Введение к работе
Актуальность проблемы. Характерным осложнением у онкологических больных, получавших полихимиотерапию, выступает стойкая депрессия кроветворения [Skillings J.R., 1993; Barrett-Lee P.J., 2000; Зак К.П., Грыцюк С.Н., 2001; Бредер В.В. и др., 2002; Littlewood T.J., Collins G.R., 2007; Woo S. et al., 2007]. Лейкопения, анемия, тромбоцитопения и другие гематологические нарушения значительно ухудшают качество жизни пациентов, снижая при этом сопротивляемость к инфекциям, усугубляют многие негативные явления проводимого противоопухолевого лечения [Moullet I. et al., 1998; Groopman J.E., Itri J., 1999; Beutel G., Ganser A., 2007].
За последние 50 лет подходы к терапии цитостатических и лучевых миелодепрессий претерпели значительные изменения. Достаточно длительное время характер лечебных мероприятий при различных нарушениях кроветворения ограничивался антибиотикотерапией возникших инфекционных осложнений и назначением комплекса поддерживающих препаратов. К числу таких соединений относятся неспецифические протекторы гемопоэза (зимозан, спленин, витамины С, В1, В6), гормоны, соли лития и др. [Byron J.W., 1970; Greco F.A., Breton H.D., 1977; Rothstein G. et al., 1978; Алмазов В.А. и др., 1981; Гершанович М.А., 1982; Закенфельд Г.К., 1985; Patchen M.L., Mac Vittie T.J., 1985; Мороз Б.Б. и др., 1986; Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Жданов В.В. и др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Машковский М.Д., 2007]. Однако клинические наблюдения показали, что при выраженных и длительно текущих миелодепрессиях применение указанных лекарственных средств малоэффективно, более того, в ряде случаев они вызывают различные неблагоприятные побочные эффекты.
Трансфузия тромбоконцентрата и эритроцитарной массы, обычно применяемая для коррекции соответственно тромбоцитопении и анемии, позволяет быстро восполнить число циркулирующих эритроцитов [Mercuriali F., 1997; Бредер В.В. и др., 2002]. При угрожающих жизни состояниях трансфузия незаменима. В то же время анемия при злокачественном процессе носит хронический характер, а частые гемотрансфузии существенно повышают риск возникновения побочных эффектов, таких как передача вирусных инфекций, аллергические реакции и др. [Brunson M.E., 1990; Skillings J.R., 1993; Barrett-Lee P.J., 2000; Птушкин В.В., 2002].
Настоящим прорывом в борьбе с нейтропениями, анемиями, тромбоцитопениями и другими нарушениями системы крови после интенсивной цитостатической терапии можно считать цитокинотерапию. С патогенетических позиций клиническое применение препаратов, созданных на основе рекомбинантных форм цитокинов (миелоидные колониестимулирующие факторы – ГМ-КСФ, Г-КСФ, интерлейкины, эритропоэтин, тромбопоэтин), весьма перспективно [Geissler K., 2000; Demetri G.D., 2001; Basser R., 2002; Abdelrazik N. et al., 2003; Птушкин В.В., 2004; Переводчикова Н.И., 2005; Stasi R. et al., 2005; Giannini E.G., 2006; Beutel G., Ganser A., 2007; Jelkmann W., 2007; Littlewood T.J., Collins G.R., 2007]. Связываясь с высокоаффинными специфическими рецепторами, а при увеличении уровня цитокина в крови и тканях – и с рецепторами умеренной аффинности, факторы роста стимулируют пролиферацию и индуцируют дифференцировку соответствующих коммитированных кроветворных клеток-предшественников [Воробьев А.И., 2002; Скурихин Е.Г. и др., 2005; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. Преимущества таких лекарственных средств обусловлены их исключительно высокой активностью и возможностью целенаправленного воздействия на основное звено патогенеза соответствующего гематологического расстройства [Moore M.A.S., Warren D.I., 1987; Moore M.A., 1989; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., 2001; Glaspy J.A., 2003]. Недостатками применения препаратов рекомбинантных цитокинов являются малая эффективность при краткосрочном применении и развивающиеся осложнения при длительном введении.
В настоящее время нуклеиновые кислоты и их производные рассматриваются как средства для профилактики и лечения нарушений в системе крови на фоне цитостатической терапии [Серебрянная Н.Б., Новик А.А., 2001; Машковский М.Д., 2007]. Кроме того, препараты нуклеиновых кислот успешно применяют в кардиологии, пульмонологии, андрологии, гастроэнтерологии, эндокринологии, онкологии, неврологии, иммунологии [Каплина Э.Н., 2000, 2005; Караулов А.В., 2002; Машковский М.Д., 2008]. Оправдано их назначение при нарушениях свертывающей системы [Карамышев В. Н., 1993; Касьяненко Ю.И., 1999] и аутоиммунных заболеваниях [Каплина Э.Н., 2005], при диабете, боковом амиотрофическом склерозе, артритах [Bodera P., 2011], бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни лёгких [Parry-Billings M., Ferrari N., Seguin R., 2010], мышечной дистрофии [Heemskerk H. et al., 2010]. Как видно, мишенью для нуклеиновых кислот выступают любые ткани. Однако, как и в случае применения многих высокоактивных молекул, нерешённой проблемой терапии препаратами нуклеиновых кислот является адресная доставка к тканям, относительно низкая концентрация в клетке и быстрая деградация нуклеазами в лизосомах.
Большие надежды в решении этих проблем связывают с модификацией биологически активных соединений с помощью присоединения к ним молекул полиэтиленоксида (пегилирование). Так, использование технологии иммобилизации молекул на носителях низкой молекулярной массы электронно-лучевым (радиационным) синтезом [Vereschagin E.I. et al., 2001] позволяет, с одной стороны, пролонгировать активность лекарственного средства (в силу более продолжительного нахождения в крови), с другой стороны – устраняет многие нежелательные побочные реакции (в силу низкой иммуногенности и малой токсичности получаемых соединений) (иммобилизированные Г-КСФ, эритропоэтин и др.) [Дыгай А.М., Артамонов А.В., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., 2009; Дыгай А.М. и др., 2009; Андреева Т.В. и др., 2010; Дыгай А.М. и др., 2010, 2011]. Известно, что гиалуронидаза уменьшает вязкость гиалуроновой кислоты, вызывая ее распад до глюкозамина и глюкуроновой кислоты, тем самым, увеличивая проницаемость тканей, в том числе, для фармакологических агентов [Bitencourt C.S. et al., 2011]. С нашей точки зрения, наиболее перспективным является совместное назначение модифицированного лекарственного средства с веществом, снижающим вязкость межклеточного матрикса. Так, в частности, продемонстрировано увеличение биодоступности модифицированного радиационным синтезом Г-КСФ при его совместном назначении с гиалуронидазой [Андреева Т.В. и др., 2010].
В связи с вышесказанным, является актуальным изучение гемопоэзстимулирующей активности, назначаемых изолированно и совместно, иммобилизированных на полиэтиленоксиде электронно-лучевым синтезом олигонуклеотидов и гиалуронидазы.
Цель исследования. Изучить гемопоэзстимулирующую активность иммобилизированных на полиэтиленоксиде олигонуклеотидов, назначаемых изолированно или совместно с иммобилизированной гиалуронидазой, в условиях цитостатической миелосупрессии.
Задачи исследования:
1. Оценить зависимость скорости восстановления лейкоцитов в периферической крови в условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, от дозы иммобилизированных на полиэтиленоксиде олигонуклеотидов.
2. На модели цитостатической миелосупрессии исследовать влияние различных доз иммобилизированной на полиэтиленоксиде гиалуронидазы на скорость восстановления числа лейкоцитов периферической крови.
3. Разработать схему совместного применения пегилированных веществ, при которой иммобилизированная гиалуронидаза усиливает гемопоэзстимулирующую активность иммобилизированных олигонуклеотидов в условиях цитостатического воздействия.
4. На модели цитостатической миелосупрессии изучить влияние изолированно вводимых иммобилизированных олигонуклеотидов, а также их комбинации с иммобилизированной гиалуронидазой на костномозговое кроветворение.
5. Вскрыть механизмы гемостимулирующих эффектов пегилированных олигонуклеотидов в условиях их изолированного или сочетанного с иммобилизированной гиалуронидазой применения.
Научная новизна работы. В работе на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной однократным введением циклофосфана в МПД, выявлена гемопоэзстимулирующая активность иммобилизированных олигонуклеотидов (имОН), вводимых мышам линии CBA/CaLac перорально, а также механизмы их действия. Показана возможность повышения иммобилизированной гиалуронидазой фармакологической активности иммобилизированных олигонуклеотидов при цитостатической миелосупрессии.
Результаты скрининговых исследований показали, что в условиях введения цитостатика иммобилизированные олигонуклеотиды ускоряют процессы регенерации периферического звена гранулоцитарного ростка кроветворения во всех исследуемых дозах (50, 100, 150, 200, 250 мг/кг). Наиболее выраженный стимулирующий эффект отмечается у животных, получавших имОН в дозе 200 мг/кг.
На модели миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, выявлено, что иммобилизированная гиалуронидаза ускоряет восстановление содержания сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей в дозе 50 ЕД/кг и не влияет на их число в дозе 25 ЕД/кг.
При изучении костномозгового кроветворения животных, подвергнутых цитостатическому воздействию (циклофосфан), установлено, что наиболее чувствительным к стимулирующему действию иммобилизированных олигонуклеотидов (200 мг/кг) является гранулоцитарный росток кроветворения. В основе эффектов иммобилизированных олигонуклеотидов лежит увеличение содержания эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в костном мозге и усиление их дифференцировки в зрелые кроветворные клетки, при этом снижаются секреторная активность клеток кроветворного микроокружения и уровень сывороточных ростовых факторов.
На модели миелосупрессии (циклофосфан) продемонстрировано, что кратковременное (2-кратное) назначение иммобилизированной гиалуронидазы повышает эффективность коррекции иммобилизированными олигонуклеотидами нарушений со стороны костномозгового эритро- и гранулоцитопоэза, ускоряет восстановление количества лейкоцитов в периферической крови. Более длительное (3-кратное, 7-кратное) введение имГД, напротив, препятствует проявлению гемопоэзстимулирующей активности имОН. В основе феномена потенцирования лежит увеличение содержания гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в кроветворной ткани.
Практическая значимость работы. Продемонстрирована высокая эффективность перорального использования нового отечественного гемостимулятора, представляющего собой иммобилизированные с помощью оригинальной технологии электронно-лучевого синтеза олигонуклеотиды (разработанной ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск совместно с ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск). Полученные результаты о потенцирующих свойствах иммобилизированной гиалуронидазы могут явиться основой для разработки новых методов усиления активности гемостимуляторов при гипопластических состояниях кроветворной ткани.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы.» (Екатеринбург, 2010), VI региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками, 30 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 296 источников, из них 84 отечественных и 212 зарубежных.
