Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 11
2.1 Молекулярная структура белков и олигопептидов 11
2.1.1 Взаимодействие амфипатических олигопептидов с мембранами 19
2.2 Проникновение невирусных векторов в клетку 20
2.2.1 Комплексообразование и компактизация ДНК 22
2.2.2 Связывание с поверхностью клетки 28
2.2.3 Транспорт в ядро клетки 32
2.3 Носители ДНК в генной терапии 35
2.3.1 Использование катионных липидов в качестве носителей ДНК 36
2.3.2 Катионные полимеры как носители ДНК 38
2.3.3 Использование катионных олигопептидов как носителей ДНК 42
3 Обсуждение результатов 46
3.1 Синтез пептидов 46
3.1.1 Синтез пептидов FP, FP1 и FP4 51
3.1.2 Синтез пептидов N2 HRN2 55
3.1.3 Синтез пептидов N4 HRN4 59
3.2 Изучение вторичной структуры пептидов методом кругового дихроизма 67
3.3 Исследование структуры и размеров комплексов синтезированных пептидов с ДІЖ методом электронной микроскопии 79
3.4 Исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза 81
3.5 Исследование гемолитической активности пептидов 85
3.6 Исследование эндосомолитических свойств пептидов FP1HFP4 88
3.7 Взаимодействие пептидов с аденилатциклазной системой клетки 90
Экспериментальная часть 96
4.1 Материалы 96
4.2 Оборудование 97
4.3 Методы 98
4.3.1 Синтез пептидов FP, FP1, FP4, JTS-1, N2, RN2, N4, RN4 98
4.3.2 Спектроскопия кругового дихроизма 102
4.3.3 Электронная микроскопия комплексов пептид-ДНК 103
4.3.4 Получение комплексов пептид-ДНК и изучение их устойчивости к ферментативному расщеплению методом гель-ретардации (DNase I protection assay) 103
4.3.5 Определение гемолитической активности 104
4.3.6 Оценка эффективности трансфекции комплексами пептид pCMV-nlsLacZ 104
4.3.7 Изучение влияния пептидов на аденилатциклазную систему 106
5 Выводы 107
6 Список литературы 109
Приложение 1 а-Аминокислоты, входящие в состав белков 124
- Комплексообразование и компактизация ДНК
- Использование катионных олигопептидов как носителей ДНК
- Исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза
- Оценка эффективности трансфекции комплексами пептид pCMV-nlsLacZ
Введение к работе
Актуальность работы. В последнее время высокомолекулярные соединения получают все большее распространение в новых биомедицинских технологиях, в частности, в генной терапии, целью которой является коррекция нарушений функционирования генома при помощи двух основных подходов: 1) замены дефектного участка генома нормальным и 2) введения в организм функционально активных генов, продуцирующих необходимые белки или гормоны, либо олигодезоксирибонуклеотидов, регулирующих функциональную активность целевых генов [1-2]. Наиболее распространенным в современной генотерапии способом введения в клетки и ткани терапевтических генов является использование рекомбинантных вирусных векторов, которые обеспечивают высокую эффективность трансфекции, то есть проникновения чужеродного гена. Однако у вирусных векторов есть ряд недостатков. Очень часто они вызывают иммунный ответ, вследствие чего проведение повторных курсов лечения затруднено. Такие векторы также могут встраиваться в геном, что может привести к повреждению других генов. Размер ДНК, которая может быть включена в состав вирусных векторов, ограничен. Кроме того, стоимость их довольно высока и может достигать в настоящее время 200-500 тысяч долларов [3]. Сообщение о смерти одного из пациентов при введении рекомбинантного аденовирусного вектора [4] существенно затормозило все клинические испытания с использованием вирусных векторов и привлекло внимание к поиску новых методов доставки ДНК в клетки и применению невирусных систем, моделирующих отдельные этапы проникновения в клетку вирусов, в том числе полностью синтетических векторов для систематической доставки генов.
Физические методы введения в клетку чужеродного гена (электропорация, бомбардировка микрочастицами с нанесенной на них ДНК и т.д.) не могут широко использоваться из-за низкой выживаемости клеток и невысокой
эффективности - только в отдельных клетках, подвергнутых обработке, введенная ДНК оказывается способной к экспрессии, то есть к считыванию гена и синтезу соответствующего белка. Непосредственная инъекция в ядро хоть и является более эффективной [5], не может быть применена в условиях in vivo. Более перспективными являются искусственные макромолекулярные системы, состоящие из синтетических катионных носителей и ДНК. Идеальная система для невирусной доставки ДНК должна:
быть структурно хорошо охарактеризованной, нетоксичной, биодеградируемой системой, которая защищает ДНК от действия нуклеаз,
обеспечивать доставку ДНК к определенным типам клеток, то есть иметь лиганд для связывания со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны данного типа клеток,
способствовать быстрому рН-зависимому освобождению комплекса из эндосом (клеточных образований, куда попадают из внешней среды крупные частицы и высокомолекулярные соединения) и транспорту ДНК в ядро клетки.
При использовании пептидных носителей ДНК многообещающим является синтез многофункциональных пептидов (в том числе с дендримерной структурой), которые позволяют выполнять несколько вышеупомянутых функций одновременно.
Целью данной работы являлся синтез новых олигомерных соединений, как потенциальных носителей ДНК, на основе катионных олигопептидов с теоретически рассчитанной структурой, в. том числе модифицированных гидрофобными остатками каприновой (декановой) кислоты, что позволяет как усилить их взаимодействие с внешней поверхностью клеточной мембраны, так и способствовать освобождению из эндосом их комплексов с ДНК, а также синтез носителей на основе фрагмента пептидной последовательности вируса иммунодефицита человека HIV-1 Tat (48-60), по литературным данным обладающего способностью проникать через
мембраны клетки и накапливаться в ядре. Звездообразная структура носителей с наличием нескольких таких фрагментов, а также введение лигандов для связывания с рецепторами на поверхности клетки может усилить эти свойства и способствовать более эффективной защите ДНК от ферментативного расщепления и целевой доставке в ядро клетки. Диссертация предусматривала изучение конформационных характеристик синтезированных носителей и изменения структуры ДНК при взаимодействии ДНК-пептид с помощью метода кругового дихроизма. Образование комплексов носитель-ДНК и защита нуклеиновой кислоты от действия гидролитических ферментов также были изучены с помощью гель-электрофореза. Большое внимание в диссертации уделено исследованию способности синтезированных пептидов нарушать целостность биологических мембран (эритроцитарных и эндосомальных) и влиянию на протекание биохимических реакций в клетке на примере аденилатциклазной системы, что обычно упускается из внимания при создании и исследовании носителя.
Научная новизна работы заключалась в теоретическом поиске наиболее оптимальных структур ДНК-связывающих пептидов и синтезе новых катионных олигопептидов, гидрофильно-гидрофобный баланс которых варьировался от сильно гидрофобного пептида со структурой, способствующей формированию амфипатической а-спирали, до гидрофильных димеров и звездообразных тетрамеров на основе фрагмента 48-60 белка вируса иммунодефицита человека. Изучение свойств синтезированных соединений показало зависимость содержания а-спиральной конформации в структуре пептидов и увеличение размеров их комплекса с ДНК от гидрофобности пептида. Кроме того, было обнаружено, что переход от линейной структуры пептида к звездообразной, а также введение лиганда GRGDS резко меняет структуру пептида и его комплекса с
ДНК. Впервые было рассмотрено влияние катионных олигопептидов -носителей ДНК — на протекание биохимических процессов в клетке на примере аденилатциклазной системы и был обнаружен рост базальной активности аденилатциклазы с увеличением гидрофобности пептидов, что можно объяснить усилением их взаимодействия с мембраной клетки. Эти данные подтверждаются также ростом гемолитической активности более гидрофобных пептидов и ярко выраженной способностью амфипатического олигопептида к проникновению через эндосомальную мембрану и их следует принимать во внимание при создании поликатионных носителей ДНК и других биологически активных веществ.
Эти результаты составляют основу выносимых на защиту диссертации положений.
Практическая значимость работы: в результате проведенной работы был синтезирован ряд новых катионных олигопептидов, потенциальных носителей ДНК, и изучены их свойства. Поиск новых компактизующих пептидов, модификация их лигандами, позволяющими осуществлять направленный транспорт к определенным типам клеток и транспорт ДНК в их ядра, а также поиск эндосомолитических компактизующих пептидов, которые могут существенно повысить эффективность проникновения чужеродной ДІЖ в клетку и достигнуть уровня вирусных носителей, избавившись от присущих им недостатков, является одной из главных задач генной терапии. Исследование механизмов проникновения невирусных векторов в клетку, взаимодействия их с клеточными структурами и влияния на биохимические реакции, протекающие в клетке в их присутствии, позволяет определить направление этого поиска. Поэтому проведенная работа является значимой как с научной, так и с практической точки зрения.
Диссертация состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, касающейся данной проблемы, обсуждения результатов проведенной работы,
экспериментальной части, выводов и списка литературы, который включает 137 наименований.
Работа выполнена как часть исследований, проводящихся в ИВС РАН по теме "Гидрофильные синтетические и природные полимеры, биологически активные соединения и материалы на их основе".
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Комплексообразование и компактизация ДНК
Спиральная структура пептида часто образуется при повторении в положениях i/i+3(4) аминокислотной последовательности гидрофобных аминокислот [12-13], например, в случае пептида JTS-1 (GLFEALLELLESLWELLLEA), лейцина (рис. 6). При этом образуется амфипатическая а-спираль с гидрофильным и гидрофобным сегментами, стабилизированная за счет гидрофобных взаимодействий (leucine zipper) [14-15]. Высокое содержание неполярных аминокислот способствует свертыванию пептида в растворе в спираль, причем чем длиннее пептид, тем выше в нем спиральность и тем устойчивее она при повышении температуры.
Электростатические взаимодействия также играют важную роль в формировании а-спирали. Как известно, а-спираль представляет собой макродиполь с одинаковым по величине и противоположным по знаку заряду на N- и С-концах, поэтому концевые заряженные аминокислоты (аспарагиновая кислота, аргинин) могут существенно влиять как на ее стабилизацию, так и на дестабилизацию [17]. Стабилизирующим фактором является образование солевых мостиков между противоположно заряженными аминокислотами, например, глутаминовой кислотой и лизином [18-19], находящихся на разных витках спирали, но пространственно сближенных, а также присутствие катионов металлов (Со2+, Ni2+, Cd2+), действующих как сшивающие агенты [20-21].
Амфипатические ос-спирали являются часто встречающимися фрагментами биологически активных пептидов и белков [22]. Амфипатические пептиды, содержащие такие фрагменты, могут встраиваться в мембраны клеток, вызывая различные эффекты, например, солюбилизацию липидов или формирование пор и лизис клеток (в частности, гемолиз) [23-24]. Это действие зависит в большинстве случаев от протяженности, расположения гидрофобного сегмента [25-27] и того, какие аминокислоты его окружают [27-30]. Основываясь на этом принципе [31], амфипатические ос-спиральные олигопептиды можно разделить на три класса. Амфипатические пептиды класса А, которые характеризуются наличием катионных аминокислотных остатков вблизи гидрофильно-гидрофобной границы и анионных остатков, расположенных напротив гидрофобного сегмента, вызывают солюбилизацию нерастворимых липидов с образованием липопротеиновых частиц. В небольших концентрациях они стабилизируют мембраны. В отличие от пептидов класса А, гормональные пептиды класса Н не обладают сегментом анионных аминокислот, а катион ные аминокислоты представлены в основном аргинином. Амфипатические пептиды класса L, структура которых похожа на структуру класса А, часто имеющие очень большой гидрофобный сегмент и гидрофильный сегмент, содержащий остатки глицина и лизина, вызывают образование каналов и пор в мембранах, что приводит к осмотическому лизису клетки.
Формирование каналов происходит путем агрегирования отдельных молекул пептида, связанных с поверхностью мембраны [32]. Согласно модели, представленной в работе [33] для пептида GALA (WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA), сначала отдельные молекулы пептида связываются с поверхностью липидного бислоя, где происходит их агрегация. Когда число молекул в агрегате достигает 8-12, происходит встраивание их в мембрану и формируются поры, которые в случае этого пептида имеют диаметр 5-Ю ангстрем.
Благодаря способности проникновения через клеточные мембраны амфипатические олигопептиды могут использоваться как носители больших гидрофильных молекул, например, белков или ДНК, для доставки их в клетку [34]. Это открывает возможности для лечения многих заболеваний, в том числе вызванных изменениями на генетическом уровне (генной терапии). В данном случае клетку в виде невирусного вектора вводится либо функционально активный ген, при экспрессии которого синтезируются необходимые белки, либо небольшие олигодезоксирибонуклеотиды, регулирующие функциональную активность других генов. При выборе структуры носителя ДНК необходимо учитывать ряд факторов [3, 5] (рис. 7): 1. ДНК является большим полианионом и сама по себе не может проникнуть в клетку из-за своих размеров и заряда. Поэтому она должна быть сконденсирована до размера, который позволяет протекать эндоцитозу. Кроме того, отрицательные заряды ДНК должны быть нейтрализованы. 2. Комплекс, содержащий сконденсированную ДНК, должен специфически связываться с определенными рецепторами на поверхности клетки для направленной доставки к нужным типам клеток. 3. После проникновения комплекса в клетку, он должен достаточно быстро покидать эндосомы для предотвращения ферментативного расщепления ДНК, то есть один или несколько компонентов носителя должны обладать эндосомолитической способностью. 4. Структура комплекса должна обеспечить транспорт ДНК в ядро клетки и нахождение ее там продолжительное время для долговременной экспрессии гена. Кроме того, основными факторами, определяющим использование носителя in vivo, являются способность к биодеградации, нетоксичность для клеток и низкая иммуногенность. Ни один из описанных до сих пор невирусных векторов не удовлетворяет полностью данному комплексу требований, хотя все они выполняют одну или несколько из описанных выше функций.
Использование катионных олигопептидов как носителей ДНК
Преимуществом вирусных векторов является наличие сигнала ядерной локализации, обеспечивающего высокий уровень экспрессии вносимых генов. Плазмидная ДНК, введенная путем инъекции непосредственно в ядро, в ряде случаев экспрессировалась в 50-100% клеток. В отличие от этого введение в цитоплазму не приводило к значительному результату [60]. Ядерная мембрана является барьером, который препятствует проникновению большинства макромолекул в ядро, если они не способны взаимодействовать с активной транспортной системой [61].
Транспортная система включает как ядерные мембранные белки, так и растворимые белки цитоплазмы [62]. Мембранные белки формируют высокоорганизованную сверхмолекулярную систему, которая называется комплекс ядерной поры (nuclear pore complex). Этот комплекс взаимодействует с группой белков цитоплазмы, обеспечивающих узнавание макромолекул, которые направляются в ядро. Узнавание происходит за счет олигопептидных последовательностей [63], которые называются сигналами ядерной локализации (NLS). Макромолекулы, имеющие NLS, связываются с цитоплазматическими рецепторами - кариоферинами (импортинами) — и направляются к ядерным порам.
Животные клетки обычно имеют несколько тысяч ядерных пор, каждая из которых состоит, по меньшей мере, из 30 белков и имеет массу примерно 100 МДа. Ядерная пора имеет цилиндрическую форму диаметром около 125 нм. Внутри ядерной поры находится центральная гранула, которая препятствует свободной диффузии макромолекул. Центральная гранула способна менять положение или конформацию при определенных условиях. От центральной части, связанной с мембраной, внутрь ядра и в цитоплазму отходят фибриллы, длиной 100-200 нм. Эти фибриллы обеспечивают взаимодействие кариоферинов с ядерной порс-Я. Ядерные поры позволяют протекать свободной диффузии молекул размером примерно до 9 нм, хотя даже небольшие по размеру нуклеопротеины, такие как гистоны, проникают через них путем активного транспорта, так как свободная диффузия протекает очень медленно. Однако неизвестно, как ядерная пора открывается или как на ее размер влияет размер субстрата.
Сигналы ядерной локализации начали описывать в течение последних пятнадцати лет. Определенной последовательности NLS нет, однако прослеживаются некоторые закономерности в их построении. Обычно они включают кластеры четырех или более катионных остатков и часто ограничены по краям прерывающими а-спираль аминокислотами -пролином или глицином, которые сильно влияют на активность лиганда в качестве сигнала ядерной локализации. NLS-опосредованный транспорт в ядро часто сопровождается фосфорилированием остатков серина по краям лиганда, увеличивая сродство к кариоферину/импортину ос. Объемные остатки триптофана и тирозина внутри сигнала ядерной локализации встречаются крайне редко.
Имеются два типа NLS (табл. 1) - отдельные кластеры катионных остатков (которые для увеличения эффективности связывания должны быть повторены несколько раз), и сигналы, состоящие из двух частей, разделенных спейсером из 10-12 остатков. Консенсус-последовательность для второй группы примерно следующая: K/R-K/R-(10-12 аминокислот -cneficep)-K/R-K/R-K/R, где K/R - лизин, или аргинин. Предполагается, что вторая группа NLS имеет большее сродство к кариоферину/импортину ос, с которым происходит взаимодействие на первом этапе. Затем образовавшийся комплекс связывается с кариоферином/импортином р. Гетеротример направляется к ядерной поре и транспонируется в ядро в присутствии ГТФазы. Скорость, с которой происходит этот процесс, довольно высокая. Например, через одну ядерную пору клетки HeLa в минуту импортируется 100 рибосомальных белков и экспортируется 3 рибосомальных субъединицы. В некоторых случаях связывание сигнала ядерной локализации, вероятно, происходит непосредственно с кариоферином/импортином р, как в случае пептида HIV-1 Tat (48-60) (GRKKRRQRRRPPQ) [64-65], который также представляет собой NLS.
Исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза
В аминокислотную последовательность пептидов были введены N-концевые остатки цистеина, отделенные от основной последовательности фрагментом є-аминогексановой кислоты, для возможности дальнейшей модификации пептидов с участием активной сульфгидрильной группы.
Как показывают литературные данные, введение одного гидрофобного остатка не только не мешает взаимодействию пептида с нуклеиновой кислотой, но и способствует появлению у пептида способности к ее компактизации. Оптимальным в этом случае оказался остаток каприновой (декановой) кислоты - дальнейшее увеличение длины гидрофобного радикала не приводило к существенному увеличению связывающей способности [94]. Более того, с увеличением длины гидрофобного радикала можно ожидать ухудшения растворимости соединения в воде. Поэтому для модификации катионных пептидов нами была выбрана именно эта кислота.
В случае пептида FP4 гидрофобные остатки находятся в положениях і/і+3(4), что способствует появлению у структуры амфипатического характера и является дополнительным фактором, способствующим спирализации. При этом образуется один гидрофобный сегмент, который не препятствует взаимодействию с ДНК (рис. 11).
Таким образом, с помощью полученных пептидов можно проследить изменение комплексообразующей способности и мембранной активности при переходе от катионного пептида (FP), не содержащего гидрофобных радикалов, через пептид с одним остатком каприновой кислоты (FP1) к пептиду со структурой, способствующей формированию амфипатической ос-спирали с четырьмя гидрофобными фрагментами (FP4).
Вторым важным рассмотренным нами направлением в поиске носителей ДНК является синтез многофункциональных молекул с разветвленной структурой. Как известно, использование дендримерных структур существенно увеличивает уровень экспрессии ДНК [100-102]. Это, вероятно, объясняется сходством данных соединений с глобулярной структурой гистонов, используемых для хранения и считывания ДНК в клетке. Кроме того, наличие повторяющихся элементов в молекуле дендримера делает комплекс менее чувствительным к потере одного или нескольких из них вследствие ферментативного расщепления. Одним из путей введения в дендримерную молекулу лигандов для взаимодействия с рецепторами и транспортными молекулами, а также эндосомолитических компонентов, может быть предварительная модификация поверхностных аминогрупп, например, введением бромацетильных фрагментов или альдегидных групп, с последующим присоединением по этим активным группам соответствующих пептидных последовательностей. Построение дендримерной структуры на основе пептидов имеет определенные сложности, связанные с синтезом и дальнейшей очисткой полученных соединений, так как целевой высокомолекулярный пептид невозможно отделить от побочных продуктов с дефектами структуры, которые неизбежно возникают в процессе синтеза [103]. Альтернативным путем является синтез с использованием небольших фрагментов, соединяемых далее в одну большую молекулу.
В качестве такого фрагмента нами был выбран фрагмент 48-60 пептидной последовательности белка Tat вируса иммунодефицита человека (GRKKRRQRRRPPQ), который представляет собой сигнал ядерной локализации (NLS) и обладает способностью к проникновению через мембраны клеток и транспорту в ядро даже при низкой температуре (4 С), когда многие биохимические реакции затормаживаются. Механизм проникновения данного пептида остается еще неясным, но может быть связан либо с инверсией липидного бислоя, либо с обычным эндоцитозным путем (что находит все большее подтверждение) [104-105]. Тем не менее, литературные данные показывают, что олигомеризация подобного рода фрагментов существенно увеличивает эффективность проникновения комплексов носитель-ДНК в клетку [106]. В данной работе нами был синтезирован димер на основе лизина, имеющий два фрагмента HIV-1 Tat (48-60), который был также модифицирован лигандом, содержащим последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (GRGDS) для специфического связывания с поверхностью клетки (рис. 12). Данный димер служил основой для синтеза тетрамерной звездообразной структуры (рис. 13).
Для синтеза пептидов был использован твердофазный метод, который основан на последовательном присоединении аминокислот к растущей полипептидной цепи, закрепленной на полимерном носителе. При этом становится возможным эффективное удаление избытка неприсоединенной аминокислоты и побочных продуктов реакции из реакционной смеси, что, по сравнению с синтезом в растворе, является большим преимуществом при получении больших олигопептидов. После достижения желаемой длины пептидной последовательности следует снятие продукта с полимерного носителя, при этом, в зависимости от вида полимерного носителя, получают различные С-концевые группы: амидную, карбоксильную, азидную и т.д. В работе была использована п-метилбензгидриламинная смола, при отщеплении пептида с которой с помощью раствора трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте или жидкого фтороводорода получается С-концевая амидная группа. На этой последней стадии боковые защитные группы аминокислот, за исключением ацетамидометильной защитной группы цистеина, также отщепляются, что делает невозможным дальнейшее селективное введение гидрофобных фрагментов, поэтому в растущую полипептидную цепь непосредственно вводили лизин, ацилированный по є-аминогруппе остатком каприновой кислоты, который получали по следующей схеме. Сначала с помощью дициклогексилкарбодиимида был синтезирован так называемый активированный эфир пентафторфенола и декановой кислоты (I), который за счет электроноакцепторных свойств атомов фтора является сильным ацилирующим агентом:
Оценка эффективности трансфекции комплексами пептид pCMV-nlsLacZ
Поликатионные пептиды при образовании комплекса нейтрализуют отрицательный заряд ДНК, что сопровождается изменением ее электрофоретической подвижности. Кроме того, образование комплексов, размеры которых препятствуют вхождению в поры геля, также вызывает изменение электрофоретической подвижности нуклеиновой кислоты. При этом можно обнаружить соотношение пептид-ДНК, при котором происходит полная задержка нуклеиновой кислоты в геле, и оценить соотношение компонентов для ее эффективного связывания и защиты от ферментативного расщепления (рис. 33-34).
Как видно из полученных данных, полная задержка ДНК в случае пептида FP4 наблюдается при зарядовом соотношении ДНК/носитель 1/1 и выше, а пептиды FP и FP1 связывают ДНК уже в соотношении 1/0,7. Следует отметить, что при увеличении концентрации FP и FP4, свечение комплексов в лунках остается практически неизменным, в отличие от FP1, что, видимо, означает увеличение плотности комплексов при возрастании концентрации пептида FP1. При этом образующиеся комплексы ДНК-пептид становятся непроницаемыми для бромистого этидия, интеркалирующего красителя, который использовался для обнаружения ДНК. Подобный эффект наблюдался для ряда носителей на основе липосом DOTAP/DOPE (1,2-бис(олеилокси)-3-триметиламмоний пропан / диолеилфосфатидилэтанол-амин), наиболее широко использующихся в экспериментах по доставке ДНК [72], а также на основе лизиновых дендримеров, также модифицированных гидрофобными радикалами [102]. Комплексы же с FP и FP4, как и в случае пептидов на основе фрагмента вируса иммунодефицита человека, в достаточной степени «рыхлые» для его проникновения, и затухания флуоресценции комплекса не происходит.
Для изучения устойчивости комплексов плазмидной ДНК с пептидами к ферментативному гидролизу, их инкубировали с ферментом ДНКаза I при 37С в течение 1 часа. При этом происходило расщепление плазмидной ДНК, если содержание пептида было недостаточно для ее эффективной защиты. После выделения нуклеиновой кислоты степень ее защиты была проанализирована с помощью электрофореза в агарозном геле. В качестве положительного контроля использовалась нативная ДНК, а в качестве отрицательного контроля - ДНК, подвергшаяся воздействию фермента в отсутствие пептида. Как видно из приведенных данных, в этом случае наблюдается полное расщепление ДНК с образованием коротких фрагментов. Полная защита плазмиды от действия ДНКазы I происходит при более высоком содержании пептидов в комплексе, чем необходимо для полной компактизации ДНК. Эффективная защита плазмидной ДНК носителем FP от действия фермента наблюдается, начиная с зарядового соотношения 1/1,4. При зарядовом соотношении 1/0,7, помимо конформационных форм характерных для интактной плазмиды, в геле можно видеть фрагменты гидролизованной ДНК, что свидетельствует о ее частичном распаде. FP1 и FP4 защищают ДНК, начиная с соотношения 1/0,7. Увеличение содержания носителя в комплексе необходимо также для пептидов N2 и RN2 - примерно в полтора раза. Однако для разветвленных пептидов N4 и RN4 эффективная защита наблюдается при том же соотношении, что и полная задержка плазмиды в геле, что, вероятно, объясняется иной структурой их комплексов с ДНК.
Таким образом, исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом гель-электрофореза подтверждает данные, полученные методами кругового дихроизма и электронной микроскопии об особой структуре комплексов пептидов с разветвленной структурой по сравнению с линейными пептидами. Тем не менее, все пептиды обнаруживают способность к компактизации и защите нуклеиновой кислоты от ферментативного гидролиза при довольно низком соотношении пептид/ДНК и могут являться носителями ДНК для ее доставки в клетку.
Как уже было отмечено, важным фактором, влияющим на проникновение комплекса ДНК с носителем в клетку, является его эндосомолитическая способность, то есть способность к проникновению через мембраны эндосом в цитоплазму клетки. Несмотря на то, что синтезированные пептиды способны к комплексообразованию с ДНК, необходимым условием для возможности применения их в качестве компонента невирусного вектора является наличие у них мембранной активности. Поэтому важным этапом работы являлось исследование взаимодействия полученных соединений с мембранами. В качестве модельных были выбраны мембраны эритроцитов, которые широко используются для изучения белково-липидных взаимодействий (табл. 9). Под действием осмотического шока в гипотонических растворах в мембране эритроцита образуется одно большое отверстие диаметром около 1 мкм, размер которого затем уменьшается до 14-280 ангстрем. При этом происходит разрушение клетки (гемолиз) и выход различных метаболитов, ионов и больших макромолекул, в том числе гемоглобина, содержание которого в супернатанте и степень гемолиза можно измерить фотометрически. Гемолитическое действие оказывают также многие природные и синтетические пептиды, например, меллитин и JTS-1 (так называемый биологический гемолиз) Таким образом, эритроциты являются удобной моделью для исследования мембраной активности различных соединений.
Для сравнения при изучении гемолитической активности полученных пептидов использовался порообразующий пептид JTS-1, добавление которого в комплекс носителя с ДНК способствует освобождению комплекса из эндосом. Как видно из приведенных данных (рис. 35), гемолитическая активность находится в зависимости от гидрофобности пептидов и рН среды. С увеличением гидрофобности гемолитическая активность возрастает: FP4 » JTS-1 FP1 FP N2, N4, RN2, RN4.
Похожие диссертации на Катионные Z-спиральные олигопептиды - носители ДНК
