Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 13
1.1. Метод тканевой инженерии на примере восстановления костной ткани 13
1.1.1. Требования к скаффолдам и материалам, используемым в инженерии костной ткани 14
1.1.2. Полимерные скаффолды 15
1.1.2.1. Биодеградируемые полимеры 15
1.1.2.2. Методы получения скаффолдов на основе биодеградируемых полимеров 17
1.1.2.3. Гидрогели 18
1.1.3. Неорганические скаффолды 19
1.1.4. Композитные полимерно-неорганические скаффолды 20
1.1.5. Получение биофункциональных гибридных скаффолдов 21
1.2. Гидрофильные полимеры для биомедицинского применения 23
1.2.1. Основные требования к полимерам-носителям 24
1.2.2. Синтез полимеров носителей 25
1.2.3. Введение реакционных групп в полимеры-носители 27
1.2.4. Поливинилсахариды 30
1.2.4.1. Синтез винилсахаридов 31
1.2.4.2. Синтез поливинилсахаридов 32
1.2.4.3. Биологические свойства поливинилсахаридов 35
1.3. Адсорбция полимеров из растворов на твердых поверхностях 36
1.3.1. Влияние молекулярной массы полимера на его адсорбцию 38
1.3.2. Влияние растворителя на адсорбцию полимеров 39
1.3.3. Влияние электростатических взаимодействий на адсорбцию полимеров 40
1.3.4. Десорбция полимеров 41
1.4. Функционализация гидрофильных полимеров биолигандами 42
1.4.1. Регулирование взаимодействия поверхность - клетка и клеточного роста 42
1.4.2. Реакции, используемые для модификации полимеров БАВ 47
1.4.3. Особенности связывания белков с гидрофильными полимерами 49
1.5. Культуры клеток и регенерация ткани 52
1.5.1. Источники и типы клеток 52
1.5.2. Культуры клеток в тканевой инженерии 53
1.5.3. Стадии роста новой костной ткани 53
2. Экспериментальная часть 55
2.1. Материалы 55
2.2. Оборудование 56
2.3. Методы 59
2.3.1. Синтез полимеров и их альдегидсодержащих производных 59
2.3.2. Определение состава и физико-химических параметров полученных полимеров 62
2.3.3. Методы исследования адсорбции полученных полимеров на неорганических матрицах 66
2.3.4. Методы синтеза конъюгатов полученных полимеров с биолигандами 68
2.3.5. Методы качественного и количественного детектирования образования конъюгатов и определения их гидродинамических параметров 71
2.3.6. Методы исследования адсорбции и десорбции конъюгатов (минеральная матрица Sponceram) 75
2.3.7. Получение модели клетки и изучение ее взаимодействия с GRGDSP-пептидом методом аффинной хроматографии 76
2.3.8. Эксперименты с клеточными культурами 79
2.3.9. Оценка погрешностей измерений 81
3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Синтез полимеров-носителей с контролируемым содержанием альдегидных групп 84
3.1.1. Синтез пМАГ и получение реакционно-способных альдегидных групп методом полимераналогичных превращений (периодатное окисление) 86
3.1.2. Изучение возможности введения альдегидных групп на стадии сополимеризации. Синтез сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) и получение их альдегидсодержащих производных 89
3.2. Биофункционализация полученных полимеров 95
3.2.1. Конъюгаты полимеров с биолигандами различной функциональности 97
3.2.2. Создание полифункционального полимерного вектора 108
3.3. Гидродинамические характеристики полученных полимеров и конъюгатов 113
3.3.1. Изучение гидродинамических параметров методом вискозиметрии 112
3.3.2. Исследование полимеров и их конъюгатовметодом светорассеяния 118
3.4. Адсорбция полученных полимеров и конъюгатов 121
3.4.1. Сравнительное изучение адсорбции синтезированных полимеров на различных минеральных матрицах 122
3.4.2. Адсорбция и десорбция синтезированных полимеров на монолитной керамике.. 125
3.4.3. Адсорбция и десорбция синтезированных биоконъюгатов 128
3.4.4. Изучение адсорбции полимеров и конъюгатов на Sponceram методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии 131
3.5. Апробация полимерно-неорганических скаффолдов для инженерии костной ткани 133
3.5.1. Активность GRGDSP пептида как интегринсвязывающего лиганда 133
3.5.2. Эксперименты в культуре клеток 138
Выводы 150
Список литературы 152
Приложение 165
- Полимерные скаффолды
- Адсорбция полимеров из растворов на твердых поверхностях
- Синтез полимеров и их альдегидсодержащих производных
- Получение модели клетки и изучение ее взаимодействия с GRGDSP-пептидом методом аффинной хроматографии
Введение к работе
В настоящее время высокомолекулярные соединения широко используются в различных областях биологии и медицины благодаря предоставляемой ими возможности варьировать свойства материала в зависимости от состава и структуры используемых макромолекул.
Разработано огромное количество полимерных биоматериалов, удовлетворяющих требованиям биосовместимости и выполняющих различные функции [1-8], в частности, имплантантов для замены поврежденного или утраченного участка костной ткани [9]. Особый интерес представляет использование высокомолекулярных соединений в методе инженерии костной ткани, основанном на помещении клеток, полученных из тканей пациента, на трехмерный носитель
(скаффолд) [8], где происходит образование ткани за счет роста и дифференциации клеток [2,
4, 7]. Развитие данного метода продемонстрировало, что для направления процесса в сторону образования костной ткани скаффолды должны функционировать в качестве системы контролируемой доставки биологических сигналов, управляющих поведением клеток [8, 11]. Поэтому возникает фундаментальный интерес изучения условий прочного связывания биологических молекул (лигандов) с поверхностью скаффолда. Несмотря на интенсивные исследования различных полимерных носителей на основе синтетических полимеров (полилактид, полигликолид) и природных биополимеров (хитозан, коллаген) [8], к настоящему моменту не существует скаффолдов, удовлетворяющих как требованиям механической прочности, так и предоставляющих возможности биофункционализации. Кроме полимеров, в качестве обсуждаемых каркасов для инженерии костной ткани используются макропористые керамические матрицы, обладающие достаточной механической прочностью и сходством со структурой неорганической составляющей костей.
В связи с вышесказанным, актуальной задачей представляется создание нового типа скаффолдов, сочетающих в себе керамическую и полимерную составляющие. При этом использование в качестве последней гидрофильных полимеров-носителей, ковалентно модифицированных специальными биологическими молекулами, открывает новые возможности применения полимеров в инженерии костной ткани. Подобный подход является оригинальным и не имеет описанных в литературе аналогов.
Предложенная в данной работе стратегия создания «интеллигентных» гибридных носителей клеток основана на идее адсорбционного покрытия трехмерной макропористой керамической матрицы биосовместимым полимером, способным к ковалентному связыванию биологических молекул (лигандов) без разрушения основной цепи. Биологическая полифункциональность должна обеспечиваться связыванием с полимерной составляющей конструируемого скаффолда лигандов различной специфичности. Минеральная составляющая, в данном случае, обеспечивает механическую прочность и поддержку трехмерного роста клеток, в то время как биофункционализированный полимерный компонент ответствен за передачу клеткам сигналов, управляющих их поведением на поверхности гибридной матрицы.
Таким образом, целью работы являлось создание полимерной системы, несущей биолиганды, и адсорбированной на поверхности неорганической матрицы с образованием материала, пригодного для использования в качестве скаффолдов для инженерии костной ткани, обеспечивающих интенсивную адгезию и рост клеток.
В задачи работы входило: • синтез и исследование полимеров-носителей, содержащих контролируемое количество реакционно-способных групп, способных к ковалентному связыванию биологически активных молекул (биолигандов); • контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями; • получение полифункционального полимерного «вектора», содержащего биолиганды различных типов; • изучение гидродинамических характеристик исходных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами различных молекулярных размеров; • исследование адсорбции полученных полимеров-носителей на различных неорганических материалах и выбор матрицы для создания гибридных скаффолдов; • изучение адсорбции и десорбции синтезированных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами на выбранном неорганическом материале; • оценка цитотоксичности полимеров-носителей и их конъюгатов с целевыми биолигандами и исследование влияния введения различных биолигандов в полимерную составляющую гибридного скаффолда на поведение живых клеток.
Возможность создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани, состоящих из неорганической составляющей и полимера-носителя, ковалентно модифицированного биологическими молекулами, обеспечивающего биофункциональность поверхности, являлась объектом исследования.
В качестве методов исследования использовались: • метод свободно-радикальной полимеризации и сополимеризации, периодатного окисления а-гликолей и снятия диэтилацеталыюй защиты для синтеза полимеровносителей; • метод N-алкилирования для ковалентного связывания полимеров-носителей с биолигандами различного молекулярного размера; • методы ЯМР спектроскопии, а также спектроскопии в ИК-, УФ- и видимой областях для характеристики полученных полимеров-носителей; • методы вискозиметрия и светорассеяние для изучения гидродинамических параметров полимеров-носителей и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера; • методы ПААГ электрофореза и ИК-спектроскопии для качественного, а также метода флуоресцентного анализа и спектроскопии в видимой области для количественного определения связывания биолигандов с полимерами-носителями; • методы фотометрического анализа и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии для изучения адсорбции и десорбции полученных полимеров и конъюгатов; • фронтальный метод анализа в аффинной хроматографии для количественной оценки комплементарного взаимодействия рецептора модели клетки (интегрином) с биолигандом (RGD-пептидом), иммобилизованным на поверхности сорбента, имитирующего скаффолд; • специальные биологические методы работы с культурами клеток и построения кинетических и концентрационных зависимостей количества жизнеспособных клеток при их контакте с различными материалами.
Научная новизна работы состоит в следующем: • Разработана новая стратегия создания биофункциональных полимернонеорганических скаффолдов для инженерии костной ткани, заключающаяся в использовании гидрофильного полимера-носителя в качестве подвижного спейсера, адсорбционно связанного с поверхностью неорганической макропористой подложки и модифицированного биомолекулами способными интенсифицировать процессы адгезии и роста клеток.
• Впервые получены полимеры-носители на основе поливинилсахаридов, содержащие контролируемое количество реакционно-способных альдегидных групп.
• Впервые проведено контролируемое ковалентное связывание аминосодержащих биолигандов различной функциональности (GRGDSP-пептид, поли-Ь-лизин, фактор роста и дифференциации клеток ВМР-2) с полученными полимераминосителями и доказана возможность создания полифункциольнального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов на одной полимерной цепи.
• Комплексом независимых методов доказана возможность адсорбции полученных полимеров и конъюгатов на поверхности керамических матриц.
• Методами вискозиметрии и светорассеяния определены гидродинамические параметры полученных конъюгатов поливинилсахаридов с лигандами различного молекулярного размера.
• На основании тестов на цитотоксичность полученных полимеров в растворе и адсорбированном состоянии, а также гибридных скаффолдов, в полимерную составляющую которых введены биомолекулы различной функциональности, показана возможность использования конъюгированных с биолигандами гидрофильных полимеров-носителей в качестве фактора, управляющего поведением клеток.
Практическая значимость работы. Разработан и экспериментально апробирован технологический принцип создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани.
На примере синтезированных альдегидсодержащих поливинилсахаридов, показана перспективность контролируемой модификации полимеров-носителей специальными биомолекулами с получением моно-, би- и полифункциональных конъюгатов и последующем введением их в состав гибридных скаффолдов путём адсорбции для интенсификации процессов адгезии и роста клеток.
Основные положения, выносимые на защиту: • Создано первое поколение гибридных скаффолдов включающих в себя полимерноситель, несущий лиганды, обеспечивающие адгезию и рост клеток.
• Поливинилсахариды, вследствие проявляемого ими собственного неспецифического сродства к клеточным мембранам, перспективны в качестве полимерной составляющей гибридных скаффолдов; • Путем полимераналогичных превращений, а также и методом сополимеризации с защищенным альдегидным мономером возможно контролируемое введение в поливинилсахариды альдегидных групп; • Условия контролируемого введения биолигандов различной функциональности и молекулярного размера в альдегид-содержащие поливинилсахариды с различной структурой реакционно-способного звена, а также получения полифункционального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов; • Выбор оптимальной керамической матрицы для создания скаффолдов обсуждаемого типа по результатам сравнительного изучения адсорбции; • Способность полученных полимеров-носителей и их конъюгатов образовывать адсорбционное покрытие на поверхности минеральной матрицы; • Отсутствие цитотоксичности полученных полимеров в адсорбированном виде и положительное влияние их конъюгатов с биолигандами на адгезию и рост клеток на поверхности гибридных скаффолдов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: 1-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), «European BioPerspectives 2007» (Кёльн, Германия, 2007), «20th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology» (Дрезден, Германия, 2007), «Baltic Polymer Symposium 2007» (Друскининкай, Литва, 2007), 4-я СанктПетербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практических семинарах в Институте Высокомолекулярных Соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и в Институте Технической Химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Работа была поддержана грантами РФФИ (№ 05-03-32310) и Немецкого Научного Общества (DFG, КА 1784/4-1). Для выполнения части исследования на территории Германии автор получил персональную стипендию Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD, с 1.09.2006 по
28.02.2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано тринадцать печатных работ, включающих 4 полнотекстовые статьи в журналах Journal of Applied Polymer Science, Bioconju- gate Chemistry, Журнал Прикладной Химии и в Трудах Международной конференции «Baltic Polymer Symposium 2007», а также 9 тезисов устных и стендовых докладов.
Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов, Списка литературы и Приложения. Материалы диссертации изложены на 166 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 61 рисунком, список цитируемой литературы включает 197 источников.
Полимерные скаффолды
Скаффолды должны иметь структуру, которая выполняет функцию шаблона (или матрицы) для роста ткани в трех измерениях и стимулирует этот рост в форме, заданной скаф-фолдом [8]. С целью обеспечения трехмерного роста ткани, структура матрицы должна обладать сетью макропор. Взаимосвязанная сеть пор необходима для того, чтобы позволить клеткам мигрировать по каркасу и способствовать росту ткани во всем его объеме. При культивировании клеток in vitro, а также в процессе роста ткани, наличие такой структуры позволит культуральной среде достигать всех клеток, снабжая их необходимыми питательными веществами. После имплантации наличие внутрипоровой структуры обеспечит беспрепятственный доступ крови к клеткам образовавшейся in vitro ткани. В конечном счете, «идеальные» скаффолды должны стимулировать рост кровеносных сосудов внутри сети пор. При этом необходимо, чтобы минимальный диаметр пор и отверстий между их объемами составлял не менее 100 мкм [19]. Важным моментом является соответствие механических свойств искусственного материала с теми же свойствами костной ткани организма-хозяина. При этом критическими эти свойства являются только для окончательного конструкта, предназначенного для имплантации [19]. Скаффолды должны действовать в качестве системы контролируемой доставки сигналов, активирующих клетки и гены. Поэтому их материал должен предоставлять возможность функционализации его специальными биомаркерами, а именно, пептидами и белками [8, 19]. В настоящее время полимеры являются основным материалом для изготовления каркасов в инженерии тканей, в том числе, костной ткани [8, 19, 20]. Использование полимеров для конструирования современных скаффолдов обусловлено в значительной степени уникальными химическими и физико-химическими свойствами данных материалов.
При этом, в основном, используемые полимеры представляют собой нерастворимые в воде материалы: гидрофобные биодеградируемые матрицы и гидрогели [20]. В литературе принято различать два типа полимерных материалов, используемых в биомедицинских целях, а именно, биодеградируемые и недеградируемые полимеры [9, 20, 21]. В основе подобного разделения лежит взаимодействие полимеров в организме с биологическими жидкостями и окружающими тканями, обусловленное, в основном, способностью полимеров к растворению в воде, а также к химическому или ферментативному гидролизу. Материалы на основе гидрофобных полиолефинов и полисилоксанов, представляющих собой типичные примеры недеградируемых полимеров, не взаимодействуют с биологическим окружением и со временем обрастают тканевой капсулой. Поэтому подобные полимеры часто используются для производства имплантантов, замещающих механическую функцию кости в течение длительного периода времени, а именно, от одного года до нескольких лет [9]. Применение полимерных материалов в тканевой инженерии, как уже указывалось выше, предполагает их распад в организме по мере роста и формирования новой ткани. Процесс биодеградации полимера в организме, осуществляется в результате двух явлений [9, 21, 22]: 1. непосредственный переход в раствор полимерных молекул (биорассасывание поли мерного материала); 2. химический и ферментативный гидролиз (как во внеклеточном пространстве, так и при поглощении частиц материала гигантскими клетками макрофагами). Протекание этих процессов начинается с поверхности и реализуется после проникно вения в поверхностные слои материала окружающей его жидкой среды, представляющей со бой растворы различных неорганических и органических веществ. Таким образом, одним из основных факторов, оказывающих существенное влияние на устойчивость полимерного ма териала к биодеградации, являются его способность к сорбции воды и интенсивность диффу зии в него окружающей водной среды [23]. Эти факторы ускоряют разложение полимера при наличии в его структуре гидрофильных групп. Наиболее часто в качестве биодеградируемых материалов используются полимеры, способные к распаду за счет гидролиза связей содержащихся в них полярных групп [24-25].
Желательно также, чтобы образовавшиеся продукты деструкции представляли собой обычные для организма метаболиты [26]. Ввиду указанных причин наиболее часто используемыми полимерами для создания скаффолдов для инженерии костной ткани являются поли-а-гидроксикарбоновые кислоты — полигликолид (ПГ) и полилактид (ПЛ), а также их сополимеры (ПЛГ) [27-29], поли-3-гидроксибутират [29, 30], полиортоэфиры [31], и, наконец, различные природные полимеры: коллаген [32], фибрин [33], полигиалуроновая кислота [34], хитозан [35] и альгинат [36]. В настоящее время существует несколько методов получения полимерных скаффолдов. Метод вымывания солей является одним из самых простых способов получения макропористых полимерных структур. В качестве порогена выступает соль (например, хлорид натрия или хлорид аммония), которую смешивают с раствором полимера в органическом растворителе. После достижения равномерного распределения соли в объеме раствора, его выливают в заготовку желаемой формы. Полимер высушивают, а соль вымывают водой. В результате образуется высокопористые губчатые структуры, пригодные для работы с культурами клеток териала с открытыми порами. Изменяя тип полимера, его концентрацию, растворитель и температуру фазового разделения, можно варьировать микро- и макроструктуру материала. Сочетание данного метода с описанным выше позволяет получать полимерные гидрогели с развитой внут-рипоровой структурой (Рис. 3) [37-39]. Метод вспенивания газом основан на насыщении полимера газом (обычно ССЬ) при высоком давлении с последующим снижением последнего до атмосферного. Вызванная таким образом термодинамическая нестабильность вызывает разделение фаз полимера и газа, молекулы которого группируются, образуя зародыши пор. Рост пор осуществляется благодаря диффузии молекул газа из поли мерной матрицы к ядру поры. В результате образуется полимер с высокой пористостью (до 95%), но с преимущественно закрытыми порами. Получение материала с внутрипоровой (Рис. 4) структурой возможно благодаря сочетанию описанного процесса с методом вымывания солей [41]. Довольно широкое распространение получили различные методы печати трехмерных матриц с использованием специальных принтеров [8]. В основе идеи данного метода лежит возможность сканирования поврежденной кости с помощью компьютерной томографии, позволяющего получать данные о точной архитектуре и форме необходимых скаффолдов, которые записываются в спе- рис. 4. СЭМ фотография макропорис-циальные файлы системы компьютерного конст- того материала на основе сополимера гч д. - гликолиевой и молочной кислот полу руирования. Эти файлы, в свою очередь, можно ис- у ченного методом вспенивания газом пользовать для струйной трехмерной печати матриц Г -., (SFF - solid freedom fabrication). При этом вместо чернил используется как чистый полимер [42], так и полимер, наполненный частицами три-кальцийфосфата [43] или гидроксиапатита [44]. В качестве полимерной составляющей в превалирующем числе работ были использованы сополимеры ПГЛ различного состава, а также смеси ПГЛ с ПЛ [8, 19, 45].
Адсорбция полимеров из растворов на твердых поверхностях
Предлагаемый в данной работе подход к созданию гибридных скаффолдов для инженерии костной ткани предполагает адсорбционное покрытие трехмерной макропористой минеральной матрицы гидрофильным полимером, несущим ковалентно связанные (конъюгиро-ванные) биоспецифические лиганды. Возможность создания подобных материалов определяется наличием адсорбционного сродства между выбранным типом полимеров и используемой поддерживающей средой. Адсорбция полимеров широко используется в различных технологических системах, а именно, в дисперсиях частиц, в процессах флоккуляции, при обработке твердых поверхностей, для повышения гемосовместимости полимерных материалов и т. д. Во всех перечисленных процессах адсорбцию полимера осуществляют с целью модифицирования взаимодействий между поверхностями [130]. Известно, что адсорбция полимеров существенно отличается от адсорбции низкомолекулярных веществ [130, 131]. Специфика обсуждаемого в данном параграфе процесса обусловлена разнообразием конформаций, которые может принимать гибкая макромолекула в объеме раствора и на межфазовой поверхности. Поэтому строгое теоретическое рассмотрение адсорбции полимеров возможно только на основе статистических методов [131-133]. Необходимо отметить, что, несмотря на значительное количество работ в этой области, теория адсорбции и адсорбционного взаимодействия макромолекул на границе раздела фаз раствор -твердое тело разработана еще недостаточно для предсказания вида изотерм и объяснения многих экспериментальных фактов. Адсорбированная гибкоцепная макромолекула (в том числе, и гидрофильная) локализована на поверхности (Рис. 9), контактируя с ней только частью молекулярных сегментов («шлейфы»). Другая часть, оставаясь в объеме раствора, образует «петли», в то время как сегменты, находящиеся на концах макромолекулы, погружены в раствор («хвосты»). Современные статистические теории позволяют определить распределение по длинам этих трех типов сегментов [134]. Скорость установления равновесия при адсорбции зависит от химической природы полимера, его ММ, растворителя и типа адсорбента.
Взаимодействие между полимером и поверхностью адсорбента может осуществляться за счет сил Ван-дер-Ваалься, водородных связей, а также, в случае наличия у макромолекул и поверхности противоположных зарядов, за счет сил электростатического притяжения. В большинстве случаев, кинетические кривые указывают на увеличение адсорбированного полимера во времени с асимптотическим приближением к равновесному значению. Почти всегда стадией, определяющей скорость адсорбции, является диффузия полимеров к поверхности адсорбента или в его поры. В отличие от пористых фаз, в случае использования непористых адсорбентов, равновесие устанавливается очень быстро, от нескольких секунд до минут. Скорость процесса адсорбции на пористых носителях существенно зависит от размера пор, распределения этих размеров, удельной поверхности поровой среды, а также от наличия или отсутствие перемешивания [130, 131]. Чаще всего адсорбцию полимера оценивают количественно по убыли его концентрации в растворе, измеряемой после физического связывания макромолекул с поверхностью [131]. С термодинамической точки зрения, главной движущей силой адсорбции полимера является сильное взаимодействие его звеньев с поверхностью. При этом, как уже было сказано выше, важными характеристиками являются ММ и ММР полимера, его взаимодействие с растворителем, а также наличие или отсутствие заряда на полимерной цепи и поверхности адсорбента [130]. 1.3.1. Влияние молекулярной массы полимера на его адсорбцию Зависимость емкости монослоя адсорбированного полимера Ат от средней ММ поли мера М выражается уравнением предложенным Перкелем и Алманом [130]: Av = kMa , где - к - константа пропорциональности; а - параметр, зависящий от конформации адсорбированной макромолекулы. Обычно значения а находятся в пределах от 0, что соответствует плоской ориентации адсорбированных макромолекул (независимость массы адсорбированного полимера от ММ), до 1, что говорит об адсорбции макромолекул за счет закрепления одним концом (прямая пропорциональность между Ат и средней ММ). На практике для большинства полимеров установлено, что они адсорбируются в конформации клубка, и а обычно лежит в пределах 0.3-0.5 [130]. На Рис. 10 на примере адсорбции поливинилового спирта из водных растворов на поверхности полистирольного латекса представлена зависимость процесса от ММ полимера [135]. Существенно, что при низких концентрациях полимера кинетические кривые адсорбции обостряются при увеличении ММ. В противоположность приведенным результатам, адсорбция полиэтиленоксида (ПЭО) на кремнеземе происходит независимо от ММ.
Причина этого феномена, по-видимому, заключается в высоком сродстве эфирных групп полимера к силанольным гидроксильным группам кремнезема, что приводит к увеличению числа контактов полимера с адсорбентом и, соответственно, «выполаживанию» его конформации на поверхности. Следовательно, значение а в уравнении Перкеля-Алмана, в данном случае, будет приблежаться к нулю [130]. Тем не менее, в большинстве случаев, увеличение ММ полимера ведет к возрастанию количества адсорбированного вещества и прочности адсорбционного слоя, вследствие увеличения площади контакта сегментов макромолекул с поверхностью [130, 131]. Этот факт необходимо учитывать при планировании синтеза полимера-носителя для создания гибридных полимерно-неорганических скаффолдов. С одной стороны ММ полимера должна быть достаточно высокой для обеспечения его адсорбционного сродства к минеральной матрице, а с другой не должна препятствовать выводу макромолекул из организма [65] в случае его десорбции. Адсорбция водорастворимых полимеров на твердых поверхностях в значительной степени определяется свойствами раствора полимера. Это положение иллюстрирует Рис. 1.11, (а) и (б), на примере адсорбции на кремнеземе этил(гидроксиэтил)целлюлозы (ЭГЭЦ) [136]. На Рис. 11 (а) приведена зависимость точки помутнения раствора от концентрации различных добавленных солей, в то время как Рис. 11 (б) демонстрирует зависимость адсорбции на кремнеземе в присутствии тех же солей. Из сравнения представленных данных видно, что соли, понижающие точку помутнения полимера, т. е. понижающие растворимость ЭГЭЦ, повышают ее адсорбцию. Приведенные данные указывают на то, что добавки различных солей в водные растворы полимеров изменяют качество растворителя и влияют на адсорбцию гидрофильных полимеров. Известно, что адсорбция полимера из «плохого» растворителя всегда выше. Это связано с действием двух факторов. Во-первых, макромолекулы, адсорбирующиеся из «плохого» растворителя, имеют более свернутую конформацию, чем в «хорошем» растворителе, и, следовательно, занимают на поверхности меньшую площадь. Во-вторых, качество растворителя влияет на адсорбцию через устойчивость раствора. В плохом растворителе, где взаимодействие между полимерными сегментами и молекулами растворителя энергетически менее выгодно, чем взаимодействие полимерных сегментов друг с другом и молекул растворителя
Синтез полимеров и их альдегидсодержащих производных
Смесь ПО мл метакриловой кислоты и 315 мл бензоилхлорида (молярное соотношение 1:2) подвергали быстрой фракционной перегонке с дефлегматором до достижения температуры в парах 95-97 С. Полученный продукт очищали тем же методом, собирая фракцию с Тк„п. = 98-99 С и nD20= 1.4432 (nD20;iHT. = 1,4435 [107]). Синтез 2-деокси-Ы-метакрилоиламидо-В-глюкозы (МАГ) МАГ синтезировали методом, аналогичным описанному в [107, 118]. При этом к раствору 30 г (0.14 моль) солянокислого глюкозамина в 450 мл метанола прикапывали при интенсивном перемешивании 24 мл триэтиламина, используемого для нейтрализации выделяющейся в процессе реакции хлористого водорода. Смесь охлаждали льдом с солью до -5 С, затем, при постоянном перемешивании, в течение часа прикапывали одновременно 18 мл триэтиламина и 15 мл хлорангидрида метакриловой кислоты, поддерживая температуру в интервале от -5 до -2С. Далее смесь перемешивали при температуре 0 - 5 С (первый час реакции), 10 - 20 С (второй час), а затем еще три часа при комнатной температуре (20-25 С). Смесь оставляли на ночь при комнатной температуре без перемешивания. После отделения фильтрованием избытка триэтиламина гидрохлорида метанол удаляли ротационным испарением в вакууме. Сухой остаток трижды промывали хлороформом, сушили в вакууме, затем двукратно перекристаллизовывали из 500 мл сухого этанола. Выход продукта (МАГ) с Тпл = 197 - 198С (Тщ,. лит. = 198 - 199 С [107]) составил 24.64 г (72%). Данные элементного анализа: N, 5.88 %, 5.84 %; С, 48.64 %, 48.57 %; Н, 7.09 %, 7.02 %. Для Ci0H17NO6 вычислено: N, 5.7 %; С, 48.6 %; Н, 6.9 %.
Синтез полимера МАГ (пМАГ) осуществляли в соответствии с ранее описанным методом [107, 120]. 6 г (0.024 моль) МАГ и 0.3 г (5 масс% от содержания МАГ) АИБН растворяли в 57 мл ДМФА. Полимеризацию проводили в запаянной ампуле при 60С в течение 24 ч, предварительно пропустив через реакционную смесь поток аргона. Полимер выделяли осаж дением в 30-ти кратный объемный избыток диэтилового эфира с последующим отделением продукта фильтрованием (фильтр Шотта № 40). После высушивания полимера в вакууме выход продукта составил 5.7 г (95 %). Альтернативно, выделение готового полимера осуществляли диализом реакционной смеси против воды в течение 72 ч с последующей лиофилизацией водного раствора полимера. Выход полимера в данном методе составил 5.2 г (87 %). Сополимеризацию п(МАГ-со-ВП) проводили следующим образом: 0.5 г (0.002 моль) МАГ [Mi], 0.21 мл (0.002 моль) ВП [М2] и 0.029 г (4 масс% от [Мі+М2]) АИБН растворяли в 6.9 мл ДМФА и через полученную смесь пропускали поток аргона. Процесс осуществляли в запаянной ампуле при 60С в течение 24 ч. Как и в случае пМАГ, продукт реакции выделяли осаждением в диэтиловый эфир, отделяли фильтрованием и сушили в вакууме. Выход п(МАГ-со-ВП) составлял 94 %. 0.5 г (0.002 моль) пМАГ растворяли в 80 мл дистиллированной воды и полученный раствор охлаждали до 5С. Различное количество метапериодата натрия добавляли при сильном перемешивании в соответствии с планируемым содержанием вводимых в полимер альдегидных групп (Таблица 7). Реакцию окисления п(МАГ) проводили в течение 24 ч в темноте при 5С. Продукт очищали диализом против воды (32 ч) или ультрафильтрацией, а затем лиофильно высушивали. Периодатное окисление сополимера п(МАГ-со-ВП) проводили аналогичным способом. Количество введенных в полимеры альдегидных групп приведено в Параграфе 3.1 (Таблица 10). В качестве альтернативного диализу метода очистки полимера от избытка периодата, а также побочных продуктов реакции - иодатов натрия, был разработан способ, основанный на обработке реакционной смеси смесью катионита КУ-2 и анионита АРА-5 с последующим отделением раствора фильтрованием. В пробах, взятых из фильтрата для определения иодатов и периодатов, эти ионы отсутствовали. Несмотря на положительный результат, для очистки образцов окисленной пМАГ в данной работе использовался диализ и ультрафильтрация на колонках Vivaspin. Образцы п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) синтезировали методом радикальной полимеризации сомономеров в присутствии АИБН с использованием ДМФА в качестве растворителя аналогично ранее описанным процессам получения пМАГ и п(МАГ-со-ВП). Соотношения сомономеров (МАГ - [Мі]; ВП - [Мг]; ДААк - [М3]) в исходной реакционной смеси представлены в Таблице 8. Полимеризацию проводили в течение 72 ч. Образующийся полимер выделяли диализом (72 ч) против воды с последующей лиофилизацией.
Характеристики полученных полимеров приведены в Параграфе 3.1 (Таблица 11). Активация сополимера п(МАГ-со-ВП-со-ДААк), т. е. снятие с ДААк ацетальных защитных групп, проводили в течение 2 ч в водном растворе соляной кислоты, рН 2.0, при температуре 50 - 60С и концентрации полимера 5 мг/мл. После завершения реакции, раствор активированного полимера очищали диализом против воды или ультрафильтрацией. Н ЯМР-спектроскопия Качественный анализ структуры и состава полученных полимеров осуществляли методом Н ЯМР-спектроскопии. Измерения проводили с использованием растворов полимеров в ДМСО (d6) и D20. ИК-спектроскопия ИК-спектры полимеров в таблетках КВг регистрировались с целью качественного определения содержания альдегидных групп, используя характеристичную полосу поглощения V(HC=O) 1740-1760 см"1. Определение содержания альдегидных групп (использование реагента Шиффа) Количество содержащихся в полимере альдегидных групп определяли с использованием высокочувствительного реагента Шиффа (фуксинсернистая кислота) и глутарового альдегида в качестве стандарта. Калибровочная зависимость поглощения растворов при длине волны 550 нм от концентрации альдегида приведена на Рис. 16.
Получение модели клетки и изучение ее взаимодействия с GRGDSP-пептидом методом аффинной хроматографии
При изготовлении моделей клеток с интегрин-подобным рецептором использовали карбоксилированные полистирольные наночастицы, характеристики которых представлены в Таблице 9. Модификацию частиц пептидом, имитирующим детерминанту связывания клеточного рецептора - интегрина, осуществляли согласно известному двустадийному методу, основанному на активации карбоксильных групп полимерных наносфер водорастворимым карбодиимидом [182, 183]. Для исследования поверхностной модификации полистирольных наносфер указанным пептидом проводили его связывание с флуоресцентной меткой (ФИТЦ) по є-аминогруппе лизина. К раствору 2 мг (0.81 мкмоль) пептида в 1 мл натрий-боратного буфера, рН 10.0, добавляли 0.32 мл (0.81 мкмоль) раствора ФИТЦ в том же буфере, 1 мг/мл. Объем реакционной смеси доводили до 2 мл. Таким образом, конечное молярное соотношение реагентов [пеп-тид]:[ФИТЦ] составляло 1:1. Реакцию проводили при интенсивном перемешивании и комнатной температуре в течение 1 ч. Очистку конъюгата пептид-ФИТЦ от избытка реагентов проводили методом гель-фильтрации на Сефадексе G-25 с использованием дистиллированной воды в качестве подвижной фазы. Модификацию поверхности карбоксилированных полистирольных наносфер проводили следующим образом. Частицы, предварительно пропущенные через колонку с Сефадексом G-25 с использованием в качестве подвижной фазы 0.1 М морфолиноэтансульфонового буфера (МЭС, 5.5), последовательно активировали 1-гидроксибензотриазолом и этил-3(3-диметиламинопропил) карбодиимидом (ЭДК), взятыми в эквимолярных количествах по отношению к количеству поверхностных карбоксильных групп. Реакция активации протекала при 0С в течение 15 минут, после чего суспензию очищали от избытка реагентов методом гель-фильтрации на колонке G-25, уравновешанной 0.01 М натрий-боратным буфером, рН 8.5. В четыре пробирки, содержащие по 0.2 мл (7.8 мг частиц, 0.0091 мкмоль СООН групп) суспензии наносфер в 0.01 М натрий-боратном буфере, рН 8.5, добавляли 20, 40, 80 и 160 мкл раствора конъюгата пептид-ФИТЦ, 1 мг/мл, в этом же буфере. Реакция модификации поверхности наносфер протекала в течение 4 часов при 20С.
По завершении реакции, избыток пептида удаляли из суспензии гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-200 с 0.01 М PBS в качестве подвижной фазы. Количество иммобилизованного на поверхности наносфер пептида определяли по поглощению связанного с пептидом ФИТЦ при 475 нм (Рис. 21, а) с использованием предварительно построенной калибровочной кривой для конъюгата пептид-ФИТЦ (Рис. 21, б). Для сведения к минимуму влияния рассеяния поглощаемого излучения на частицах использовали сильно разбавленные растворы модифицированных наносфер. При модификации поверхности полистирольных наносфер интегринмоделирующим пептидом для дальнейшего изучения его биоспецифического взаимодействия с ковалентно закрепленным на поверхности С1М-диска GRGDSP-пептидом методом аффинной хромато графии, реакционную смесь составляли 0.2 мл суспензии частиц и 80 мкл раствора пептида (не модифицированного ФИТЦ) с концентрацией 1 мг/мл. Иммобилизация GRGDSP пептида на С1М-диске Используемые для создания аффинного сорбента на основе GRGDSP-пептида коммерческие СІМ-диски представляют собой монолитный макропористый материал на основе сополимера глицидилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (ГМА-ЭДМА), содержащий поверхностные эпоксидные функциональные группы (3-5 ммоль/г). Диаметр дисков составляет 12 мм, толщина - 3 мм, а средний размер пор, определенный методом ртутной поромет-рии, 1.5 мкм. С целью удаления из пор носителя возможных органических примесей ОМ-диск предварительно промывали последовательно (в потоке жидкой фазы при скорости 5 мл/мин, в течение 30 мин каждым растворителем) этанолом, смесью этанол:вода (1:1), водой и, наконец, рабочим раствором - 0.0125 М натрий-боратным буфером, рН 8.2. После соответствующей подготовки, монолитный диск с нативными эпоксидными группами помещали в 1 мл раствора GRGDSP пептида с концентрацией 5 мг/мл в указанном выше буферном растворе. Диск выдерживали 22 ч при температуре 22-30С. Количество иммобилизованного пептида определяли по разности концентраций исходного раствора пептида и раствора супернатанта после иммобилизации. Для оценки количества удержанного в порах носителя пептида полученный аффинный сорбент промывали последовательно рабочим буфером и 2 М раствором NaCl. Количество пептида, определенное в полученных фракциях, суммировалось с количеством, детектируемым в растворе супернатанта.
