Введение к работе
Актуальность проблемы
Актуальность изучения иммунобиологических особенностей лимфопролиферативного синдрома у детей обусловлена, прежде всего, сложностью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных процессов на ранних стадиях. Этой проблеме посвящено немало отечественных и зарубежных работ [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2007; Ковригина A.M., Пробатова Н.А., 2007; Ioachim Н, Ratech Н., 2006]. В последнее десятилетие возросли возможности диагностики инфекционных заболеваний, стал более понятным спектр клинических проявлений таких инфекций как токсоплазмоз, цитомегаловирусная инфекция, инфекционный мононуклеоз [Баранова И.П., 2002; Башмакова М.А., 2000].
Злокачественные процессы кроветворной и лимфоидной тканей являются
одной из важнейших проблем современной медицины и методом,
раскрывающим новые перспективы в понимании природы опухоли, ее
возникновения, развития и прогрессирования является
иммунофенотипирование [Луговская С.А., 2006]. Иммуновариант острого лейкоза, определяющий выбор тактики лечения больных, устанавливают на основании данных об экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов лимфоидных и миелоидных клеток [Дурнов Л.А., 2002; Луговская С.А., 2006]. Кроме того, необходимость оценки состояния функциональной активности и количественного содержания лимфоидных и миелоидных клеток разных типов обусловлена тем, что они избирательно подвергаются воздействию цитостатиков, что может влиять на результаты терапии. Сложно провести четкое разделение между острым лейкозом и лимфобластной лимфомой, так как по клинической картине эти заболевания довольно схожи, отсутствуют специфические лабораторные проявления и различия между ними иногда можно выявить только при изучении опухолевого субстрата. В связи с тем, что в настоящее время метод проточной цитометрии в клинической практике не является рутинным методом диагностики, возникает
необходимость более подробного изучения лимфомы для выявления критериев дифференциального диагноза [Воробьева А.И., 2002; Масчан А.А., 2006; LocksleyR.M.,2001].
В основе процессов, протекающих как при доброкачественной лимфаденопатии так и при гемобластозах, лежит гиперплазия лимфоидной ткани, т.е. непосредственное вовлечение лимфоидных клеток в процесс пролиферации. Активно пролиферирующие клетки синтезируют ДНК и находятся в разных фазах (G1-, S-, G2- или М-фазе) клеточного цикла, т. е. представляют собой «фракцию роста» [Бычкова Н. В., 2004; Владимирская Е.Б., 1998]. При различных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает диплоидным и может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения или увеличения. Последнее (гипердиплоидия, триплоидия, тетраплоидия и т.д.) часто имеет место при злокачественном росте.
Проточная ДНК-цитометрия является одним из методов измерения плоидности бластных клеток позволяющим, кроме того, характеризовать кинетический профиль, что может варьировать в зависимости от интенсивности пролиферации [Mtiller H-J., 2000; Сатрапа D., 2002].
Прикладное значение ДНК-цитометрии при оценке пролиферативной активности лимфоидных клеток обусловлено быстротой исполнения, информативностью, точностью и надежностью метода. Он дает возможность выявлять патологические изменения на стадиях, когда число клеток, подвергшихся опухолевой трансформации, еще незначительно. Выявление в периферической крови клеток с высоким (гиперплоидным) содержанием ДНК может быть связано только с появлением пролиферирующих клеток и говорит о наличии патологии в этой системе [Новик А.А., 2001; Потапнев М.П., 2003; Хисамова Н.Ф., 2005]. Пролиферативная активность отражает индивидуальные свойства опухоли, ее определение необходимо не только для биологической характеристики, но и для определения прогноза заболевания [Мазурик В.К., 2001; Бычкова Н.В., 2004]. Наряду с этим существует мнение о том, что
прогностическое значение плоидности опухолевых клеток вторично и отражает лишь воздействие внешних по отношению к опухоли факторов [Pinto А., 1999; ChasseventA.,2001].
В практической медицине, как правило, в большинстве случаев опухолевые процессы изучаются при развитых клинических проявлениях. Злокачественные новообразования приводят к увеличению лимфатических узлов уже на ранних стадиях заболевания, но принимаются за воспалительную лимфаденопатию, так как клиническая картина еще не ясна и лабораторные данные неспецифичны [Дурнов Л. А., и др., 2002]. Существующие в настоящее время комплексы исследования заболеваний, сопровождающихся гиперплазией лимфоидной ткани, не содержат дифференциально-диагностических тестов, которые могут быть использованы в качестве объективных критериев [Колыгин Б.А.,1990; Динова Е.А.,2007]. Особенно это касается спорных клинических случаев, когда необходима своевременная биопсия лимфатического узла. Это ведет к выбору широким кругом врачей наблюдательной тактики, назначению неадекватной а, следовательно, неэффективной терапии.
Особую значимость при формировании подходов к дифференциальной диагностике доброкачественного и злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей имеет изучение взаимосвязей между иммунобилогическими показателями и функциональными характеристиками клеток. В литературе отсутствуют данные о комплексных исследованиях по изучению иммунологических характеристик клеток и пролиферативной активности. Современный проточно-цитометрический анализ дает возможность с высокой степенью достоверности проводить диагностику, осуществлять мониторинг и прогнозировать течение процесса. Весьма актуальной проблемой, в связи с этим, является разработка на основе проточной цитометрии принципов дифференциальной диагностики доброкачественного лимфо-пролиферативного синдрома и гемобластозов, в частности лимфом и острых лейкозов.
Цель исследования
Разработать иммунобиологические лабораторные критерии для дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у детей на основании иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови, костного мозга и биоптатов.
Задачи исследования
Оценить иммунобиологические особенности лимфаденопатий у детей на основании показателей общегематологических, иммунологических, иммуноферментных методов исследований.
Охарактеризовать плоидность и кинетику клеточного цикла периферической крови и биоптатов при лимфаденопатиях.
Определить плоидность и кинетику клеточного цикла клеток костного мозга и периферической крови методом проточной ДНК-цитометрии при иммунофенотипировании острых лейкозов у детей.
Проанализировать характер распределения иммуногенетических признаков в зависимости от плоидности клеток при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников на основании диагностического HLA -типирования.
Провести лабораторный мониторинг эффективности полихимиотерапии с использованием методов проточной цитометрии при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников.
Провести сравнительный анализ показателей иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии костного мозга, биоптатов и периферической крови при остром лимфобластном лейкозе и лимфомах у детей.
Разработать алгоритм лабораторного обследования больных на основе показателей иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови для дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий, лимфом и острых лимфобластных лейкозов.
Разработать диагностическую компьютерную программу на основе нейронных сетей и результатов иммунофенотипирования острых
лимфобластных лейкозов у детей Республиканской детской клинической больницы за период 2002-2010гг.
Научная новизна исследования
Впервые на основе проточной цитофлюориметрии клеток костного мозга,
биопсийного материала и периферической крови определены
иммунобиологические лабораторные критерии доброкачественных
лимфаденопатий и гемобластозов у детей: доброкачественные
лимфаденопатии, острые лейкозы и лимфомы характеризуются
однонаправленными иммунопатологическими реакциями в виде снижения количества естественных киллерных клеток (CD 16 56 ) и В-лимфоцитоза в периферической крови. Выявлены различия в показателе экспрессии маркера ранней активации CD25 : высокий уровень при острых лимфобластных лейкозах (18 %) и лимфомах (28 %) и низкий при лимфаденопатиях (7,5 %). Впервые установлены дифференциально-диагностические маркеры неходжкинских лимфом. В отличие от лимфобластного лейкоза из клеток предшественников опухолевые клетки при лимфомах характеризуются высокой интенсивностью экспрессии цитоплазматического и мембранного IgM*, анеуплоидный клон характеризуется отсутствием пролиферации. По результатам диагностического HLA-типирования установлена генетическая детерминированность возникновения анеуплоидного клона в костном мозге при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников.
Впервые обосновано значение плоидности и кинетики клеточного цикла в дифференциальной диагностике доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у детей. Доброкачественные лимфаденопатии у детей характеризуются диплоидным типом гистограмм и высокой пролиферативной активностью лимфоидных клеток периферической крови по сравнению с контрольной группой. Маркерами пре-В острого лимфобластного лейкоза являются анеуплоидия бластных клеток костного мозга и высокая интенсивность экспрессии цитоплазматического IgM*. Бластные клетки костного мозга при В-2 остром лимфобластном лейкозе характеризуются
диплоидным набором хромосом и экспрессией антигена ранних предшественников CD34 . Гематологическая ремиссия при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников характеризуется исчезновением анеуплоидного клона бластных клеток в костном мозге и периферической крови. Высокий уровень клеток в фазе пролиферации (S = 0,4-3,0 %) и появление анеуплоидного клона в периферической крови являются маркерами злокачественности процесса.
Практическая значимость работы
Показано диагностическое и прогностическое значение определения плоидности и кинетики клеточного цикла периферической крови и биопсийного материала у детей с синдромом увеличенных лимфатических узлов.
Выявление методом ДНК-цитометрии анеуплоидного клона в костном
мозге и периферической крови, является отражением опухолевой
трансформации при гемобластозах. Определен иммунофенотипический профиль анеуплоидных бластных клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В - клеток предшественников. В ходе сравнительного анализа установлено, что В2 - лимфобластный лейкоз характеризуется диплоидным типом гистограмм, ВЗ - анеуплоидным. Определено прогностическое значение индекса анеуплоидных клеток при ВЗ-остром лимфобластном лейкозе: благоприятным является ДНК > 1.16, так как для этих больных характерна большая продолжительность ремиссии.
При мониторинге полихимиотерапии установлено, что восстановление кроветворения при полной гематологической ремиссии сопровождается исчезновением анеуплоидного клона как в костном мозге, так и в периферической крови, а также повышением пролиферативной активности и экспрессии маркера готовности клеток к апоптозу (CD95 ).
Предложен алгоритм дифференциальной диагностики
лимфопролиферативного синдрома у детей, позволяющий сократить сроки обследования пациентов с лимфаденопатиями различного генеза и определить
на ранних сроках заболевания показания к проведению биопсии лимфатического узла с целью морфологической верификации.
Разработанная компьютерная программа на основании результатов иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга позволяет упростить процесс постановки диагноза у больных с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников.
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы диссертационного исследования внедрены в клиническую практику лечебных и лабораторных подразделений ГБУЗ «Республиканская детская клиническая больница» (РДКБ), используются в учебно-педагогическом процессе на кафедрах лабораторной диагностики Института последипломного образования, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО БГМУ МЗ и СР РФ).
Основные результаты работы, касающиеся ДНК-цитометрии периферической крови, представлены в учебных пособиях: «Области применения ДНК-цитометрии периферической крови в педиатрической практике» (Уфа, 2010), «Диагностическое HLA-типирование в педиатрической практике» (Уфа, 2010).
Положения, выносимые на защиту
1 При лимфаденопатиях, острых лейкозах и лимфомах методом
иммунофенотипирования установлены однонаправленные
иммунопатологические реакции в виде депрессии естественной киллерной цитотоксичности, В-лимфоцитоза, изменений маркера ранней активации CD25 : высокий уровень экспрессии при гемобластозах и низкий - при доброкачественных лимфаденопатиях.
2 ДНК-гистограммы периферической крови при доброкачественных
лимфаденопатиях характеризуются диплоидным набором хромосом и
пролиферативной активностью превышающей показатели контрольной группы.
При гемобластозах выявляются как диплоидный, так анеуплоидный клоны
клеток периферической крови. Кинетика клеточного цикла при
лимфомах/лейкозах с экспансией злокачественных клеток в системный
кровоток отличается высокой пролиферативной активностью; при отсутствии
вовлеченности периферической крови в патологический процесс установлена
низкая пролиферация клеток.
Выявление анеуплоидных бластных клеток костного мозга методом ДНК-цитометрии является дополнительным критерием при верификации вариантов острого лимфобластного лейкоза из В-клеток предшественников.
Иммунобиологическими критериями достижения гематологической ремиссии при лабораторном мониторинге эффективности полихимиотерапии при остром лимфобластном лейкозе наряду с иммунофенотипированием являются показатели ДНК-цитометрии костного мозга и периферической крови.
Показатели ДНК-цитометрии периферической крови: анеуплоидия и высокий показатель пролиферативной активности (S-фаза клеточного цикла) являются одними из показаний для проведения в ранние сроки биопсии лимфатического узла при лимфопролиферативном синдроме.
Наличие цитоплазматических и мембранных IgM*, низкая пролиферативная активность анеуплоидных клеток характеризует клеточный состав неходжкинских лимфом у детей.
Разработанный алгоритм лабораторной диагностики на основе показателей периферической крови позволяет проводить дифференциальную диагностику доброкачественного лимфопролиферативного синдрома и гемобластозов у детей на ранних стадиях опухолевого процесса.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всеросийской научно-практической конференции «Дни
иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям, новые технологии специализированной медицинской помощи» (Уфа, 2007); на рабочем совещании по проточной цитометрии "BD FACS Users Meeting" (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2010); на XIV конгрессе педиатров России с международным участием (Москва, 2010); Всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2011).
Диссертация доложена и обсуждена на совместном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, факультетской терапии, кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, оториноларингологии, фундаментальной и прикладной микробиологии, ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития (протокол № 9 от «10» сентября 2011 г.).
Диссертация апробирована на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (протокол № 10 от «14» октября 2011г.).
Публикации
По теме исследования в печати опубликовано 23 научные работы, в том числе 15 в журналах, включенных в перечень рецензируемых и рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, 1 монография, методическое руководство, свидетельство о
государственной регистрации программы № 2010615112 от 9.08.2010 г. Новизна исследования подтверждена патентом РФ № 2416795 от 27.01.2010.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 189 страницах компьютерного текста, содержит 36 таблиц и 37 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (6 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 294 источника, в том числе 143 зарубежных.
