Введение к работе
Актуальность работы. Проблема индикации загрязнения внешней среды продуктами биологического происхождения возникла на этапах открытия возбудителей инфекционных болезней. Экологический аспект ее в начале не выходил за рамки эпидемиологии и эпизоотологии. Методологически она решалась путем выделения из объектов внешней среды самого возбудителя и последующей его идентификации.
Угроза загрязнения среды биополлютантами с развитием общества возрастала. Необходимы были специфические методы их индикации. Было показано, что серологические реакции, визуализация которых основана на эффекте агглютинации, являются наиболее удобными для проведения мониторинга окружающей среды на присутствие определенного биологического компонента в ней. Распространение получили тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации, в которых в качестве носителей биолигандов использовали эритроциты. Однако при их использовании трудно было выполнить основное условие: носитель должен быть инертным в серологической реакции. Такое условие не всегда может бьпь соблюдено, поскольку на эритроцитах имеются антигенные детерминанты, к которым в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела.
Это обстоятельство побудило исследователей перейти на синтетические носители, где иммунологический феномен неспецифической агглютинации полностью исключается. Кроме того, использование функциональных полимерных носителей позволило расширить варианты иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер за счет ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда.
До настоящего времени не было проведено достаточно глубоких исследований фундаментального характера, позволяющих представить физико-химические процессы, протекающие на поверхности носителя, на всех этапах приготовления диагностикума и при выполнении непосредственно серологической реакции. Это в свою очередь не позволяет выдвигать четкие требования к параметрам полимерных микросфер, пригодных для создания диагностикума. В связи с этим подбор таких полимерных суспензий до настоящего времени осуществляется эмпирически.
В настоящей работе сделана попытка подойти к проблеме конструирования антительных диагностикумов, предназначенных для решения различных экологических задач, с позиций изучения состояния межфазного слоя полимерных микросфер на всех стадиях получения тест-систем, начиная с исходной суспензии.
Цель работы. Создание антительных тест-систем для мониторинга биополлютантов и Tamm-Horsfall протеина.
Основные задачи исследования.
1.Выбрать способ иммобилизации антител различной специфичности на поверхность полимерных микросфер.
2.Оценить изменение коллоидно-химических свойств исходных полимерных суспензий и тест-систем в процессе их создания.
3.Изучить влияние состава биолигандов на чувствительность и специфичность реакции латексной агглютинации.
Научная новизна.
В целях решения проблемы охраны безопасности жизнедеятельности человека созданы новые тест-системы для обнаружения столбнячного и дифтерийного токсина, являющихся причиной тяжелых заболеваний, и высокочувствительная тест-система для определения Tamm-Horsfall протеина, позволяющая выявлять механизмы формирования уропатогенной популяции микробов из кишечного биоценоза.
Впервые прослежено изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в процессе получения тест-систем (^-потенциал, диаметр, распределение частиц по размерам, параметры изотерм двумерного давления 2D пленок) и показано, что качество полученных тест-систем существенно зависит от времени хранения полимерной суспензии и от чистоты биолиганда.
Сопоставительный анализ различных способов иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер показал, что чувствительность антительных тест-систем, полученных при связывании биолигандов с полимерными микросферами через спейсор, протеин А, выше, чем при непосредственном связывании функциональных групп полимера и биолиганда.
Установлено, что при создании тест-систем на стадии иммобилизации биолиганда необходимо использовать иммунореагенты, не содержащие примесей поверхностно- активных веществ.
Впервые было проведено методом Ленгмюра систематическое исследование поверхностных свойств полимерных микросфер (исходных и на различных стадиях производства тест-систем), и показана их зависимость от времени хранения полимерных микросфер и чистоты биолиганда.
Практическая значимость.
1 .Составлен лабораторный регламент получения тест-систем.
2.Показано, что антительные тест-системы для определения столбнячного и дифтерийного токсинов и Tamm-Horsfall протеина обладают высокой диагностической эффективностью.
3.Сформулированы требования к полимерным суспензиям и сывороткам биолигандов для получения эффективных тест-систем.
Положения, выносимые на защиту.
1.Результат исследования коллоидно-химических свойств полимерных суспензий, полученных затравочной полимеризацией стирола,
стиролсульфоната натрия и акролеина, и их изменение на всех стадиях получения тест-систем и в процессе хранения.
2.Влияние способа иммобилизации на чувствительность тест-систем. 3.Зависимость чувствительности тест-систем от чистоты биопрепарата. 4.Лабораторный регламент получения тест-систем для определения Tamm-Horsfall протеина, столбнячного и дифтерийного токсина.
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно-технической конференции "Наука и образование" (Мурманск 2002, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" (Москва-2002), Научно-практической конференции НПО "Биомедицинские технологии" (Москва 2003), Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественных дисциплин (Химическая секция) (Москва, РУДН, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Материалы изложены на 162 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц, 35 рисунков. Список литературы содержит 154 работы.
