Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Производные дигидрокверцетина. Их структура и биологическая роль 10
1.1.1. Химическая структура дигидрокверцетина и его производных 10
1.1.2. Фармакокинетика дигидрокверцетина и его производных 11
1.1.3. Комплексы включения производных дигидрокверцетина в циклодекстрин 13
1.2. Фармакологические эффекты дигидрокверцетина и его производных 17
1.2.1. Механизмы действия ПДГК 17
1.2.2. Противовоспалительная активность ПДГК 20
1.2.3. Антигипертензивное действие дигидрокверцетина и его производных 22
1.2.4. Производные дигидрокверцетина и окисление белков 25
1.2.5. Антиатеросклеротическое действие производных дигидрокверцетина 29
1.2.6. Нейротропная активность дигидрокверцетина и его производных 32
1.2.7. Противоопухолевая активность дигидрокверцетина и его производных 35
1.3. Клиническое применение дигидрокверцетина и его производных 39
2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Исследуемые соединения 44
2.2. Используемые методы исследования 47
2.2.1. Хемилюминесцентный метод 47
2.2.2. АБТС-тест 48
2.2.3. Исследование влияния ПДГК на жизнеспособность культивируемых клеток . 50
2.2.4. Оценка влияния дигидрокверцетина и его производных на окисление фибриногена озоном 51
2.2.5. Изучение противовоспалительной активности 53
2.3. Статистический анализ полученных результатов 55
3. Результаты исследований 57
3.1. Изучение антиоксидантной активности новых производных дигидрокверцетина 57
3.1.1. Оценка антиоксидантных свойств с помощью хемилюминесцентного метода 57
3.1.2. Оценка антиоксидантных свойств с помощью АБТС-теста 67
3.1.3. Взаимосвязь между химическим строением и антиоксидантной активностью 73
3.2. Влияние производных дигидрокверцетина на жизнеспособность культивируемых клеток 76
3.3. Оценка влияния дигидрокверцетина и его производных на окисление фибриногена озоном 78
3.4. Изучение противовоспалительной активности исследуемых соединений 92
4. Обсуждение результатов 102
4.1. Перспективы применения антиоксидантов 102
4.2. Перспективы применения дигидокверцетина и его производных 105
4.3. Расширение применения производных дигидрокверцетина на примере терапии метаболического синдрома 109
4.4. Применение производных дигидрокверцетина для устранения негативного эффекта дисбаланса ПНЖК в современном рационе питания. 113
4.5. Заключение 119
5. Выводы 122
6. Список литературы
- Комплексы включения производных дигидрокверцетина в циклодекстрин
- Исследование влияния ПДГК на жизнеспособность культивируемых клеток
- Оценка антиоксидантных свойств с помощью АБТС-теста
- Расширение применения производных дигидрокверцетина на примере терапии метаболического синдрома
Введение к работе
Актуальность
Производные дигидрокверцетина (ПДГК) – флавоноиды, обладающие
значительной антиоксидантной активностью и по химическому строению
близкие к дигидрокверцетину. ПДГК представляют значительный научный
интерес благодаря своей низкой токсичности (Шкаренков А.А. и др., 1998;
Tapas et al., 2008) и ряду ценных фармакологических свойств, обладая
противовоспалительным (Garcia-Lafuente A. et al., 2009),
антиатеросклеротическим, антигипертензивным и другими эффектами
(Perez-Vizcaino F., et al., 2009).
Также важна возможность антиоксидантов, в том числе
дигидрокверцетина, предотвращать окисление белков. Белки, подвергнутые
окислительной модификации, накапливаются в организме с возрастом, а
также при различных заболеваниях (например, сахарный диабет) (Иванова
И.П. и др., 2011). Однако до настоящего времени способность
дигидрокверцетина и его производных оказывать влияние на окисление
белков не была изучена, хотя такие исследования могут расширить
обоснования применения ПДГК для терапии широкого спектра заболеваний, в патогенезе которых значительную роль играет повышенное окисление липидов и белков. ПДГК являются липидорастворимыми соединениями, что ограничивает их биодоступность. В настоящее время синтезируются новые производные дигидрокверцетина с целью создания соединений с большей сбалансированностью свойств (обладающих высокой антиоксидантной активностью при достаточной водорастворимости) (Коротеев А.М. и др., 2009).
Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности скрининга новых производных дигидрокверцетина и изучения их антиоксидантной и противовоспалительной активности.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение антиоксидантной и противовоспалительной активности новых производных дигидрокверцетина и их водорастворимых форм. В диссертационной работе были поставлены следующие задачи.
-
Провести исследование антиоксидантной активности новых производных дигидрокверцетина методом Fe2+-индуцированной хемилюминесценции и методом АБТС-теста. Отобрать наиболее перспективные соединения для дальнейшего изучения.
-
Оценить сохранность антиоксидантных свойств ПДГК при образовании их водорастворимых форм (формировании комплексов включения в циклодекстрин).
-
Оценить цитотоксичность исследуемых ПДГК на культуре клеток с помощью МТТ-теста.
-
Провести исследование влияния дигидрокверцетина и его перспективных производных на окисление белков плазмы крови на модели озон-индуцированного окисления фибриногена.
-
Провести исследование противовоспалительной активности дигидрокверцетина и его перспективных производных на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши.
Научная новизна
Впервые проведено исследование антиоксидантной активности новых
производных дигидрокверцетина, в том числе новых водорастворимых форм.
Установлено, что производное дигидрокверцетина КН-14 (6-
[(дивторбутиламино)метил]-ДГК) обладает антиоксидантной активностью, большей, чем у нативного дигидрокверцетина (ДГК). Выявлено, что образование водорастворимых форм ДГК и его производных путем синтеза комплекса включения данных соединений в циклодекстриновую оболочку не оказывает значительного влияния на их антиоксидантную активность.
Впервые показано, что нативный дигидрокверцетин и водорастворимые формы ДГК и КН-14 (комплексы включения в циклодекстрин) обладают протективной активностью в отношении окисления озона фибриногеном, в значительной степени сохраняя нативные свойства фибриногена после окисления озоном. Также на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши впервые выявлена выраженная противовоспалительная активность ДГК и КН-14, сопоставимая с противовоспалительной активностью нестероидных противовоспалительных средств.
Практическая значимость работы
Выявленные фармакологические эффекты дигидрокверцетина и его
новых производных открывают перспективы для их более эффективного
клинического применения. Установление факта, что образование
водорастворимых форм дигидрокверцетина и его производного КН-14 не
уменьшает их антиоксидантную активность и не ослабляет другие
фармакологические эффекты, создает основу для дальнейшего
доклинического изучения данных соединений и создания инъекционных лекарственных форм. Также выявленная способность дигидрокверцетина и его производного КН-14 блокировать окисление фибриногена открывает перспективы использования данных соединений для профилактики и лечения нарушений свертывающей системы крови, возникающих вследствие оксидантного стресса.
Положения, выносимые на защиту
1. К наиболее перспективным для дальнейшего изучения ПДГК, помимо
нативного дигидрокверцетина, относятся КН-14, КН-14-ЦД и ДГК-ЦД,
обладающие выраженной антиоксидантной активностью (АОА) в
различных моделях. АОА соединения КН-14 превышает АОА ДГК.
При включении ПДГК в циклодекстриновую оболочку, придающую им
гидрофильные свойства, антиоксидантные свойства данных
соединений сохраняются.
-
Дигидрокверцетин и его производные, КН-14 и КН-14-ЦД, препятствуют окислительному повреждению фибриногена in vitro, сохраняя его нативные свойства.
-
Дигидрокверцетин и его производное КН-14 в нативной и водорастворимой форме обладают выраженной противовоспалительной активностью на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены в виде докладов и публикации тезисов на научных конгрессах и конференциях, среди которых Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 2011, ХII международная молодежная конференция ИБХФ РАН «Биохимическая физика» 2012, VIII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых 2013. Диссертационная работа апробирована 15 мая 2013 г. на совместном заседании кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика РАМН П.В. Сергеева, кафедры фармакологии, кафедры физики и медицинской электроники МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 7 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России (4 статей и 3 тезисов).
Личный вклад
Автор самостоятельно проводил работы по исследованию
антиоксидантной и противовоспалительной активности изучаемых
соединений. Проведены эксперименты по изучению влияния исследуемых соединений на окисление фибриногена и на пролиферацию культивируемых клеток, обработка и статистический анализ полученных данных. Публикации
по теме настоящей работы подготовлены непосредственно автором диссертации.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4х глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 156 источников. Работа выполнена на 137 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 11 таблиц.
Комплексы включения производных дигидрокверцетина в циклодекстрин
Растворимость в воде ДГК-ЦД составляет 53,2 г/л, в то время как для нативного ДГК водорастворимость составляет 0,3 г/л, а для свободного циклодекстрина 18,5 г/л [14]. Помимо возможности внутривенного введения, инкапсулирование дигидрокверцетина в циклодекстрин облегчает и всасывание дигидрокверцетина из желудочно-кишечного тракта при пероральном введении. Показано, что пpи пеpоpальном введении комплекcа ДГК-ЦД обеcпечиваетcя длительное повышенное cодеpжание дигидрокверцетина в плазме кpови кpыc [11]. В то же время, данный вариант введения удобен и тем, что циклодекстрины практически не всасываются при энтеральном введении. Комплексы включения в циклодекстрин отличаются низкой стабильностью в водных растворах, что выражается в динамическом равновесии между свободной и инкапсулированной формой соединений. Из плазмы крови ДГК переходит в межклеточное пространство, захватывается макрофагами, связывается с глюкуроновой кислотой, что приводит к постепенному уменьшению концентрации свободного дигидрокверцетина. В случае введения комплекса ДГК-ЦД происходит более медленное, постепенное снижение концентрации дигидрокверцетина, по сравнению с введением нативного дигидрокверцетина [11].
Для комплексов включения в циклодекстрин (комплексы гость-хозяин) характерна закономерность формирования более устойчивых комплексов из более гидрофобных молекул-гостей. Таким образом, стоит ожидать большей клинической эффективности комплексов включения производных дигидрокверцетина, обладающих большей гидрофобностью, по сравнению с нативным дигидрокверцетином. В частности, соединение КН-14, согласно нашим исследованиям, более гидрофобное, чем ДГК, формирует более устойчивые комплексы включения в циклодекстрин.
Ввиду широкого применения циклодекстринов в литературе большое внимание уделяется исследованиям их токсичности. Согласно данным большинства работ, циклодекстрины являются малотоксичными соединениями. Так, в одной из работ оценивается состояние пациентов, получавших внутривенное введение гидроксипропил--циклодекстрина в дозе 1,5 г/кг. В данном исследовании отмечается преимущественное отсутствие неблагоприятных эффектов. Многие другие авторы отмечают нефротоксичность при парентеральном введении циклодекстринов, проявляющуюся в различной степени, в зависимости от типа используемого циклодекстрина. Доза, не вызывающая эффекта в экспериментах на крысах для 2-гидроксипропил--циклодекстрина составляет как минимум 50 мг/кг при внутривенном введении 4 раза в день в течение трех месяцев [140] [134]. Отмечается, что 2-гидроксипропил--циклодекстрин, использующийся в данной работе, можно считать безопасным, в том числе для внутривенного введения [61] [79].
Окисление флавоноидов катализируется ионами тяжелых металлов и под действием света. Промежуточные формы окисления флавоноидов могут являться токсичными для клеток, и в процессе их взаимопревращения в ряде случаев образуются АФК. Тем не менее, флавоноиды считаютcя одними из наиболее важных антиоксидантов.
Помимо прямого взаимодействия со свободными радикалами, ПДГК также проявляют способность связываться с ионами металлов, в том числе они являются хелаторами ионов железа. Ионы металлов способны инициировать процессы ПОЛ, поэтому, связывая их, производные дигидрокверцетина проявляют опосредованную антиоксидантную активность [72]. Относительная гибкость молекулы дигидрокверцетина (возможность вращения одного ароматического кольца вокруг сопряженных двух фенольных колец) и наличие 5 гидроксильных групп, способных образовывать водородные связи, позволяют ей довольно прочно связываться с белковыми макромолекулами и ингибировать ряд ферментов.
Кверцетин ингибирует ксантин-оксидазу, уменьшая оксидантное повреждение органов и тканей. Концентрация кверцетина, при которой наблюдается 50%-е уменьшение активности ксантин-оксидазы, составляет 7,23 микромоль [51]. Ксантин-оксидаза осуществляет превращение ксантина в мочевую кислоту. Известно, что ксантин-оксидазный путь играет важную роль в окислительном повреждении тканей, так как в процессе работы этого фермента образуется значительное количество активных форм кислорода. Данный процесс особенно важен после ишемии-реперфузии, когда в тканях накапливаются продукты распада пуринов [95].
Кверцетин ингибирует работу кальмодулин-зависимых ферментов, в том числе участвующих в дегрануляции тучных клеток [95], [91]. Согласно недавно полученным результатам, дигидрокверцетин индуцирует экспрессию детоксицирующих ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков [100]. Являясь антагонистом протеинкиназы С, кверцетин ингибирует дегрануляцию нейтрофильных гранулоцитов, не влияя на их жизнеспособность, а также подавляет образование супероксида и фосфорилирование специфических белков нейтрофильных гранулоцитов
Исследование влияния ПДГК на жизнеспособность культивируемых клеток
Показано, что ПДГК вызывают значимое, устойчивое и дозо-зависимое снижение артериального давления в большинстве общепринятых моделях гипертензии у крыс [119]. Так, в одной из моделей для индукции гипертензии у крыс использовался ингибитор NO-синтазы L-NAME. Кверцетин в дозе 10 мг/кг, вводимый совместно с L-NAME, полностью предотвращал развитие L-NAME-индуцированной гипертензии. В дозе 5 мг/кг кверцетин также показал высокую эффективность, однако, антигипертензивный эффект в этом случае развивался более медленно, и стал значительным только после четырех недель введения кверцетина [65].
В другом исследовании кверцетин вводился 14-ти недельным крысам со спонтанной гипертензией (SHR). SHR (spontaneously hypertensive rats) – модель наследственной мультифакториальной гипертензии, которая считается сходной с эссенциальной гипертонией человека [118]. Кверцетин, растворявшийся с использованием метилцеллюлозы, вводившийся в течение пяти недель, перорально через зонд, в дозе 10 мг/кг, вызвал значимое снижение систолического (-18%), диастолического (-23%) и среднего (-21%) артериального давления, а также ЧСС (-12%) [101]. Стоит отметить, что результаты некоторых работ по оценке антигипертензивного эффекта кверцетина не согласуются между собой. Так, в эксперименте, при котором крысы SHR получали диету, обогащенную кверцетином (при этом доза кверцетина составляла 130 мг/кг), не отмечалось значимого снижения артериального давления [47].
На модели дезоксикортикостерон ацетатной (ДОКА)-солевой гипертезии у крыс сравнивался антигипертензивный эффект кверцетина и блокатора кальциевых каналов верапамила. Данная модель гипертензии является объемозависимой, запускается введением NaCl и характеризуется супрессией уровня плазменного ренина, вследствие повышенной концентрации натрия. В данных условиях некоторые классы антигипертензивных препаратов, такие как блокаторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), показывают низкую эффективность. Кверцетин в дозе 10 мг/кг блокировал развитие ДОКА-солевой гипертензии. Данный эффект сходен таковому эффекту верапамила в дозе 20 мг/кг [75].
В одном из исследований авторы предприняли попытку изучить механизм антигипертензивного действия кверцетина [106]. Для индукции гипертензии у крыс использовалась модель две почки – один зажим (2K1C wo-kidney, one-clip), при которой происходит снижение кровотока к одной из почек. Ишемизированная почка продуцирует ренин, что вызывает повышенное образование ангиотензина II и, следовательно, повышает артериальное давление. Опытным и ложнооперированным крысам перорально через зонд вводился кверцетин в дозе 10 мг/кг/день. Контрольной группе вводился растворитель. Оценивалось систолическое артериальное давление (САД), сосудистый ответ на ацетилхолин и нитропруссид натрия, а также концентрация в плазме нитратов, нитритов, НАДФH-оксидазная активность и продукция супероксида. У нормотензивных крыс кверцетин не оказал значимых эффектов. У 2K1C-крыс кверцетин значительно снизил САД, а также восстановил уровень метаболита оксида азота, плазменного нитрита, сниженного после редуцирования кровоснабжения одной из почек. Введение кверцетина не оказало существенного влияния в отношении сосудистого ответа на нитропруссид натрия, но восстановило сосудистый ответ на ацетилхолин. Также кверцетин существенно ослабил повышение НАДФH-оксидазной активности и сосудистой продукции супероксида, индуцированное 2K1C гипертензией. Результаты данного исследования свидетельствуют, что антигипертензивное действие кверцетина может быть ассоциировано с увеличением образования NO и, следовательно, с уменьшением тонуса гладких мышц сосудов. Также стоит отметить, что следствием антиоксидантной активности кверцетина может являться и снижение скорости деградации NO [107].
Чтобы оценить антигипертензивный эффект кверцетина у пациентов с гипертезией, было проведено рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое клиническое исследование. Пациенты принимали кверцетин в дозе 730 мг ежедневно в течение 28 дней. У испытуемых с прегипертензией не отмечалось значимого изменения артериального давления, в то время как у пациентов с первой стадией артериальной гипертонии обнаружилось уменьшение систолического, диастолического и среднего артериального давления на 7, 5 и 5 мм рт. ст. соответственно (p 0,01). В противоположность исследованиям с моделированием гипертензии на крысах, показатели оксидантного стресса, измеренные в плазме и моче пациентов, не изменились под влиянием кверцетина [118]. Стоит отметить, что, согласно данным FDA, количество кверцетина, поступающего в норме с пищей у его интенсивных потребителей составляет 9 мг/кг/день (90-й процентиль), что примерно соответствует дозе, использующейся в данной работе.
Таким образом, результаты многочисленных исследований свидетельствуют о наличии у кверцетина антигипертезивного эффекта, который может быть связан с повышением уровня оксида азота и снижением НАДФH-оксидазной активности. Кверцетин предотвращает морфологические изменения сосудов, почек и сердца, в том числе левожелудочковую гипертрофию, имеющие место при гипертензии [77], [119].
Механизмы антигипертензивного действия кверцетина остаются до конца не изученными. Они могут быть связаны с его антиоксидантной активностью. Посредством прямого взаимодействия с супероксидным радикалом или же посредством ингибирования ферментных систем, участвующих в синтезе супероксида, кверцетин может увеличивать биодоступность и активность оксида азота [118]. Тот факт, что в исследованиях на добровольцах антигипертензивный эффект не был ассоциирован с изменением показателей оксидантного стресса, может свидетельствовать об иных механизмах антигипертензивного действия кверцетина. В частности, имеются данные о прямом, в том числе эндотелий-независимом, сосудорасширяющем эффекте кверцетина [118, 119]. В любом случае, согласно результатам многих исследований как in vivo, так и in vitro, кверцетин не оказывает эффекта на ангиотензинпревращающий фермент [119], [112], [23].
Оценка антиоксидантных свойств с помощью АБТС-теста
Уже длительное время дигидрокверцетин и его производные применяются для лечения сосудистых заболеваний, в частности, профилактики венозной недостаточности. Так, давно используется троксерутин, полусинтетическое производное рутина. Это один из первых препаратов флебопротекторов, оказывающих выраженное местное противовоспалительное и противоотечное действие. Сообщается об успешном клиническом применении кверцетина для терапии атрофических язвенных заболеваний, в том числе язв ротовой полости, язвенного гастрита и колита. В одном из исследований кверцетин у пациентов с атрофической язвой ротовой полости показал большую эффективность, чем нестероидный противовоспалительный препарат бензодамина гидрохлорид [83].
Сообщается, что дигидрокверцетин показал хорошие результаты при его применении в комплексном лечении гипертонической болезни. В ходе клинических исследований дигидрокверцетина (препарат капилар) обнаружен антигипертензивный эффект данного соединения, а также подтверждены его вазопротекторные свойства [34]. Отмечается также положительный эффект дигидрокверцетина в коррекции метаболических нарушений у больных с атеросклерозом и артериальной гипертонией [5].
Благодаря нейропротекторной активности кверцетин нивелирует ухудшение памяти при ишемических и нейродегенеративных заболеваниях. Также отмечается эффективность кверцетина и его производных в терапии болезни Альцгеймера. При данном заболевании кверцетин увеличивает пролиферацию и синаптогенез нейронов гиппокампа [137].
Таким образом, кверцетин и его производные активно применяются в клинической практике для комплексного лечения сердечно-сосудистых и других заболеваний. Однако следует отметить, что, несмотря на высокую эффективность в комбинированной терапии, как средство для монотерапии кверцетин до настоящего времени применяется сравнительно редко. Сейчас ведутся активные исследования в целях дальнейшего расширения его клинического использования.
Известно, что атеросклеротическое поражение сосудов является одним из важнейших элементов патогенеза тромбозов артерий сердца и головного мозга. Таким образом, антиатеросклеротическое действие кверцетина и его производных открывает широкие перспективы для применения данных препаратов в терапии сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний.
Так, в двойном слепом плацебо-контролируемом рандомизированном перекрестном клиническом исследовании с участием 93 добровольцев с метаболическим синдромом было показано, что пероральный прием кверцетина в дозе 150 мг/день значительно уменьшает уровень окисленных ЛНП плазмы крови и содержание ФНО-. Данная дозировка была подобрана с целью 15-кратного превышения среднего суточного потребления кверцетина с пищей среди населения Баварии. Также стоит отметить, что кверцетин в данной дозе показал антигипотензивный эффект у пациентов с вариантом гена аполипопротеина Е apoE3. Известно, что аполипопротеин Е обладает высоким сродством к холестерину и играет ведущую роль в рецепторном захвате ЛНП. Большинство людей имеет вариант гена apoE3, у меньшей части встречается apoE4, другие варианты этого гена распространены в значительно меньшей степени. В отличие от антигипертензивного действия, эффект уменьшения окисленных ЛНП плазмы крови при приеме кверцетина имеет место как у пациентов с генотипом apoE3, так и apoE4 [67].
В другом плацебо-контролируемом исследовании с участием 21 добровольца было показано, что кверцетин в дозе 30 мг/день и экстракт красного вина в дозе 1 г/день (эквивалент 375 мл красного вина), принимаемые перорально, ингибируют окисление ЛНП, что подтверждает антиатеросклеротическое действие красного вина и кверцетина - его основного антиоксидантного компонента. В этом же исследовании сообщается, что прием кверцетина и экстракта красного вина не оказывают влияние на содержание плазменных антиоксидантов – витамина С, Е, ретинола и каротиноидов [53].
Имеются данные о положительном влиянии дигидрокверцетина на микрогемодинамические показатели. В одной из работ оценивался эффект терапии биологической активной добавкой «Капилар» на микроциркуляцию у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей. По результатам рандомизированного слепого плацебо-контролируемого исследования обнаружено, что прием двух таблеток «Капилара» (20 мг дигидрокверцетина) по три раза в день в течение двух месяцев увеличивает линейную скорость кровотока в микроциркуляторном русле. Отмечено, что данный эффект сохранялся у пациентов как минимум в течение одного месяца после окончания приема препарата. Также стоит отметить улучшение показателей жизни пациентов, страдающих хроническим облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей. У пациентов, получавших комбинированную терапию дигидрокверцетином в течение двух месяцев («Капилар» в таблетках + крем-бальзам «Капилар») был обнаружен значительный рост дистанции безболевой ходьбы (более чем в два раза), причем тенденция к увеличению дистанции сохранялась и спустя месяц после отмены терапии [18].
Важное значение имеет противовоспалительная активность кверцетина, позволяя использовать данные соединения в терапии различных заболеваний, связанных с активизацией оксидантного стресса и воспалительных процессов.
Расширение применения производных дигидрокверцетина на примере терапии метаболического синдрома
Сопоставляя спектры, представленные на рисунках 21 и 22, мы видим, что в случае окисления фибриногена в присутствии КН-14-ЦД оптическая плотность в максимуме поглощения фибриногена уменьшается на 5%, тогда как в отсутствии КН-14-ЦД происходит более значимое уменьшение оптической плотности фибриногена – на 30%. Таким образом, КН-14-ЦД оказывает протективное влияние в отношении окисления озоном фибриногена.
Однако в полной мере говорить о защитном действии изучаемых соединений в отношении окисления фибриногена на основании одного лишь спектрофотометрического анализа некорректно. Известно, что одной из основных функций фибриногена в организме является его участие в коагуляции. Поэтому для оценки сохранности нативных свойств фибриногена после окисления озоном в присутствии и в отсутствии изучаемых соединений нами была использовано свойство фибриногена полимеризовываться в фибрин под действием тромбина. Под влиянием тромбина из растворенного в плазме крови фибриногена образуется нерастворимый фибрин за счет отщепления фибринопептидов A и B от А ос- и B - полипептидных цепей E-домена с экспонированием центров полимеризации A и B. Указанные центры комплиментарны участкам a и b, расположенным, соответственно, в уC- и рC- субдоменах, в СООН-терминальных областях D-домена. Молекулы мономерного фибрина соединяются друг с другом таким образом, что центральный Е-домен одной молекулы взаимодействует с двумя D-доменами других молекул, что обусловливает образование структуры жестких стержневидных нитей фибрина. В плазме крови фибриновые полимеры являются субстратом для фибринстабилизирующего фактора (ХШа). Фактор ХШа (плазменная трансглутаминаза), катализирует образование s/y-глутамил-лизиновых изопептидных ковалентных структур [44]. При этом СООН-терминальные участки у-цепей, расположенные в контактирующих между собой D-доменах, ответственны за возникновение межмолекулярных у-димеров, а ос-цепи одной молекулы взаимодействуют, соответственно, с ос-цепями двух других молекул, что ведет к образованию ос-полимеров [110] [26].
Окисленный фибриноген, в результате окислительной модификации претерпевший локальные структурные перестройки в области D-доменов, в плазме крови является субстратом реакций образования ковалентно-сшитых гомополимеров фибриногена, катализируемых фактором ХШа [26].
Озонирование фибриногена является in vitro моделью его окислительной модификации в плазме крови, происходящей как в норме, так и при различных заболеваниях.
В таблице 8 представлены результаты измерения времени фибринообразования после добавления тромбина к неокисленному фибриногену, а также к окисленному (озонированному), как в присутствии, так в отсутствии изучаемых соединений. Таблица 8. Время образования фибринового сгустка у нативного фибриногена, окисленного фибриногена, а также у фибриногена, окисленного в присутствии изучаемых соединений
Как следует из таблицы 8, фибриноген в результате окисления полностью теряет способность полимеризовываться в фибрин. Дигидрокверцетин, комплекс включения дигидрокверцетина в циклодекстрин и комплекс включения КН-14 в циклодекстрин обладают протективной активностью в отношении окисления озоном фибриногена, в значительной степени сохраняя способность окисленного фибриногена полимеризовываться в фибрин после добавления тромбина.
В настоящем исследовании, как и в предыдущих работах других авторов, показано, что окисление фибриногена сопровождается увеличением времени образования фибринового сгустка после добавления тромбина. Однако, данный факт не означает, что в плазме крови, в условиях in vivo, окисление фибриногена опосредует увеличение времени фибринообразования. Увеличение времени фибринообразования после добавления тромбина в условиях in vitro свидетельствует прежде всего о нарушении нативных свойств фибриногена, что in vivo находит свое отражение в нарушении функционирования свертывающей системы крови.
По результатам многочисленных работ показано, что окисление фибриногена в плазме крови приводит к образованию более стабильных тромбоцитарно-лейкоцитарных комплексов после тромбиновой активации фибриногена, чем в экспериментах с неокисленным фибриногеном. Также отмечено, что фибриновые сгустки, образовавшиеся на основе окисленного фибриногена, обладают измененными физико-химическими свойствами, по сравнению с фибриновыми сгустками, полученными из неокисленного фибриногена. Структурная модификация фибриногена, вызванная его окислением, приводит к увеличению времени фибринолизиса, опосредованного плазминогеном и тканевым активатором плазминогена [146]. Таким образом, имеющиеся на текущий момент научные сведения позволяют предполагать, что эндогенное окисление фибриногена приводит к нарушениям в свертывающей системе крови, выражающимся в том числе в удлинении времени тромболизиса. Данные процессы являются важным фактором патогенеза таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу, тромбофлебиты различной этиологии, связанных с повышенным тромбообразованием, в частности, вследствие атеросклеротического поражения сосудов. Обнаруженная протективная активность производных дигидрокверцетина в отношении окисления фибриногена является актуальной в свете применения данных соединений в профилактике и терапии указанных заболеваний.
Изучение противовоспалительной активности исследуемых соединений Антиоксидантная активность производных дигидрокверцетина может опосредовать их противовоспалительные свойства. Известно, что в очаге воспаления происходит усиленная продукция соединений свободнорадикальной природы, что наряду с положительным эффектом удаления чужеродных микроорганизмов также имеет и отрицательный эффект в виде повреждения окружающих органов и тканей [71]. Способность производных дигидрокверцетина уменьшать количество нестабильных свободных радикалов в очаге воспаления в данном случае может способствовать скорейшему разрешению воспаления [116]. Существует и другой механизм противовоспалительной активности производных дигидрокверцетина, заключающийся в ингибировании синтеза и снижении активности ключевых ферментов воспалительной реакции – циклооксигеназы 2 типа, липооксигеназы, матриксных металлопротеиназ, снижая уровень пролиферации в очаге воспаления и образование простогландина Е2, а также других медиаторов воспаления [152].
