматографически. Этим методом определяли скорость окисления метана на полигонах ТБО разных стран (США, России, Франции, Швеции, Финляндии и др.).
В таблице 4 суммированы данные инкубационных экспериментов, иллюстрирующие метанокисляющую способность покрывающей почвы различных полигонов ТБО. Метанокисляющая активность изменялась в широких пределах в зависимости от условий, существующих на полигоне, и от условий лабораторной инкубации.
Длительная лабораторная инкубация (несколько месяцев) представляет отдельную категорию инкубационных экспериментов. Инкубацию проводили в специально сконструированных лабораторных установках (биофильтрах, лизиметрах и колонках), имитирующих условия, существующие на полигоне ТБО in situ. Метан известной концентрации непрерывно подавали в нижнюю часть цилиндра, заполненного покрывающей почвой или материалом, который может быть использован на полигоне ТБО в качестве покрывающей почвы. Из лизиметров периодически отбирали образцы почвы, в которых определяли метанокисляющую активность, описанным выше способом. Основной задачей данных экспериментов является подбор такого состава покрывающей почвы, который поддерживает максимальную скорость окисления метана в различных условиях (Kightley et al., 1995; De Visscher et al., 1999; Hilger et al., 1999, 2000a, b; Humer and Lechner, 1999; Visvanathan et al., 1999; Gebert et al., 2003, 2004; Streese and Stegmann, 2003; Stralis-Pavese et al., 2004; Wilshusen et al., 2004a, b; Kettunen et al., 2006).
Измерение окисления метана ex situ
В зависимости от состава покрывающей почвы и от происходящих в ней микробных процессов, рН почвы может варьировать в широких пределах. Максимальные значения рН (7.1-8.35) характерны для компостов (Humer and Lechner, 1999; De Vissher et al., 2001; Wilshusen et al., 2004a). Значения рН покрывающих почв минерального состава, как правило, лежат в слабо кислой или нейтральной области (5.2-7.3) (Whalen et al., 1990; Kightley et al., 1995; Boeckx et al., 1996; Borjesson et al., 1998b, 2001, 2004; Borjesson, 2001; De Vissher et al., 1999, 2001; Christophersen et al., 2000; Humer and Lechner, 1999; Chan and Parkin, 2000; Hilger et al., 2000a, b). Минимальные и максимальные единичные значения рН покрывающих почв минерального состава составляли 4.93 (Wise et al., 1999), 7.5 (Borjesson et al., 2001) и 7.8 (Czepiel et al., 1996). Иногда наблюдалось незначительное изменение рН по профилю покрывающей почвы с небольшим закислением в приповерхностных горизонтах. В этом случае, внесение извести повышало рН почвы и приводило к увеличению метанокисляющей активности (Hilger et al., 2000а). Существуют данные о высокой эмиссии метана с поверхности участков полигона, в которых покрывающая почва имела низкие значения рН, что указывало на неблагоприятное влияние низких рН на метанотрофную активность почвы (Hilger and Humer, 2003). Несмотря на то, что для большинства известных метанотрофов оптимальные значения рН лежат в нейтральной области (Hanson and Hanson, 1996), существуют как ацидофильные, так и галоалкалофильные метанотрофы (Хмеленина и др., 1997; Khmelenina et al., 1997; Троценко и Хмеленина, 2002; Дедыш, 2004; Хмеленина и др., 2006). Для эффективного окисления метана в такой нестабильной системе, как покрывающая почва полигонов ТБО, важным является не абсолютное значение рН, а способность почвы поддерживать рН на определенном уровне в течение длительного времени (Humer and Lechner, 1999).
Данные о влиянии растительного покрова на активность метанотрофной популяции покрывающей почвы полигонов ТБО крайне ограничены. Замечен положительный эффект растительности на метанокисляющую активность, выражавшийся в снижении ингибирующего влияния NH/- Показана небольшая разница в величинах окисления метана почвой под растительным покровом (47%) и без покрова (37%), вероятно обусловленная положительным влиянием ризосферы растений на плотность микробной популяции покрывающей почвы (Hilger et al., 2000а). В лизиметрах, симулирующих покрывающую почву полигона ТБО, изучали влияние различных видов травянистых растений (мискантуса, люцерны и смеси райграса, овсянницы и мятлика) на состав метанотрофной популяции. Скорость окисления метана в лизиметрах под растительным покровом в два раза превышала таковую в контрольных лизиметрах (без покрова). Максимальное окисление метана наблюдалось в почве, засеянной люцерной. В почве под растительным покровом преобладали представители метанотрофов II типа, и во всех лизиметрах доминировали представители родов Methylocaldum и Methylocystis (Stralis-Pavese et al., 2004).
Стимулирующее влияние растительности на окисление метана может быть связано со способностью растений поддерживать в покрывающей почве оптимальную температуру, влажность и обеспечивать бактерий питательными веществами (Hilger et al., 2000а; Hilger and Humer, 2003). Корневая система растений, проникающая в нижние горизонты покрывающей почвы, может снабжать бактерий кислородом (Stralis-Pavese et al., 2004, Maurice et al., 1999). С другой стороны, было отмечено, что растения могут конкурировать с метанотрофами за воду и питательные вещества (Hilger and Humer, 2003). При исследовании влияния биогаза на рост сои на полигонах ТБО замечено, что увеличение концентраций СО2 в почве за счет активности метанотрофных бактерий влияло на метаболизм растений и индуцировало хлороз, потерю листьев и образование растениями токсинов (Marchiol et al., 1999). Двум последним выводам можно противопоставить обзор Ивановой с соавт. (2006), в котором приводятся данные о колонизации различных растений метанотрофными бактериями и симбиотической связи между ними. Водные и болотные растения обеспечивают метанотрофов кислородом за счет транспорта газа из аэрируемых тканей побега растения в корневую зону. Экспериментально продемонстрировано, что окисление метана в ризосфере риса происходит намного эффективнее, чем в почве. Существуют данные об ассоциации нейтрофильных мезофильных метанотрофов с травянистыми и древесными растениями. Метанотрофы могут стимулировать прорастание, морфогенез и рост растений за счет образования фитогормонов и других биоактивных веществ, а также благодаря способности к азотфиксации (Иванова и др., 2006).
Эффективное снижение эмиссии метана с поверхности полигонов ТБО возможно при комплексном подходе к этой проблеме. Крайне важными являются раздельный сбор и предобработка ТБО. Необходимо, чтобы полигон ТБО соответствовал современным санитарным нормам организации полигонов. На полигонах ТБО должны производиться гидроизоляция дна, инстолляция дренажных систем и систем сбора биогаза. На «старых» полигонах, где отсутствуют системы сбора биогаза или его извлечение и использование нерентабельно, необходима активация аэробного окисления метана в покрывающей почве. Знание особенностей влияния различных факторов окружающей среды на метанокисляющую активность позволяет создавать в покрывающей почве условия, необходимые для поддержания максимальной скорости окисления метана. Перспективными являются аэрация и неглубокий дренаж покрывающей почвы, которые увеличивают объем аэробного слоя. Одним из способов поддержания оптимальной влажности в засушливые сезоны года может служить рециркуляция личатов через слой покрывающей почвы. Необходимо использование на полигонах ТБО такой почвы, в которой поддерживаются оптимальные для окисления метана физико-химические условия. Покрывающая почва полигонов ТБО должна обладать пористостью, обеспечивающей хорошее снабжение бактерий кислородом и метаном, водоудерживающей способностью, обеспечивающей оптимальную влажность, а также содержать все необходимые для роста бактерий питательные вещества. Озеленение рекультивируемых полигонов, внесение в покрывающую почву компостов, активных илов, растительных остатков и других добавок, а также препаратов газоокисляющих микроорганизмов способствуют усилению окисления метана на полигонах ТБО (Ножевникова, 1995; Humer and Lechner, 1999; Maurice et al., 1999; Visvanathan et al., 1999; Pohland and Kim, 2000; Hilger and Humer, 2003; Kettunen et al., 2006). На основании большого экспериментального материала предложен ряд математических моделей для расчета состава биогаза, потенциальной эмиссии и окисления метана. Детальное изложение этих моделей приведено в различных публикациях (Лебедев и др., 1996; Czepiel et al., 1996; Bogner et al., 1997b, 2000; Wilshusen et al., 2004a; Глаголев, 2006).
Оценка численности и выделение метанотрофов с помощью методов культивирования
Молекулярные методы, основанные на использовании ПЦР, широко используются для идентификации различных групп микроорганизмов в природных и антропогенных местообитаниях. Они относятся к группе косвенных методов, поскольку имеют дело не с целыми клетками микроорганизмов, а с ДНК или РНК, экстрагированными из природного образца. Главными объектами ПЦР-амплификации при анализе состава метанотрофной популяции являются филогенетические гены, кодирующие 16SpPHK, и функциональные гены, кодирующие ключевые ферменты метанотрофного метаболизма - мММО, рММО и метанолдегидрогеназу (Дедыш, 2006). Амплификация ДНК, экстрагированной из образца, содержащего смешанное микробное сообщество, приводит к получению смеси ПЦР-продуктов одинакового размера. Фрагменты генов могут подвергаться клонированию с последующим рестрикционным анализом клонированных фрагментов или альтернативным методам разделения ДНК-фрагментов. Различия в нуклеотидных последовательностях ДНК-фрагментов обуславливают разницу в электрофоретической подвижности частично денатурированных 2-х цепочечных молекул ДНК в градиенте ДНК-денатурантов, что составляет принцип разделения ПЦР-продуктов методом денатурирующего гель-электрофореза (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) (Muyzer, 1999; Heuer et al., 2001; Schafer and Muyzer, 2001). После разделения амплифицированных фрагментов на группы с одинаковыми нуклеотидными последовательностями, проводят их секвенирование и анализ, позволяющий установить филогенетическую принадлежность метанотрофов, присутствующих в данном образце (Дедыш, 2006).
При исследовании биоразнообразия метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО были объединены методы культивирования и методы молекулярной экологии (Wise et al., 1999). Молекулярные методы включали ПЦР-амплификацию, клонирование, разделение ДНК-фрагментов методом DGGE и секвенирование. При секвенировании полученных клонов метанотрофов I типа были идентифицированы нуклеотидные последовательности, образовывавшие отдельный монофилетичный кластер, наиболее близкородственный группе Methylobacter-Methylomicrobium, Сиквенсы клонов метанотрофов II типа не укладывались ни в один из кластеров известных представителей метанотрофов II типа. При этом наблюдалась корреляция между филогенетической принадлежностью полученных клонов и метанотрофных изолятов, выделенных из покрывающей почвы с помощью методов культивирования (Wise et al., 1999). Для идентификации чистых культур метанотрофов, выделенных методом SSMS из покрывающей почвы полигона ТБО, был применен целый набор молекулярных методов, включавший амплификацию с праймерами на филогенетические и функциональные гены метанотрофов, ERIC-PCR fingerprint и FISH. Среди изолятов преобладали представители метанотрофов II типа. Метод ERIC-PCR fingerprint показал генотипическое разнообразие изолятов на штаммовом уровне (Svenning et al., 2003). Для исследования биоразнообразия метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО использовали молекулярные методы, включавшие ПЦР-амплификацию, рестрикционный анализ клонированных фрагментов и филогенетический анализ. Во всех образцах покрывающей почвы обнаружены представители метанотрофов I типа, принадлежавшие к роду Methylobacter, а также метанотрофы II типа, распределенные внутри группы Methylocystis-Methylosinus, не обнаруживая приуроченности к какому-либо одному филогенетическому кластеру (Uz et al., 2003).
Для анализа метанотрофной популяции покрывающей почвы был впервые предложен метод «diagnostic microarray» (Stralis-Pavese et al., 2004). Метод основан на гибридизации амплифицированных фрагментов функциональных генов метанотрофов с функциональными зондами. Анализ базы данных последовательностей генов ртоА всех известных метанотрофных бактерий и некультивируемых организмов этой группы лег в основу разработки диагностического микрочипа. Использовали 68 олигонуклеотидных зондов, комплементарных нуклеотидным последовательностям генов ртоА и ато А. Уровень специфичности зондов варьировал от штаммовой до групповой, что обеспечивало широкий спектр детекции и высокую разрешающую способность анализа (Stralis-Pavese et al., 2004; Дедыш, 2006). Данным методом идентифицированы представители метанотрофов I и X типов (Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylosarcina, Methylothermus, Methylococcus, Methylocaldum), II типа (Methylocystis) и ацидофильных метанотрофов {Methylocapsa acidiphila).
Таким образом, применение микробиологических и молекулярно-биологических методов дает широкие возможности для оценки численности и идентификации метанотрофных бактерий в покрывающих почвах различных полигонов ТБО.
Таким образом, покрывающие почвы полигонов ТБО содержат активную и разнообразную по видовому составу популяцию метанотрофных бактерий, устойчивую к влиянию факторов окружающей среды. Ранее проводились фрагментарные сезонные исследования метанокисляющей активности покрывающей почвы, и данные о регулярных сезонных измерениях отсутствуют. Поэтому в работе мы уделяли особое внимание детальному изучению сезонной динамики эмиссии и аэробного окисления метана, активности и численности метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО, а также исследованию биоразнообразия метанотрофной популяции в накопительных культурах, выделенных из покрывающей почвы при разных температурах и концентрациях метана.
