Содержание к диссертации
Введение
1. Биофизические основы и технические аспекты анализа крови и биологических жидкостей
1.1. Кровь, как объект лабораторного анализа 11
1.2. Реакция оседания эритроцитов в клинической практике 15
1.3. Физико-химические основы механизмов агрегации и оседания красных клеток крови 18
1.4. Технические аспекты изучения клеток крови их агрегатов
1.4.1.Методы подсчета и исследования морфологии клеток 26
1.4.2.Методы и приборы исследования клеточной агрегации 32
1.4.3.Приборы регистрации процесса оседания эритроцитов 41
1.5. Применение методов физики поверхностей к исследованию биологических сред 50
Выводы 61
2. Анализ возможности использования фотометрического подхода для оценки процессов агрегации и оседания эритроцитов в капельной пробе
2.1. Теоретический анализ процессов, происходящих при оседании клеток в капельных пробах крови, и их значимость при оценке СОЭ фотометрическим методом 63
2.2. Моделирование прохождения света через капельную пробу при протекании в ней процесса оседания эритроцитов 76
2.2.1.Оценка изменения оптических свойств пробы крови в результате агрегации клеток 76
2.2.2.Моделирование концентрационных изменений в капельной пробе при оседании клеток 85
2.2.3.Анализ совместного влияния процесса оседания и агрегации клеток на динамику изменения светового потока 90
2.3. Обоснование выбора длины волны зондирующего излучения 107
Выводы 111
3. Техническая реализация биотехнической системы
3.1. Конструкция экспериментальной установки 112
3.1.1.Структурная схема устройства 112
3.1.2. Измерительная система первичного преобразователя 116
3.1.3.Система термостатирования камеры первичного преобразователя 120
3.1.4.Фотометрический канал 124
3.1.5.0ценка источников погрешности фотометрической системы 130
3.1 .б.Работа устройства 134
3.2. Результаты технических испытаний установки 135
3.2.1.Проверка системы термостабилизации камеры первичного преобразователя 136
3.2.2.Проверка технических характеристик блока фотометрического измерительного канала 137
3.2.3.Проверка системы поддержания влажности в рабочем объеме первичного преобразователя 138
Выводы 141
4. Экспериментальные исследования
4.1. Разработка методики проведения исследований 142
4.1.1. Подготовка крови к исследованию и постановка реакции СОЭ 143
4.1.2.Технологическая схема экспериментальных исследований 146
4.1.3 .Определение оптимальных параметров оптической измерительной
системы для проведения измерений 148
4.2. Медицинские клинические исследования 157
Выводы 173
Заключение 174
Список использованных источников
- Реакция оседания эритроцитов в клинической практике
- Моделирование прохождения света через капельную пробу при протекании в ней процесса оседания эритроцитов
- Измерительная система первичного преобразователя
- Подготовка крови к исследованию и постановка реакции СОЭ
Введение к работе
В клинической лабораторной практике высокая диагностическая ценность используемых методов, сочетается с большой трудоемкостью их выполнения и значительными временными и материальными затратами. Это, конечно же, сокращает спектр проводимых анализов, ограничивая их лишь самыми основными. Одним из возможных путей увеличения числа проводимых исследований является автоматизация выполняемых при исследовании операций и в первую очередь операций связанных с контролем результатов проводимых реакций, что позволяет в значительной степени повысить точность и объективность полученных при исследовании данных. Следовательно, наряду с разработкой специальных медико-лабораторных методик, необходимо создание соответствующей, автоматизированной аппаратуры.
Измерение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) является одним из наиболее часто проводимых анализов крови. Анализ СОЭ включен в список исследований выполняемых при общем анализе крови и широко используется как в нашей стране, так и в зарубежной медицинской практике.
Актуальность вопроса оптимизации и автоматизации процесса оценки седиментационных характеристик эритроцитов крови, в первую очередь, определяется высокой клинической ценностью показателя СОЭ, по которому можно судить о наличии патологических процессов в организме, отслеживать течение болезни и эффективность проводимой терапии, и в то же время, значительными временными затратами на его постановку и необходимостью забора достаточно большого объема крови от пациента для проведения этого исследования.
Существующие современные методы оптимизации анализа СОЭ, в том числе реализованные в конкретных приборах, позволяют снизить время его проведения до 15-20 мин (стандартный метод занимает 1-2 часа), повысить чувствительность и снизить ошибку оператора. Однако одной из основных задач в плане оптимизации анализа все еще остается проблема снижения объема пробы необходимой для исследования. Так, стандартный принятый в зарубежной практике метод Вестергрена требует забора 2 мл венозной крови. Для используемого в России микрометода Панченкова необходимо около 0,2 мл крови. Но так как в последнем случае используют капиллярную кровь, которую обычно получают путем прокола мягких тканей пальца, нужный для анализа объем крови набрать достаточно сложно. Кровь приходится выжимать из пальца с определенным усилием, что чревато травматизацией клеток, перемешиванием крови с лимфой и приводит к искажению величины СОЭ. Кроме того, сложность получения требуемого объема крови приводит к неточности при разведении образца, что также ведет к ошибке анализа. В случае проведения данного анализа у детей, вопрос минимизации объема исследуемого образца становиться еще более актуальным.
Кроме того, в последние годы появляется много методик позволяющих более специфично выявлять наличие тех или иных заболеваний, в основе которых лежит сравнительное исследование показателя СОЭ при добавлении в кровь различных модифицирующих СОЭ веществ. Таким образом, необходимо проводить параллельное исследование СОЭ как минимум в двух образцах. Причем, так же как и в стандартной СОЭ-методике желательно оценивать значения данного показателя в ходе всего анализа, что в принципе невозможно без автоматизации процесса.
Существующие зарубежные автоматизированные приборы по измерению СОЭ, пока не разрешены к применению в клинической практике Российских лабораторий, так как не удовлетворяют Российским стандартам (основаны на методе Вестергрена). Российскими производителями медицинской аппаратуры, по имеющимся у нас данным, серийно такие приборы не выпускаются. В связи с вышеизложенным актуальным остается вопрос разработки высокоэффективной, автоматизированной лабораторной диагностической аппаратуры для контроля за состоянием системы крови и, в частности, позволяющей производить оценку седиментационных характеристик эритроцитов крови в микропробе за короткий промежуток времени.
Целью настоящей работы является обоснование и разработка экспресс-метода, а также соответствующих технических средств, для оценки процесса оседания эритроцитов в микропробе крови без специальной пробоподготовки и модификации объекта исследования.
Для реализации поставленной цели были определены основные задачи исследования, которые предполагали следующее:
1. Изучение возможности применения физико-химических методов и технических средств для оценки процесса оседания эритроцитов в микропробе без специальной пробоподготовки и модификации объекта исследования.
2. Анализ физических процессов, происходящих в лежащей капельной пробе (ЛКП) исследуемой крови в ходе оседания клеток.
3. Оценка влияния различных биофизических и физико-химических факторов на процессы поглощения и рассеяния светового монохроматичного излучения, проходящего вертикально через ЛКП крови.
4. Разработка приближенной модели прохождения светового излучения через капельную пробу крови при протекании в ней процесса оседания клеток.
5. Обоснование и экспериментальное исследование методов получения количественной информации о характере течения процесса оседания эритроцитов крови по динамике изменения показателя светопропускания ЖП.
6. Создание и испытание действующего макета технической системы оценки седиментационных свойств крови и экспериментальное подтверждение эффективности разработанного метода. Методы выполнения исследований и оборудование для их проведения. Поставленные задачи решались в соответствии с основными принципами поэтапного моделирования биотехнических систем путем сочетания теоретических и экспериментальных методов исследования.
При решении поставленных задач использовались методы физического и математического моделирования. Экспериментальные исследования проводились с использованием разработанных нами исследовательских измерительных приборов. Получаемые данные сравнивались со стандартными, принятыми в клинической лабораторной практике методами.
Разработка конструкции первичного преобразователя экспериментальной установки, кюветы, а так же выбор и обоснование их материалов базировались на положениях физики поверхностей, испарения и теплообмена, законах геометрической оптики.
Научная новизна работы заключается в следующем:
1. Доказана принципиальная возможность создания лабораторно-диагностических методов и систем оценки динамических показателей биологических жидкостей без специальной пробоподготовки в основе которых лежит фотометрия ЛКП исследуемого образца.
2. Разработана приближенная физико-математическая модель изменения интенсивности оптического излучения, проходящего через ЖП крови, от протекающего в пробе процесса оседания эритроцитов, учитывающая оптические и геометрические свойства пробы.
3. Экспериментально подтверждены основные положения предложенной модели прохождения излучения через ЛКП в ходе оседания в ней частиц.
4. Определены основные режимы проведения фотометрических измерений исследуемой биопробы, обеспечивающие соблюдение принципов адекватности и идентификации информационной среды. 5. Разработан принцип построения аппаратных средств для осуществления экспресс-метода оценки динамики оседания эритроцитов крови в микрообъеме.
6. Разработан оригинальный экспресс-метод оценки скорости оседания эритроцитов в микрообъеме крови, результаты которого хорошо согласуются со стандартной методикой Панченкова.
На защиту выносятся следующие положения:
1 Фотометрирование пробы крови, сформированной в виде лежащей капли, позволяет произвести оценку скорости оседания эритроцитов и динамики процесса. При этом регистрируется изменение величины светопропускания в осевой части капельного образца в спектральном диапазоне 750-950 нм (оптимум - 805 нм).
2 Разработанная математическая модель светопропускания капельной пробой позволяет определить количественную связь между параметрами фотометрирования и физическими параметрами крови (концентрацией эритроцитов, размером клеточных агрегатов, процессом оседания, геометрией пробы и др.) и показывает в сочетании с экспериментом, что процесс перераспределения клеток по объему капельной пробы является основным фактом при обосновании зависимости между динамикой изменения светового потока, проходящего через капельную пробу, и скоростью оседания клеток..
3 Результаты оценки СОЭ с помощью капельной методики имеют высокую повторяемость, хорошо согласуются (имеют прямую корреляционную зависимость, г 0,9) с принятым стандартным методом Панченкова, а также имеют самостоятельную диагностическую значимость. При этом время анализа СОЭ уменьшается до 15 минут, объем используемой крови до 25 мкл, существует возможность отслеживать динамику процесса оседания.
Результаты работы имеют как прикладную, так и фундаментальную значимость. Предложен и исследован новый подход к оценке динамических характеристик биологических дисперсных сред, в частности, скорости оседания эритроцитов, основанный на фотометрировании проб, имеющих форму лежащей капли.
Разработана и сконструирована установка, позволяющая реализовать предложенный метод исследования. Конструкция устройства защищена патентом на полезную модель РФ (2005г). Прибор прошел экспериментальную клиническую апробацию в центральной научно-исследовательской лаборатории и клиниках ГОУВПО "СибГМУ Росздрава", клиниках Военно-медицинского института, отделении пульмонологии Томской областной клинической больницы.
Разработанный метод анализа малых объемов проб использован при выполнении г/б НИОКР по созданию прибора для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови (программа "Конверсия и высокие технологии", 1994-1996 гг.), автоматизации метода диагностики онкологических заболеваний (грант Министерства образования и науки РФ, 2005г), а также инициативных НИР по исследованию оптических свойств биологических сред малых объемов, выполняемых на кафедре "Промышленной и медицинской электроники" ГОУВПО "ТПУ".
Результаты диссертации внедрены в научный и учебный процесс кафедры "Промышленной и медицинской электроники" ГОУВПО "ТПУ", "Биологической и медицинской кибернетики" ГОУВПО "СибГМУ Росздрава".
Результаты работы позволяют рекомендовать предложенные решения для использования в медицинской клинической практике и в сфере биотехнологий.
Основные положения диссертационной работы докладывались на научных семинарах кафедры "Промышленной и медицинской электроники" ТПУ, на отчетных конференциях при выполнении г/б НИОКР, проводимой в рамках программы "Конверсия и высокие технологии" (Томск, 1996), на 3-ей и 4-ой Междунар. науч.-технич. конференциях "Актуальные проблемы электронного приборостроения" (Новосибирск, 1996, 1998), региональной конференции "Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции", посвященной 35-летию ЦНИЛ (Томск, 1997), 2-ой, 3-ей, 4-ой областных науч.-практич. конференциях молодых ученых студентов и аспирантов (Томск, 1996, 1997, 1998), 6-ой, 8-ой, 11-ой, 12-ой Междунар. науч.-практич. конференциях молодых ученых студентов и аспирантов (Томск, 2000, 2002, 2005, 2006), Всероссийской НІЖ "Электронные средства и системы управления (Томск, 2003).
Опытные образцы разработанного прибора для оценки фагоцитарной реакции экспонировались на Междунар. выставке-ярмарке в Ганновере (Германия, Ганновер, 1997), Всероссийской выставке-ярмарке "Медицинское оборудование" (Томск, 1998).
Идея использования метода фотометрирования капельных проб для анализа биожидкостей была предложена проф., д.т.н., Л.М. Ананьевым. Им же была произведена и постановка задачи. Дальнейшее курирование работы проводилось совместно к.т.н., Я.С Пеккером и д.т.н., проф., Г.С. Евтушенко. Проведение клинических исследований проходило под руководством консультанта, д.м.н., Н.В. Рязанцевой. Автор внес определяющий вклад в конструирование и изготовление экспериментальных установок, планирование и проведение всех экспериментов, анализ полученных результатов, создание модели светопропускания капельной пробой. Все результаты, составляющие научную новизну диссертации и выносимые на защиту, получены автором лично.
По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, включая 1 патент на полезную модель.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 287 наименований и содержит 202 страницы основного текста, включая 100 рисунков. Каждая глава начинается вводными замечаниями и заканчивается выводами.
Реакция оседания эритроцитов в клинической практике
Уже много лет в лабораторной диагностике различных нозологических форм используется определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Этот лабораторный анализ был введен Р. Фареусом в 1918 г. и с тех пор стал одним из обычных анализов крови во многих лабораториях. В России данный показатель входит в число обязательных проб, проводимых при общем анализе крови. Измерение СОЭ, используется как простая неспецифическая проба, позволяющая выявить наличие каких-либо патологических процессов в организме.
Каждый эритроцит, начиная от своей геометрической формы и заканчивая пространственным расположением внутреннего содержимого, представляет собою биофизический прибор [14]. Патологические процессы в организме вызывают целый ряд отклонений от нормального состояния крови. Наступают колебания коллоидно-белкового и ионного режима. Меняется осмотическое давление плазмы. Варьируют поверхностное натяжение, проницаемость мембраны, сорбционная и транспортная функции эритроцитов. Изменения равновесных состояний на поверхности и внутри эритроцита выводят из физиологически нормальных пределов регуляторные физико-химические механизмы. Электростатическая система эритроцита перестраивается. При изменении электростатического распора сокращаются или возрастают эффективные размеры красного кровяного тельца. Архитектоника эритроцитарных ансамблей приобретает новые качества, вызывающие, совместно с коллоидно и химически измененной плазмой, существенно различные формы поведения эритроцитных образований в плазме [14,15].
В связи с этим, СОЭ в ее обычном или модифицированном виде отражает не только общую биодинамику организма, но может стать чувствительным и объективным индикатором многих структурных и метаболитических изменений эритроцита при тех или иных заболеваниях.
В России для измерения СОЭ используется метод Панченко. Нормальные значения СОЭ для лиц моложе 50 лет лежат в диапазоне от 2 до 10 мм/ч (мужчины) и от 2 до 12 мм/ч (женщины), а у лиц старше 50 лет - ниже 20 мм/ч (мужчины) и ниже 30 мм/ч (женщины). Значения СОЭ, превышающие эти нормы, свидетельствуют о наличии воспалительных или других патологических процессов в организме [4, 7,14, 16,17, 22-25, 31].
Ускорение СОЭ наблюдается при большинстве заболеваний острого инфекционного характера. Увеличение значения СОЭ может быть зафиксировано и при заболеваниях, носящих хронический характер: циррозе печени, злокачественных новообразованиях, тяжелых поражениях почек [16]. Небольшое количество патологических процессов и состояний характеризуется не ускорением, а замедлением данной реакции (желтуха, пороки сердца, эпилепсия, шизофрения и некоторые другие заболевания). СОЭ также может быть резко снижена при серповидноклеточной анемии и других видах гемоглобинопатии [18, 19]. Несмотря на широкое применение, до настоящего времени оценка СОЭ не может быть принята как бесспорный метод, дающий возможность с высокой достоверностью определять степень тяжести того или иного заболевания [16]. Имеются факты когда в терминальных стадиях рака, при активном туберкулезе легких, сопровождающихся распадом ткани, эритроциты оседают со скоростью, лежащей в пределах нормы, а эритроциты крови практически здорового человека после легкого гриппа могут дать такой эффект оседания, который обычно расценивается как показатель серьезного заболевания [14]. Вместе с тем, при заболеваниях различного происхождения нередко обнаруживается одна и та же скорость оседания.
Не являясь достаточным для однозначного диагноза, повышенная СОЭ (выше 80 мм/час), тем не менее, говорит о наличии серьезного заболевания [20]. Отсутствие болезни при сильно повышенной СОЭ - редкий случай [21,22, 23]. Систематически повышенное на протяжении длительного времени значение СОЭ практически всегда свидетельствует о серьезном скрытом заболевании, как правило, инфекционного характера, или о наличии злокачественной опухоли [24, 25]. Таким образом, ускорение реакции оседания может быть показателем развития патологических процессов в организме. Накопленные эмпирические экспериментальные данные свидетельствуют, что показатель СОЭ чувствителен к изменению физиологического состояния человека, применению лекарственных средств и др. [14].
Процесс оседания красных клеток крови не является монотонным. С появлением приборов, способных фиксировать динамику изменения высота столба оседающих клеток в течение всего процесса оседания, были получены данные, которые гораздо ярче отражали изменения гомеостаза организма, чем обычно учитываемые величины оседания эритроцитов за 1 час. Моментальная скорость оседания, т.е. производная кривой оседания (изменение высоты, отнесенное к изменению времени), может дать более ценную информацию для диагностики заболеваний, чем само интегральное значение СОЭ за час. Помимо начального ускорения оседания границы плазма/красная кровь на кривой зависимости скорости от времени наблюдаются кратковременные периоды резкого ускорения/замедления ее движения [17, 32, 103-105]. На основании имеющихся в литературе данных был предложен новый подход к изучению процесса оседания крови не как к физико-химической, а как к целостной метаболически-активной системе [17]. За счет определения новых параметров осаждения эритроцитов, наряду с измерением традиционного показателя - скорости оседания эритроцитов за час, достигается более высокая информативность получаемых результатов [105].
Моделирование прохождения света через капельную пробу при протекании в ней процесса оседания эритроцитов
Кроме поглощающих свойств крови, в оценке ее оптических характеристик важны механизмы, связанные с рассеиванием. Эритроциты или их агрегаты являются основными рассеивающими элементами в системе. Эритроциты формируют стопки, то есть совокупности различной формы и размер, прозрачность крови может колебаться в результате изменений рассеивания света, вызванных процессом агрегации/дезагрегации красных клеток крови [213, 218, 220-222]. Рассеивание света достаточно велико и изменяется во времени, если принять во внимание агрегацию эритроцитов.
Размер рассеивателей в крови является большим, чем Я, и их относительный индекс преломления не сильно отличается от единицы. Это значит, что рассеивание в прямом направлении является доминирующим.
Проблема светопропускания в процессе агрегации клеток красной крови может быть сведена к проблеме многократного светового рассеивания мутным поглощающим носителем [213]. В течение агрегации эритроцитов, гематокрит остается постоянным, в то время как размеры агрегатов и их геометрия существенно изменяется [223]. Снятие сдвиговых напряжений в пробе, имеющих место в процессе забора, перемешивания и других манипуляций с образцом, после ее помещения в кювету (in vitro) приводит к непрерывному росту размеров агрегатов и соответствующему уменьшению общего количества рассеивателей.
В реальных измерениях оптических свойств крови вследствие анизотропии рассеяния, неоднородности поглощения, неравномерности распределения частиц, многократного рассеяния, влияния концентрационного эффекта на характер передачи светового излучения через образец, наблюдается отклонение от закона Бугера-Бера. Достаточно строгое математическое описание процесса распространения света в рассеивающей среде может быть сделано с помощью стационарной теории переноса излучения (ТЛИ) [212]. Однако аналитическое решение для ТПИ может быть получено только в ограниченном числе случаев [239].
Индикатриса рассеяния одиночной частицы представляет сложную интерференционную картину, содержащую максимальные и минимальные значения интенсивности рассеяния при разных значениях угла наблюдения [224]. Для расчета показателя ослабления и индикатрисы рассеяния при больших концентрациях частиц необходимо решение задачи о дифракции света на системе многих тел. Строгого решения этой задачи не найдено. Во многих случаях строгие выражения рассеяния света дисперсной средой либо недоступны, либо затруднительны для решения обратной задачи. В настоящее время при расчете показателя ослабления и индикатрисы рассеяния дисперсных сред используют различные приближенные методы [225]. Однако аппроксимации имеют существенные ограничения. Поэтому развитие аппроксимаций и оценка границ их применимости являются достаточно важной теоретической и практической задачей. Среди аппроксимационных решений в области оптически мягких частиц (т.е. для \п-\\ « 1/2, где п - относительный показатель преломления частицы) заслуживает внимания метод интегральных уравнений [225-228]. В частности, доказано, что решение интегрального волнового уравнения в приближении Вентцеля-Крамерса-Бриллюэна (ВКБ) является наиболее общим в указанной области и объединяет в себе такие общеизвестные аппроксимации, как Релея, Релея-Ганса-Дебая, аномальную дифракцию, дифракцию Фраунгофера [229,230]. Аналитически в приближении ВКБ и численно на основе теории Ми показано [227], что зависимость малоугловой индикатрисы от фазового сдвига (р) является функцией фактора эффективности светорассеяния К(р). Как следует из работ [226-231], расчеты, выполненные по методу ВКБ и точными методами (теория Ми и метод Т-матриц), показывают, что ВКБ-приближение наиболее адекватно описывает малоугловую область индикатрисы светорассеяния, а по такому параметру индикатрисы, как позиции экстремумов, область корректного применения может быть значительно расширена (передняя полусфера углов рассеяния).
В случае рассеяния на крупных светопреломляющих неоднородностях (Я«а, и-1«1), к которым можно отнести эритроциты, изменение направления движения фотона при однократном рассеянии является малым [219, 228, 233-236]. В случае многократного рассеяния он определяется как толщиной рассеивающего слоя, так и поглощающими свойствами среды. Если поглощение в среде слабое (длина поглощения /а = //а" больше транспортной длины /tr = /Аг 1)» то при прохождении излучения через относительно тонкие (d ltT) рассеивающие слои также реализуется малоугловой режим распространения. В толстых слоях (d /tr) на глубинах больших транспортной длины пучок становится изотропным и возникает режим пространственной диффузии излучения [236]. В сильно поглощающих средах (/а /tr) ввиду преимущественного поглощения отклонившихся на большие углы фотонов малоугловой режим реализуется на всех глубинах [235,236].
Измерительная система первичного преобразователя
Для исследования процесса изменения оптико-геометрических параметров капельной пробы и нахождения оптимальных характеристик оптической измерительной системы необходимо было разработать конструкцию камеры первичного преобразователя, которая позволила бы с минимальной потерей полезной информации провести необходимые исследования и послужила бы прототипом первичного преобразователя приборов для решения конкретных медико-биологических задач.
Для решения поставленных целей исследования система первичного преобразователя должна обеспечивать выполнение следующих функций: генерирование коллимированного монохроматического светового потока; его взаимодействие с исследуемой средой; регистрацию светового потока после его взаимодействия со средой; возможность изменения характеристик оптической системы (замена источника и приемника излучения, их расположение относительно пробы, диаметр зондирующего светового потока, апертуру фотоприемника, параметры пробы: объем, диаметр капли, тип кюветы); наблюдение и фиксация изменения геометрии капельной пробы; наблюдение и фиксация изменения интерференционной картины, образуемой световым потоком после прохождения через исследуемый образец; отсутствие влияния внешних условий на исследуемую пробу; обеспечение необходимых температурных условий; обеспечение повышенной влажностью с помощью насыщенного водяного пара при температуре термостатирования (для устранения испарения исследуемых капель-проб).
С учетом этих требований был разработан и сконструирован первичный преобразователь. На рис. 3.3 представлена конструкция камеры первичного преобразователя.
Камера ПП (рис. 3.3) выполнена в виде цельнометаллического корпуса 1 с выфрезерованной внутри полостью (рабочий объем) 4 для помещения кюветы 5. Изоляция внутреннего рабочего объема преобразователя от воздействия внешней среды осуществляется откидной крышкой 6 с герметизирующей прокладкой и магнитными замками.
В корпусе ПП выполнен сквозной вертикальный канал, в верхней части которого по отношению к рабочему объему камеры, на подвижном плунжере 7, имеющего возможность вертикального перемещения в канале, помещен приемник излучения 3. В качестве фотоприемника используется фотодиод, максимальная спектральная чувствительность которого лежит в области, соответствующей спектру излучения источника. Конструкция позволяет в зависимости от целей исследования достаточно легко менять тип фотоприемника. На пути воспринимаемого светового потока перед приемником (3) располагается насадка с диафрагмирующим отверстием, ограничивающим угловую апертуру приемника, которая так же достаточно легко меняется.
Для наблюдения интерференционной картины, образуемой световым потоком после прохождения образца, возможна замена плунжера с фотоприемником на плунжер с закрепленной на нем видеокамерой.
В канале нижней части корпуса камеры размещен закрепленный на планшайбе 8 излучатель 2. В корпусе излучателя размещается светодиод и оптическая система коллимации светового потока, обеспечивающая минимальный угол его расходимости. Система излучателя позволяет легко перестраивать ее под различные типы используемых излучающих диодов. Юстировка излучателя выполняется с помощью трех подпружиненных винтов 9, удерживающих планшайбу 8.
Выше излучателя в горизонтальном пазу камеры ГШ расположен вращающийся на оси 10 диск 11, имеющий по своему периметру высверленные диафрагмирующие отверстия 12 диаметром от 1 до 4 мм (с шагом 0,5 мм), устанавливаемые путем вращения диска 11 на пути светового потока от ИИ. Пружинным фиксатором 13 осуществляется точная фиксация диска 11 в положении, соответствующем выбранной диафрагме.
Кювета 5 представляет собой металлическую пластинку с размерами, позволяющими её точно фиксировать в рабочем объеме преобразователя и имеющую соосное с вертикальным каналом отверстие для размещения одноразовых вкладышей 14, которые изготавливаются из прозрачного инертного гидрофобного материала. Прозрачный вкладыш 14 с капельной пробой 15 располагаются соосно с источником 2 и приемником излучения 3.
На внутренней задней стенке камеры ПП приклеен гигроскопичный материал 16, служащий испарителем, нижний край которого опущен через щель в горизонтальный канал 17 с водой, соединенный с внешним сосудом 18 для его заправки. Данная система позволяет поддерживать повышенную влажность в камере ПП и тем самым снижает скорость испарения капельных проб жидкости
Подготовка крови к исследованию и постановка реакции СОЭ
Исследование СОЭ может проводится как на капиллярной, так и на венозной крови. Важным вопросом при постановке эксперимента был выбор используемого в опытах антикоагулянта. В методике по Панченкову и методе Вестергрена используется раствор цитрата натрия, добавляемый к крови в соотношении 1:4. Однако использование этого вещества несколько усложняет пробоподготовку, так как требуется точное смешение его с кровью, объем которой, в случае использования капиллярной крови ограничен и, соответственно, что создает условия для большего разведения. Последнее обстоятельство имеет существенное значение, так как уже сам факт добавления антикоагулянта вызывает разведение крови, а изменение соотношений объемов плазмы и эритроцитов оказывает влияние на СОЭ [ 16].
В мировой практике для анализа СОЭ при использовании в автоматизированных приборах оговаривается, что в качестве антикоагулянта можно применять гепарин, но, как следует из известных литературных источников и проводимых нами экспериментов, использование гепарина может исказить показатели СОЭ. Обычно в этом случае происходит повышение величины СОЭ [55, 58], причем в ряде случаев - значительно. Поэтому, несмотря на трудности в пробоподготовке при проведении экспериментов, мы оставили стандартную методику подготовки крови для метода Панченкова с добавлением цитрата натрия в качестве антикоагулянта в рекомендованных пропорциях.
В качестве метода сравнения был выбран метод измерения СОЭ по Панченкову, как принятый в российской клинической практике и не требующий большого количества крови для анализа (около 200 мкл). Для его проведения свежая кровь смешивается с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 4:1. Данной смесью заполняют стандартные стеклянные градуированные капилляры с внутренним диаметром около 1 мм на высоту 100 мм. Их размещают в штативе в вертикальном положении и через 1 час регистрируют границу разделения форменные элементы/плазма. Расстояние (в мм) от этой границы до границы раздела плазма/воздух соответствует величине измеряемого показателя.
Кроме приведенной выше ошибки, связанной с разведением крови цитратом, следует избегать еще ряд методических ошибок [16]:
1. Недостаточная глубина прокола мягких тканей скарификатором. Это приводит к тому, что кровь приходится выжимать из пальца с определенным усилием. Отсюда - травматизация капилляров, перемешивание крови с лимфой и засасывание в трубочку капилляра смеси крови с лимфой, а не чистой крови, что может дать значительную разницу в величине СОЭ. Поэтому необходимо набирать как можно меньше крови из пальца, чтобы избежать большого засасывания лимфы.
2. Недостаточное перемешивание крови с лимоннокислым натрием приводит к задержке оседания, особенно в первые 15-20 мин, и искажает кривую оседания, придавая ей резкие скачки в отдельные отрезки первого часа наблюдения; иногда же оседание вовсе не наступает.
4. Капилляры с оседающей кровью должны стоять строго вертикально. Наклон капилляров, а также вибрации приводят к завышенным показателям.
5. Необходимо постоянство температуры во время опыта. Использование модельной крови в исследованиях
Основная задача при выборе оптимальной методики проведения исследования - обеспечить повышенную чувствительность проводимых измерений к процессам седиментации клеток. При этом должно наблюдаться максимальное различие в динамике светопропускания для образцов крови с низким и повышенным значением СОЭ. Для возможности сравнивать результаты проводимых экспериментов при разных условиях желательно чтобы исходные оптические свойства и состав (главным образом гематокрит) анализируемых проб были одинаковыми, тогда можно проводить оценку по относительным изменениям светопропускания, как указывалось в главе 2, что упрощает сравнение получаемых данных. Добиться этого с использованием крови от разных пациентов достаточно сложно. Для этого единовременно необходимо иметь большую выборку образцов крови, что практически бывает сделать трудно. Поэтому эксперименты по выбору оптимальных характеристик оптической измерительной системы с целью повышения чувствительности анализа проводились на модельной крови.
Модельные образцы крови должны обеспечивать высокий и низкий уровень скорости оседания эритроцитов при одинаковой концентрации эритроцитов, величине гематокрита и содержании гемоглобина. Существует достаточно много запатентованных разработок, в которых предлагается состав модельной крови для проверки и градуировки систем анализа СОЭ [278-281]. Состав этих модельных сред является достаточно сложным, причем большинство вводимых в модельную кровь компонентов являются стабилизаторами среды - обеспечивают поддержание требуемых свойств в течение длительного периода хранения. Но основным компонентом, который является именно модификатором СОЭ эритроцитов в этих средах, обычно служит высокомолекулярный полимер, повышающий агрегацию эритроцитов.
