Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Электростатические эффекты в проводимости и селективности каналов 31
Введение 31
Грамицидиновый канал как датчик потенциала поверхности 32
Аламетициновый канал в мембранах из заряженного липида 43
Электростатические эффекты в транспортных свойствах OmpF 47
ГЛАВА II. Флуктуационные явления в ионных проводниках 59
Введение 59
Шум Джонсона 63
Дробовый шум 67
Шум проводимости 71
l/f-шум 99
ГЛАВА III. Спектроскопия флуктуации ионных токов биологических мембран 109
Введение 109
Флуктуационный анализ проницаемости невозбудимых биомембран 110
Кинетическая модель 112
Результаты экспериментов 118
ГЛАВА IV. Стохастический резонанс на молекулярном уровне 128
Введение 128
Передача сигнала потенциалозависимыми каналами в отсутствие внешнего шума 130
Стохастический резонанс - передача сигнала, улучшенная внешним шумом 137
Адиабатическая теория стохастического резонанса в системах с экспоненциальной статистикой 138
Стохастический резонанс как свойство процессов с модулируемой скоростью генерации событий 142
ГЛАВА V. Ионные каналы как "молекулярные счётчики коултер А " 147
Введение 147
Принцип счётчика Коултера 148
Особенности сенсоров нанометровых размеров 151
Эксперименты с аламетициновым каналом и VDAC 156
ГЛАВА VI. Водорастворимые полимеры и ионные каналы 163
Введение 163
Электропроводность водно-солевых растворов полиэтиленгликоля 164
Полимеры в поре ионного канала: термодинамика и кинетика 172
Эффекты неидеальности полимерных растворов 179
Осмотические эффекты растворённых полимеров 187
Сильные взаимодействия между полимером и каналом: разрешённые во времени одномолекулярные события 193
ГЛАВА VII. Ионные каналы в исследованиях молекулярной упаковки и конформационного равновесия белков 200
Введение 200
Статическая неупорядоченность в молекулярной упаковке мальтопоринового канала 201
Эффекты эластической деформации мембранных монослоёв в конформационном равновесии ионных каналов 207
ГЛАВА VIII. Катализирующая роль взаимодействий между каналом и проникающими молекулами 215
Введение 215
Модель 216
Вероятность транслокации 218
Характерные времена 222
Оптимальный канал 226
ГЛАВА IX. На пути к практическим применениям 232
Введение 232
Взаимодействия антибиотиков пенициллиновой группы с каналом OmpF 233
Ингибирование токсинов сибирской язвы на уровне трансмембранных каналов 242
Роль проницаемости внешней мембраны в резистентности бактерий Pseudomonas Aeruginosa 246
Заключение 251
Благодарности 253
Список основных публжаций автора 254
Литература 260
- Грамицидиновый канал как датчик потенциала поверхности
- Флуктуационный анализ проницаемости невозбудимых биомембран
- Стохастический резонанс - передача сигнала, улучшенная внешним шумом
- Принцип счётчика Коултера
Введение к работе
Актуальность проблемы Методы, подходы и, что, пожалуй, наиболее важно, концепции физики конденсированного состояния все чаще находят свой путь в биологию Современная наука о жизни немыслима без молекулярной биологии, которая рассматривает молекулы как физические машины, обладающие определённой структурой и выполняющие функции, этой структурой обусловленные При этом наиважнейшая задача молекулярной биологии - это установление связи между структурой и функцией Быстро растущее влияние физики на биологические науки тем и объясняется, что именно она предоставляет ключ к пониманию этой связи
Однако существует и обратное влияние Стремление всё возрастающего числа физиков внести свой вклад в биологию связано с желанием обратиться к сложным, мезоскопическим объектам, где знакомые подходы макроскопической физики уже перестают работать, в то время как квантовая и, тем более, ядерная физика еще не входят в свои права В результате, усилия физиков описать объекты, изучаемые биологией, способствуют развитию новых и углублению старых разделов физики
Прогресс в области молекулярной биологии во многом обязан успехам в развитии структурных физических методов Рентгеновский структурный анализ, прежде всего кристаллография высокого разрешения, ядерный магнитный и электронный парамагнитный резонансы, динамическое светорассеяние, малоугловое нейтронное и рентгеновское рассеяние и другие методы дают богатую и детальную информацию как об отдельных молекулах, так и об их сборке в функциональные надмолекулярные структуры Вне всякого сомнения, именно эта структурная информация является тем фундаментом, на котором впоследствии строятся физическая теория и интерпретация
Однако все чаще и чаще мы убеждаемся в том, что структурная информация сама по себе недостаточна для понимания функциональных свойств молекул и надмолекулярных структур Изначальный оптимизм, существовавший двадцать - тридцать лет назад, не оправдал себя Действительно, возьмем в качестве примера широко известную ситуацию с калиевым каналом Структура этого канала, полученная с разрешением вплоть до 0 19 нм [1], известна, по меньшей мере, четыре года Тем не менее исследователи до сих пор не пришли к единой физической картине, объясняющей его транспортные свойства и
переходы между конформационными состояниями Причина такого положения, по-видимому, состоит в том, что развитие физики конденсированного состояния применительно к наноскопическим системам, к которым принадлежат ионные каналы, отстает от развития структурных методов
Основная цель работы Цикл работ, по которым написана данная диссертация, направлен на ликвидацию этого отставания и имеет своей целью разработку нового направления - физики ионных каналов Для достижения этой цели было проведено всестороннее экспериментальное и теоретическое изучение реконструированных в искусственные бимолекулярные липидные мембраны ионных каналов различной природы При этом использованы существующие и развитые нами новые методы физики конденсированного состояния для анализа наноскопических структур В силу малых размеров изучаемых объектов основное внимание уделялось не только средним параметрам, характеризующим транспортные свойства каналов, но и детальному изучению флуктуации этих параметров
Научная новизна Основная часть экспериментов проведена на уровне работы с одиночными молекулами Большинство как экспериментальных, так и теоретических результатов получено впервые
Новизна многих из них носит концептуальный характер Так, например, идея использования ионного канала в качестве наноскопического "молекулярного счетчика Коултера", опубликованная нами в журнале Nature в 1994 году, нашла широчайшее применение во множестве биотехнологических разработок В настоящее время она стремительно развивается в сторону использования искусственных наноскопических каналов, полученных на базе применения традиционных методов физики твердого тела
Другим примером могут служить экспериментальное обнаружение (Nature, 1995) и математическое обоснование (Nature, 1997) явления стохастического резонанса (индуцированного шумом эффекта увеличения степени порядка [2] ) на молекулярном уровне В серии наших работ стохастический резонанс был впервые продемонстрирован в нединамических беспороговых системах, что способствовало углублению понимания статистической природы этого явления
В исследованиях динамики одиночных полимерных молекул, захваченных ионным каналом, нами был продемонстрирован новый 'конфигурационный эффект, в котором свободная часть молекулы
действует на ее захваченную часть как энтропийная пружина (Physical Review Letters, 2006) Это исследование является яркой иллюстрацией потенциальных возможностей экспериментов с одиночными молекулами в области физики полимеров
Основные положения, выносимые на защиту
Эксперимент
1 Разработаны новые методы анализа флуктуации электропроводности для изучения динамики одиночных молекул
2, Установлена иерархия электрических флуктуации в ионных проводниках
Показана роль электростатических эффектов в проводимости и селективности мезоскопических ионных каналов
Обнаружен катализирующий эффект взаимодействий между ионными каналами и молекулами, которые эти каналы эффективно транспортируют
Выявлены эффекты конфигурационных ограничений и неидеальности полимерных растворов во взаимодействиях полимерных цепей с ионными каналами
Показана конструктивная роль флуктуации в передаче сигнала (стохастический резонанс) на молекулярном уровне
Продемонстрирована регуляторная функция взаимодействий между каналообразующим белком и мембранным матриксом в конформационном равновесии ионных каналов
Теория
С использованием диффузионного описания динамики частиц построена теория молекулярного транспорта через ионные каналы
На базе идей скейлинга развита теория распределения полимерных клубков в наноскопических полостях в случае сильной неидеальности полимерных растворов
В рамках анализа пуассоновских процессов с модулированной плотностью событий создана теория стохастического резонанса в ионных каналах и других беспороговых молекулярных системах с ограниченной статистикой
Практическая значимость работы Основная научно-практическая ценность данной работы заключается в - формировании нового направления - физики ионных каналов Проведенные исследования расширяют наши познания о физических свойствах этих сложных
мезоскопических объектов и предлагают методы их описания на языке физики конденсированного состояния
Помимо этого, данная работа представляет конкретный практический интерес в медицинских приложениях, в частности в области создания новых лечебных препаратов А именно (а) установленная нами роль взаимодействий молекул антибиотиков пенициллиновой группы с бактериальными каналами облегчает направленный поиск новых активных антибиотиков, (б) обнаруженный нами молекулярный механизм эффективного ингибирования токсина сибирской язвы производными циклодекстринов является основой для создания эффективных противоядий, (в) выявленные нами причины резистентности бактерии Pseudomonas aeruginosa к антибиотическим препаратам позволяют более эффективно искать способы борьбы с этим опасным патогеном
Апробация работы Результаты исследований опубликованы в 91 работе в реферируемых отечественных (15 статей) и международных (76 статей) журналах и, кроме того, в 24 работах в сборниках трудов конференций и тематических сборниках Результаты также были представлены в качестве приглашённых докладов на многих международных конференциях, в частности, за последние три года, на Winter Symposium on Physics of Quantum Electronics, Snowbird, США, Workshop on Complex Dynamical Processes in Electroreceptors and Hair Cells, Дрезден, Германия, 2nd International Symposium on Fluctuations and Noise, Канары, Испания, Gordon Research Conference on Ion Channels, Tilton School, США, 17th Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics, Закопане, Польша, International School "100 Years of Brownian Motion", Эриче, Италия, First and Second Summer Schools "Bio-sensing with channels", Международный университет Бремена, Германия, Second Focused Workshop on Electronic Recognition of Bio-molecules, Beckman Institute, США, Centennial Marian Smoluchowski Symposium on Statistical Physics, Краков, Польша, XX Sitges Conference "Physical Biology From Molecular Interactions to Cellular Behavior Behavior", Барселона, Испания; Annual March Meeting of the American Physical Society, Денвер, США, конференции "Physics Inspired by Biology", Миннеаполис, США.
По материалам работ проведены семинары в Московском государственном университете им М В Ломоносова, в Санкт-Петербургском государственном университете, в Институте электрохимии РАН (Москва), в Институте биофизики РАН (Пущино),
в университетах Гарварда и Принстона (США), а также во многих других отечественных и зарубежных научных центрах
Структура диссертации Диссертация изложена на 297 страницах и состоит из введения, 9 глав, заключения и 85 рисунков, библиография -478 наименований
Грамицидиновый канал как датчик потенциала поверхности
Мы изучили эффект поверхностного заряда на проводимость грамицидинового канала, использовав два подхода: (і) титруя этот заряд при помощи изменения В первой серии экспериментов мы титровали мембраны, приготовленные из чистого фосфатидилсерина, увеличивая кислотность среды от рН 7.5 до рН 0.5 и сохраняя при этом постоянную концентрацию хлорида цезия. В результате мы показали, что изменение поверхностного заряда маскируется двумя факторами: увеличением протонного тока при высоких кислотностях и насыщением проводимости канала с концентрацией цезия. Мы также учли поправки, возникающие при сорбции ионов на поверхности мембраны. Во второй серии экспериментов мы использовали смеси фосфатидилсерина и фосфатидилхолина в различных молярных отношениях. Проводимость грамицидинового канала уменьшалась по мере разбавления заряженного фосфатидилсерина нейтральным фосфатидилхолином, в соответствии с качественными предсказаниями нашей модели. Количественно, однако, это уменьшение было более выраженным, чем предсказания модели. Мы объясняем это расхождение дополнительным эффектом, выходящим за рамки нашей модели, а именно хорошо документированной зависимостью проводимости грамицидинового канала от конкретного типа липида даже в ряду нейтральных липидов [155-157]. В теоретическом обсуждении полученных результатов мы использовали подход распределённого заряда [158]. Числовые решения уравнений электростатики показывают, что такой подход даёт хорошие результаты в случаях, когда относительная концентрация заряженных липидов в мембране превышает 25% [159]. Для определения электрического потенциала на поверхности заряженной мембраны мы рассмотрели равновесие между адсорбцией противоионов и протонным На Рис. 1-2 изображены типичные записи ионных токов через грамицидиновые каналы в мембранах из заряженного липида при двух различных концентрациях протона в омывающем мембрану растворе.
Видно, что в кислой среде (рН 3.5), соответствующей большой протонной концентрации, среднее время жизни канала приблизительно в 10 раз меньше, чем в нейтральной среде. Кроме того, анализ амплитуд тока показывает, что при рН 7.5 проводимость канала выше, чем при рН 3.5. Титрование проводимости канала в мембранах, сформированных из чистого фосфатидилсерина, показано на Рис. 1-3. Измерения проведены в 0.1 М CsCl растворах при значениях рН, варьируемых от рН 8.2 до рН 0.5. При протонных концентрациях выше той, что соответствует рН 5, проводимость уменьшается с уменьшением рН, достигая минимума в районе рН 2.5. При дальнейшем уменьшении рН проводимость начинает расти до величин, превышающих её значение в нейтральной среде за счёт увеличивающегося вклада протонной проводимости. Так как ионный ток через канал является суммой тока протонов и Cs+, мы исследовали его как функцию различных концентраций CsCl при разных рН. В умеренно низких концентрациях CsCl (0.1 М) грамицидиновый канал демонстрирует аддитивность Cs+ и ЕҐ проводимостей. Однако, в больших концентрациях CsCl обнаруживается конкуренция между протонами и катионами цезия. Подобный эффект уже был описан для натриевых катионов [160]. Рис. 1-4 показывает проводимости каналов в нейтральном и заряженном бислоях как функции концентрации CsCl при рН 7.4. Результаты в основном согласуются с ранее опубликованными [149]. Некоторая разница в абсолютной величине проводимости может быть связана с различиями в методах формирования мембран в настоящей работе и в работе [149]. Видно, что проводимость грамицидинового канала в нейтральном фосфатидилхолине достигает максимума вблизи 55 пСм. Проводимость в заряженном фосфатидилсерине изменяется мало; в диапазоне 0.01-3.0 М CsCl проводимость всегда выше, чем 55 пСм. Нами была также исследована зависимость проводимости канала от процентного содержания заряженного липида в мембране.
Было получено, что верхний предел диапазона изменения проводимости как функции липидного состава мембраны (72 пСм при 0.1 М CsCl для мембран из фосфатидилсерина) превышает верхний предел её изменения в экспериментах с нейтральными липидами (55 пСм при 3 М CsCl для мембран из фосфатидилхолина, Рис. 1-4). Вольтамперные характеристики грамицидиновых каналов в нейтральных и заряженных липидах линейны вплоть до 200 мВ приложенного напряжения как в случае Cs+ (0.1 - 1 М CsCl), так и Н+ транспорта в присутствии ионов цезия. Линейность вольтамперных характеристик является важным наблюдением для Основываясь на предположении о равновесности распределения ионов, мы используем нелинейное уравнение Пуассона-Больцмана для того, чтобы определить потенциал на поверхности мембраны. Затем, за неимением точного аналитического решения для геометрии, показанной на Рис. 1-1, исходя из этого потенциала мы определяем концентрацию ионов на входе в канал тремя различными способами: 1. Используя потенциал Гуи-Чапмена у/сс(а) на расстоянии а от поверхности, где а является подгоночным параметром, как потенциал на входе в канал (Рис. 1-1).
Флуктуационный анализ проницаемости невозбудимых биомембран
Данная глава посвящена вопросам применения метода спектрального анализа электрических флуктуации для изучения молекулярных механизмов пассивной ионной проницаемости невозбудимых биомембран на примере исследований натриевой проницаемости апикальных мембран клеток кожи лягушки Rana temporaria в различных ионных окружениях. Опыты проводились на изолированной коже в условиях прохождения через нее тока короткого замыкания. Кожу помещали между двумя кольцами из оргстекла. Для предотвращения краевых повреждений кожи на поверхность колец наносили тонкий слой вакуумной силиконовой смазки. Кольца с кожей площадью около 0.3 см устанавливали в электрохимическую ячейку и прижимали друг к другу с небольшим усилием, постоянным во всех опытах. Растворы в камерах непрерывно аэрировали. На время накопления спектра флуктуации тока (10 мин для частотного интервала 0.09-600 Гц и 1 мин для интервала 3-600 Гц) поток воздуха отключали. Спектральную плотность флуктуации тока короткого замыкания определяли, используя четырехэлектродное включение малошумящего операционного усилителя. Рабочая площадь хлорсеребряных электродов составляла 5 см . В качестве сопротивления обратной связи применяли проволочный резистор 100 кОм. Объект наших экспериментов довольно сложен - используемые препараты кожи лягушки представляют собой многослойные клеточные образования, весьма упрощенная схема которых представлена на Рис. 3-1 [260]. Здесь эпителиальный слой (1) состоит из нескольких слоев разных клеток. Под ним расположены волокна и клетки соединительной ткани, а также кровеносные сосуды, железы, пигментные клетки и коллагеновые волокна (2). Более 80% общего трансэпителиального электрического сопротивления приходится на долю апикальной плазматической мембраны (3) [261], через которую натрий из наружного раствора поступает в клетки. Удаляется он через базальную мембрану (4) с помощью Na+-, К+-насоса.
Используемые препараты представляют собой неравновесные системы с интенсивно протекающими метаболическими реакциями, в частности поддерживающими малую концентрацию ионов натрия в эпителиальных клетках, апикальные мембраны которых граничат с наружным раствором. Цель экспериментов заключалась в исследовании свойств пассивных натриевых каналов апикальных мембран, составляющих лишь одну из многих, сложным образом связанных между собой подсистем. Упростить задачу помог фармакологический подход, позволивший выделить транспорт через исследуемые каналы в лимитирующую стадию всего трансэпителиального переноса ионов путём применения динамических блокаторов с подходящими величинами констант связывания с ионными каналами. Восстановление характеристик элементарных событий по спектру флуктуирующего сигнала, являющегося случайной суперпозицией этих событий, относится к классу так называемых некорректных задач [262]. Такие задачи приводят к однозначным результатам лишь в случае привлечения априорной, дополнительной по отношению к спектральным измерениям, информации. При анализе флуктуации ионных токов через биомембраны положение осложняется еще и тем, что элементарные события, составляющие сигналы, часто не однотипны. Поэтому в экспериментах с биомембранами важно не только удачно определить модель, используемую для интерпретации получаемых спектров, но и иметь возможность отделить вклады от источников флуктуации, не относящихся к исследуемой транспортной системе. Особенность ионных каналов невозбудимых мембран состоит в их сравнительно медленной реакции на внешние возмущения [263].
Конформационные переходы между состояниями с различающейся проводимостью характеризуются большими релаксационными временами. В связи с этим естественно предполагать, что основная мощность флуктуации, связанных с такими переходами, лежит в инфранизкочастотной области. Результаты измерений спектральной плотности флуктуации тока короткого замыкания S(f) от препарата кожи в растворе Рингера (NaCl = 111 мМ; КНС03 = 3 мМ; СаС12 = 1 мМ; глюкоза = 5 мМ; трис-НС1 = 1 мМ; рН = 7.7-К7.8), представленные пунктирной кривой на Рис. 3-2, подтверждают это предположение. Экспериментальный спектр описывается суперпозицией двух компонентов. Монотонно падающей с ростом частоты кривой и кривой инструментального шума вида S(f)ccl + (f/fQ) Низкочастотный участок спектра в двойном Лоренцевские спектры описывают статистические свойства широкого класса физических процессов с экспоненциальной кинетикой. В качестве конкретного примера рассмотрим ионный канал, обладающий двумя конформационными состояниями, одно из которых соответствует открытому, проводящему ионы состоянию со временем жизни т(0С0"л, другое - закрытому непроводящему состоянию со временем жизни т{сс0"л Флуктуации электропроводности в такой системе описываются лоренцевским спектром с релаксационным временем
Используя результаты работы [220] и предполагая, что исследуемая система состоит из параллельного набора N идентичных взаимно независимых каналов с кинетической схемой (3.3) и током, протекающим через каждый открытый канал, /, для спектральной плотности флуктуации тока имеем Таким образом, спектр флуктуации в рассматриваемой кинетической модели определяется четырьмя свободными параметрами, iV, /, r(0cmf), т(ссо"л. Из эксперимента с препаратом кожи в растворе Рингера, т.е. в "невозмущенных" физиологических условиях (см. Рис. 3-2), мы получаем значения только двух величин. Это: 1) натриевый ток, протекающий через мембрану, 1(со"л, который можно записать как произведение общего числа каналов на средний ток через каждый из них: определяемая, как следует из рассмотрения (3.5) при /»1/(2ят(со"п}, по положению участка экспериментального спектра с наклоном -2. Уже из этих данных можно получить полезную информацию. Например, разделив (3.7) на (3.6), определяем величину і/т{0с""л и, зная, что частота I/2хт(0с""п лежит ниже используемого диапазона измерений, имеем нижнюю оценку для тока через одиночный канал. Тем не менее для однозначного определения этой важнейшей транспортной характеристики данных явно не достаточно. В дополнение к этому хотелось бы иметь подкрепленную экспериментом уверенность в том, что измеряемые флуктуации и ток, протекающий через мембрану, определяются именно исследуемыми каналами. В принципе, можно было бы попытаться обнаружить
Стохастический резонанс - передача сигнала, улучшенная внешним шумом
Для того чтобы охарактеризовать передачу сигнала в присутствии внешнего шума, мы измерили два параметра сигнала на выходе системы как функции интенсивности аддитивного входного шума. Это амплитуда сигнала и соотношение сигнал/шум. Напряжение с выхода генератора шума было профильтровано полосовым фильтром с окном пропускания от 3.2 мГц до 5.3 Гц. Рис. 4-6 показывает, что добавление внешнего шума к входу системы значительно увеличивает спектральную интенсивность выходного сигнала при примерно сохраняющемся отношении сигнал/шум. Ограниченный по полосе и некоррелированный со входным сигналом шум интенсивностью в 20 мВ приводит к увеличению выходного сигнала на 35 дБ. В некотором промежуточном диапазоне интенсивностей наблюдается небольшое, но статистически достоверное, увеличение в отношении сигнал/шум. Это отличительная черта систем, демонстрирующих стохастический резонанс. Аддитивный входной шум малой интенсивности увеличивает как сам сигнал, так и шум на выходе системы, но сигнал (как функция интенсивности шума) растёт несколько быстрее. Вставка на Рис. 4-6 демонстрирует статистику измерений отношения сигнал/шум. Каждая точка представляет результат усреднения по 20-минутной записи.
Отношение сигнал/шум выражено в децибелах и рассчитано как где S(fs) - спектральная плотность на частоте сигнала, a N(fs±Af) - шумовой пьедестал, измеренный как среднее значение шума в непосредственной близи к спектральному пику сигнала. Эксперименты, изложенные выше, наводят на мысль, что конструктивная роль шума необязательно ограничивается его взаимодействием с динамическими или пороговыми системами. Уравнение (4.3) и данные, помещённые на Рис. 4-5, показывают, что в отличие от пороговых устройств [294, 295], потенциалозависимые каналы аламетицина способны передавать сколь угодно малые сигналы. Существование стохастического резонанса в системе потенциалозависимых каналов может быть показано при помощи модели, в которой связь между внешним управляющим параметром (потенциалом) и скоростью генерации импульсов даётся экспоненциальной зависимостью. Для простоты предположим, что импульсы тока, отвечающие отдельным каналам, идентичны. Кроме того, пренебрежём омическими поправками, что вполне оправдано в случае \Vh\»\kBT/ne\. Тогда, если на вход системы подаётся потенциал, состоящий из трёх компонентов - постоянного потенциала смещения Vh, внешнего шума VN(t) и медленного синусоидального снала Vs sin(2n: fst), для скорости генерации импульсов имеем В том случае, когда частота сигнала fs много меньше, чем все другие характерные частоты в системе, мы имеем дело с пуассоновским процессом, параметры которого зависят от времени, и низкочастотная спектральная плотность может быть записана как [297] где Q - полный заряд, переносимый одиночным импульсом. В случае входного шума с эффективным напряжением а и лоренцевским спектром с характеристической частотой /с и сигналов, амплитуды которых малы по сравнению с \квТ/пе\, уравнение (4.6) приводит к следующему выражению для спектральной плотности (в котором опущено слагаемое, соответствующее постоянной составляющей): Первое слагаемое в правой части этого выражения описывает шум пуассоновского процесса со средней частотой импульсов тока, превышающей "равновесное" значение r(Vh) в ехр((пестIквТ)212) раз. Второе слагаемое представляет из себя входной шум VN(t), переданный на выход системы. Оно включает в себя не только малосигнальную, линейную часть передачи, но и перекрёстные гармоники шума, возникающие в силу нелинейности системы. Последнее слагаемое описывает передачу сигнала на частоте / = fs.
Для того чтобы получить спектральную компоненту сигнала, измеряемую спектроанализатором, мы заменяем дельта-функцию в последнем слагаемом уравнения (4.7) на обратную ширину спектрального окна, 1/Д/а. Отношение сигнал/шум равно отношению последнего слагаемого к сумме двух первых: ) Анализ уравнения (4.8) показывает, что в дополнение к тривиальной зависимости отношения сигнал/шум от амплитуды входного сигнала (Vs) и деталей методики измерений (А/0), это отношение контролируется интенсивностью шума и его частотной полосой. Оно также зависит от равновесной средней частоты пуассоновского процесса, т.е. частоты, не возмущённой приложением внешнего шума. Одно из наиболее важных заключений состоит в том, что для увеличения качества сигнала на выходе приложенный к входу внешний аддитивный шум должен обладать достаточно широкой полосой, так, чтобы выполнялось условие fc 2r{Vh)lк (в случае входного шума с прямоугольным спектром условие выглядит как /с r{Vh)). Рис. 4-7 демонстрирует отношение сигнал/шум, рассчитанное согласно уравнению (4.8). Видно, что зависимость качества выходного сигнала от интенсивности входного шума имеет ярко выраженный максимум, если приведённое выше условие выполнено. Уравнение (4.8) может быть использовано для оценки интенсивности входного шума, отвечающей максимуму в отношении сигнал/шум на выходе. Анализ показывает, что для величин fc/r(Vh) 105 максимальное значение отношения сигнал/шум наблюдается при
Принцип счётчика Коултера
Принцип счётчика, сформулированный в начале пятидесятых годов [224], состоит в следующем. Когда непроводящая частица, взвешенная в жидкой проводящей среде, попадает внутрь маленького капиллярного канала, она уменьшает его проводимость по сравнению с проводимостью капилляра, заполненного только проводящей средой (Рис. 5-1). Изменение проводимости связано с размером частицы. В стандартных счётчиках Коултера суспензия частиц протекает через канал под действием приложенного гидростатического давления, так что скорость течения определяет длительность импульса изменения проводимости. Изменения проводимости от проходящих через капилляр частиц приводят к генерации импульсов напряжения (если ток через капилляр фиксирован). Импульсы усиливаются и анализируются по их амплитуде и средней частоте, давая информацию о размере и концентрации частиц. Впервые эта методика была применена для счёта клеток крови, а затем, при последующей модификации [312], для счёта бактериальных клеток и их распределений по размерам. С последовавшими после этого усовершенствованиями методика нашла широкий спектр применений, от медицины до геологии [310, 315]. Основываясь на оригинальном рассмотрении Максвелла, можно показать, что уменьшение проводимости длинного капиллярного канала радиусом R и длиной L при помещении в него частицы радиуса г « R может быть записано как [316] где а есть удельная электропроводность раствора, заполняющего канал. Если радиусы частицы и канала соизмеримы, эффект превышает это значение [313, 314]. Концентрация частиц подбирается так, что вероятность одновременного нахождения двух частиц в канале мала, и прохождение каждой из частиц генерирует отдельный импульс электропроводности, описываемый уравнением (5.1).
Как видно, амплитуда такого импульса пропорциональна третьей степени радиуса частицы, т.е. её объёму. Учёт шума канала определяет предел разрешения методики, которая позволяет регистрировать частицы, радиус которых не менее 2 % от радиуса канала. Частицы меньшего размера не разрешимы из-за равновесного шума канала. Так, в стандартных счётчиках Коултера, использующих апертуру в 30 микрон, этот предел составляет 0.5 микрон. Продолжительность импульса рассчитывается из гидродинамических соображений (см. также Главу II). В случае длинных капиллярных каналов это время может быть оценено как время прохождения канала элементом электролита, находящимся на оси канала при ламинарном течении, где г/ - вязкость раствора, а АР - перепад гидростатического давления в канале. В оптимальных условиях счётчик Коултера может считать и классифицировать импульсы напряжения по их размерам со скоростями до 5 тысяч в секунду. Развитие резистивного метода счёта, позволившее анализировать частицы размером много меньше одного микрона [313, 314], было осуществлено в результате использования одиночных пор, изготовленных по технологии "Nuclepore". В этой технологии плёнка поликарбоната сначала подвергается облучению от источника тяжёлых ядерных частиц. Затем треки частиц подвергаются химическому травлению, образуя тем самым довольно однородные поры. Используя поры радиусом в десятые доли микрона и длиной в несколько микрон, удалось детектировать вирусные частицы и бактериофаги размером всего в 60 нм [313, 314]. Следующий шаг в увеличении разрешающей возможности метода был осуществлён в наших работах, в которых, как описано в Главе II, вместо детектирования отдельных импульсов мы использовали спектральный анализ флуктуации, привносимых в шум капиллярного канала непроводящими частицами. Источником сигнала в этом случае служат флуктуации в концентрации взвешенных в растворе частиц.
При приложении гидростатического давления возникает поток, и объём электролита "сканируется" каналом, так что флуктуации концентрации частиц трансформируются в флуктуации проводимости канала во времени. Эти флуктуации и являются сигналом. Интересно, что фактором, ограничивающим разрешение, оказываются равновесные флуктуации ионной концентрации [317], которые ограничивают размер анализируемых частиц несколькими десятками Ангстрем. Такие биологические каналы, как потенциалозависимый канал внешней мембраны митохондрии, многие бактериальные порины и каналы некоторых токсинов являются хорошими кандидатами на роль "молекулярных капилляров" -сенсорных элементов в молекулярной версии счётчика Коултера. Диаметры их водонаполненных пор находятся в пределах от одного до нескольких нанометров. Каковы же основные последствия перехода от микронных к нанометровым размерам? Это прежде всего: 1) преобладание диффузии на малых масштабах; 2) возрастающее значение заряда частицы; 3) возрастающая роль взаимодействий между частицей и стенками канала. Рассмотрим эти три аспекта в деталях. 1.
Хорошо известно, что "скорость диффундирующей частицы", т.е. расстояние, пройденное частицей, делённое на время, зависит от времени наблюдения [318]. Чем меньше это время, тем больше "скорость". Как следствие характерное время диффузии падает быстрее, чем расстояние. В случае одномерной диффузии среднеквадратичное расстояние (х2) и время наблюдения t0 связаны коэффициентом диффузии D, Хотя эта формула несколько завышает характерное время диффузионной релаксации концентрации в капиллярном канале, она может быть использована как грубая оценка, если в соотношении (5.3) заменить (х2\ на L2. Для размеров частиц, которые доступны для исследований при помощи стандартных счётчиков Коултера (около микрона) и типичных длин капилляров, это время слишком велико, чтобы вносить заметные эффекты. Например, для канала длиной в 30 микрон, содержащего микронные частицы, время, даваемое выражением (5.3), составляет сотни секунд. Это время необходимо сравнить с характерным временем импульса, которое определяется направленным потоком через капилляр и близко к одной миллисекунде. Когда размеры системы уменьшаются до молекулярных, ситуация изменяется качественным образом. Это понятно из сравнения уравнений (5.2) и (5.3). По мере пропорционального уменьшения размеров канала и частицы (частица должна помещаться в канал) характерное время ламинарного потока (выражение (5.2)) остаётся постоянным, тогда как диффузионное время (выражение (5.3)) падает, как третья степень размера, если учесть увеличение коэффициента диффузии с уменьшением размера частицы, Dccl/r. Используя более точное выражение для времени диффузионной релаксации, rdiJf=l} I12D (см. [317] и Главу II), можно оценить отношение времён как Легко показать, что в молекулярной поре броуновское движение частиц доминирует над направленным движением при всех разумных величинах приложенного гидростатического давления. Действительно, предположим, что rdjff = TJJOW, и определим соответствующее значение АР из соотношения (5.4). Мы ставим вопрос: каков должен быть перепад гидростатического давления, чтобы характерное время направленного движения за счёт потока сравнялось со временем диффузионной релаксации? Подставляя следующие величины: R = 1 нм, rj = 10 3 кг/м с (вязкость воды при 20С), и D = З Ю"10 м2/с (коэффициент диффузии молекулы аденозинтрифосфата в воде), получаем АР = 1.5 107 Па, что эквивалентно давлению водного столба высотой в полтора километра. При меньших перепадах давления доминирует диффузионный механизм обмена частиц в канале. 2. Формула, связывающая величину уменьшения проводимости канала с удельной электропроводностью раствора электролита и размером частицы (выражение (5.1)), была многократно проверена в экспериментах с объектами микронных размеров [310, 313, 314]. Выполняется ли это соотношение для объектов молекулярных размеров, когда эти размеры меньше, чем среднее расстояние между ионами электролита? Это расстояние (в случае сильных электролитов) падает, как