Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Ферменты, катализирующие гидролиз ФОС 11
1.2. Органофосфатгидролаза 13
1.2.1. Кинетические характеристики и субстратная специфичность ОРН 13
1.2.2. Структура активного центра и механизм действия ОРН 16
1.3. Экспрессия гена, кодирующего синтез ОРН в различных биологических объектах 21
1.4. Факторы, обуславливающие высокоэффективную экспрессию генов в клетках Е. coli 26
1.4.1. Конфигурация эффективного экспрессионного вектора 27
1.4.2. Направленная локализация синтеза белков 29
1.4.3. Молекулярные шапероны и протеолиз 31
1.4.4. Условия культивирования 35
1.5. Гибридные белки, выделение и их свойства 37
1.5.1. Полигистидинсодержащие белки и генетические конструкции для их получения 39
1.5.2. Носители для выделения НІ8б-содержащих белков 44
1.5.3. ОРН в составе гибридных белков 49
1.6. Комплексообразование металлов с остатками гистидина в белках 51
1.7. Белки, содержащие неприродные аминокислоты в структуре молекулы 54
Экспериментальная часть 58
2.1. Материалы и приборы 58
2.1.1. Реактивы 58
2.1.2. Ферменты 59
2.1.3. Бактериальные штаммы 59
2.1.4. Питательные среды 60
2.1.5. Составы растворов 61
2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды 62
2.1.7. Приборы 62
2.2. Методы 63
2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН 63
2.2.2. Определение рН оптимума действия фермента 64
2.2.3. Исследование термостабильности 64
2.2.4. Определение температурного оптимума 64
2.2.5. Определение состава холоформ ферментов Hise-OPH и OPH-His6 64
2.2.6. Приготовление компетентных клеток Е. coli 65
2.2.7. Трансформация компетентных клеток 65
2.2.8. Вьщеление плазмидной ДНК из 200 мл культуральной жидкости 65
2.2.9. Вьщеление плазмидной ДНК кипячением из малых объемов культуральной жидкости 66
2.2.10. Проведение рестрикции ДНК и выделения фрагментов электрофорезом в агарозном геле 66
2.2.11. Лигирование фрагментов ДНК 67
2.2.12. Определение первичной структуры ДНК 67
2.2.13. Конструирование плазмиды pTES-OPH 68
2.2.14. Конструирование плазмиды pTES-His6-OPH для биосинтеза His6-OPH 69
2.2.15. Конструирование плазмиды pTES-OPH-His6 для биосинтеза OPH-His6 70
2.2.16. Определение уровня экспрессии и активности фермента. Изучение кинетики роста клеток Е. coli 70
2.2.17. Определение влажности биомассы 71
2.2.18. Определение растворимости белка 71
2.2.19. Выделение и очистка ОРН 72
2.2.20. Подготовка криоПААГ носителей 73
2.2.21. Определение емкости криоПААГ носителей 73
2.2.22. Вьщеление и очистка His6-OPH и OPH-His6 с использованием криоПААГ 73
2.2.23. Определение концентрации белка 75
2.2.24. Вьщеление и очистка His6-OPH HaNi-NTA агарозе 75
2.2.25. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез) 75
2.2.26. Биосинтез F-замещенного аналога His6-OPH 76
2.2.27. Масс-спектрометрический анализ 3-F-Tyr-His6-OPH 77
2.2.28. Компьютерное моделирование структуры белков 77
2.2.29. Синтез и очистка пептида His6 77
2.2.30. Обработка результатов измерений 78
Результаты и обсуждение 79
3.1. Разработка высокоэффективной системы биосинтеза ОРН в клетках Е. coli, выделение и очистка рекомбинантной ОРН 79
3.1.1. Получение высокоэффективной системы биосинтеза рекомбинантной ОРН 79
3.1.1.1. Конструирование плазмиды pTES-OPH 79
3.1.1.2. Влияние условий культивирования клеток Е. coli на экспрессию гена, кодирующего синтез ОРН 81
3.1.1.2.1. Влияние выбранного штамма на биосинтез ОРН в клетках Е. coli 81
3.1.1.2.2. Влияние температуры культивирования на растворимость синтезируемого белка 83
3.1.1.2.3. Влияние концентрации ИПТГ на уровень синтеза ОРН в клетках Е. coli 84
3.1.1.2.4. Кинетика роста клеток Е. coli DH5a/pTES-OPH при различных концентрациях ИПТГ в культуральной среде 85
3.1.1.2.5. Влияние состава среды, используемой для культивирования штамма-продуцента ОРН, на выход растворимой формы фермента 89
3.1.1.3. Влияние шаперонов на фолдинг ОРН 90
3.1.2. Выделение и очистка рекомбинантной ОРН 93
3.1.2.1. Выделение и очистка ОРН из клеток Е. coli DH5a, трансформированных плазмидой pTES-OPH 93
3.1.2.2. Выделение ОРН с применением FPLC 94
3.2. Разработка высокоэффективной системы биосинтеза аналогов ОРН в клетках Е. coli, их выделение и очистка 98
3.2.1. Генетические конструкции для биосинтеза полигистидинсодержащих аналогов ОРН 98
3.2.1.1. Конструирование плазмид для экспрессии генов, кодирующих полигистидинсодержащие аналоги ОРН 98
3.2.1.1.1.Конструирование плазмиды pTES-His6-OPH для биосинтеза His6-OPH .98 3.2.1.1.2. Конструирование плазмиды pTES-OPH-His6 для биосинтеза OPH-His6 .99
3.2.1.2. Оптимизация условий экспрессии плазмид pTES-His6-OPH и pTES-OPH-His6
в клетках Е. coli W3110, DH5a и SG13009[pREP4] 99
3.2.1.2.1. Анализ биосинтеза His6-OPH и OPH-His6 в клетках Е. coli W3110 99
3.2.1.2.2. Влияние условий культивирования штаммов-продуцентов His6-содержащих аналогов ОРН на выход белков в растворимой форме 102
3.2.2. Очистка полигистидин-содержащих аналогов ОРН 107
3.2.2.1. Выделение и очистка на аффинном носителе Ni-NTA-агарозе 107
3.2.2.2. Очистка His6-0PH на макропористых криоПААГ носителях 108
3.2.2.2.1. Влияние состава препарата на степень очистки Нізб-содержащей ОРН .108
3.2.2.2.2. Влияние хелатирующего лиганда и металла на эффективность выделения и очистки Нізб-содержащей ОРН 109
3.2.2.3. Выделение OPH-His6 114
3.3. Физико-химические свойства генетически-модифицированных аналогов ОРН 116
3.3.1. рН-зависимость каталитической активности ОРН, His6-OPH, OPH-His6 116
3.3.2. Зависимость каталитической активности ОРН, His6-OPH, OPH-His6 от температурных условий проведения ферментативной реакции 118
3.3.3. Исследование каталитических характеристик ОРН, His6-OPH, OPH-His6 118
3.3.4. Влияние ионов металла на каталитическую активность ОРН, His6-OPH, OPH-His6 124
3.3.5. Гидролиз БОВ под действием ОРН и His6-OPH 131
3.4. Получение и свойства фтор-тирозинсодержащего аналога органофосфатгидролазы 133
3.4.1. Влияние З-F-Tyr на кинетику роста клеток-продуцентов модифицированного белка His6-OPH 133
3.4.2. Выделение и очистка модифицированного белка F-Tyr-Hise-OPH 134
3.4.3. Свойства F-Tyr His6-OPH 137
Выводы 145
Список литературы
- Кинетические характеристики и субстратная специфичность ОРН
- Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН
- Получение высокоэффективной системы биосинтеза рекомбинантной ОРН
- Разработка высокоэффективной системы биосинтеза аналогов ОРН в клетках Е. coli, их выделение и очистка
Введение к работе
Современные методы ведения сельского хозяйства в экономически развитых странах мира и в России предполагают обязательное использование пестицидов в режиме, строго регламентируемом ГОСТами (4-6 кг/га) [1]. Более 40% от общего объема применяемых в мире пестицидов составляют фосфорорганические соединения (ФОС), которые представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновых кислот, а также их производные (табл. 1, стр.11). Большинство ФОС имеют относительно низкую водорастворимость, способны аккумулироваться в почве и сточных водах, а естественное разложение ФОС протекает со сравнительно низкими скоростями. Все это приводит к накоплению ФО-пестицидов в различных сельскохозяйственных продуктах. Даже после жесткой технологической обработки и длительных сроков хранения продукты питания все еще содержат ФОС [2, 3]. Более того, ФОС находят даже в текстильных изделиях, выработанных из натурального хлопкового сырья, собранного с обработанных пестицидами полей [4].
ФОС также находят широкое применение в качестве бытовых инсектицидов для уничтожения муравьев, тараканов и других насекомых в жилищах, на приусадебных участках, а также с целью защиты домашних и сельскохозяйственных животных от различных паразитов (клещей, блох и т.п.), следствием чего является обнаружение ФОС в домашней пыли [5, 6]. Именно этот факт определяет отношение к ФОС, как к серьезнейшему антропогенному фактору [7].
Следует также заметить, что к рассматриваемой группе веществ, состоящей преимущественно из пестицидов, относятся также и фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) (табл. 1), запасы которых должны быть уничтожены, согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия [8-10].
На современном этапе развития человечества, существует и приобретает определенную реальность угроза химического терроризма, предполагающего использование не только химического оружия массового поражения, но и его аналогов, в частности ФО-пестицидов [11]. В связи с этим поиск эффективных путей деградации ФОС становится чрезвычайно актуальной проблемой.
Существует несколько путей проникновение ФОС в организм человека и животных - диффузия через кожу, ингаляторное и пероральное проникновение с водой и продуктами питания. Все ФОС являются ингибиторами холинэстераз, следствием этого является накопление холина в синапсах центральной и периферической нервной системы, оказывающее нервно-паралитическое воздействие. Даже в незначительных количествах ФОС способны вызывать у человека острые отравления вплоть до летального исхода [12, 13].
Показано, что ФОС оказывает мутагенное воздействие на млекопитающих. Так, у жителей территорий, прилегающих к сельскохозяйственным зонам, подвергавшимся когда-либо обработке ФОС, и у людей, которые были задействованы в производстве и применении ФОС [14-16], возникают хромосомные аберрации лимфоцитов [17].
Согласно экономическим расчетам, отказ от применения столь токсичных для человеческого организма соединений неизбежно привел бы к сокращению всего урожая в мире на 50% и вызвал бы рост цен на сельскохозяйственную продукцию в 4-5 раз [18]. Невозможность отказа от применения ФОС приводит к тому, что актуальнейшей экологической и научной проблемой становится их обнаружение и детоксикация. Решением этой проблемы занимаются ученые многих стран мира на протяжении нескольких десятков лет, но именно в последние пять лет интенсивность проводимых исследований резко увеличилась. На сегодняшний день известно о существовании национальных экологических и научных программ [19-22], предусматривающих колоссальные капиталовложения для решения проблем, связанных с применением ФОС и уничтожением ранее произведенных запасов, в европейских странах, преимущественно занимающихся сельским хозяйством (Италии, Греции, Испании, Польше и др.). Мониторинг содержания ФО-пестицидов в продуктах сельского хозяйства, водах рек и муниципальных отходах [23-25] - одна из основных задач таких программ. Аналогичные исследования проводятся также в США [26,27]. Китае [28] и Японии [29].
В последнее время основное внимание уделяется проведению работ по детоксикации различных ФОС с помощью биологических систем, а значит, без риска применения жестких химических методов деградации, отрицательно влияющих на состояние окружающей среды. Как правило, «мягкие» условия включают неагрессивные среды и температурный режим в пределах 25-50°С. В связи с этим наблюдается рост интереса к ферментам, способным катализировать гидролиз ФОС с образованием продуктов, во-первых, менее токсичных, чем исходные субстраты, и, во-вторых, определение которых проще, чем гидролизуемых ФОС. К числу таких ферментов относится органофосфатгидролаза (ОРН), которая катализирует гидролиз фосфотриэфирных связей широкого ряда фосфорорганических субстратов.
Уничтожение ФОВ проводится согласно утвержденному методу [30], при этом применение фермента возможно на стадии дезактивации остаточных количеств ФОВ в составе реакционных масс, а также для обработки загрязненных территорий и объектов (помещений, оборудования, реакторов, транспортных средств и тары для хранения), задействованных в технологии деградации ФОВ.
Основные генно-инженерные работы с ОРН направлены на интенсивное изучение структуры активного центра фермента, а также на изменение субстратной специфичности фермента и увеличение сродства к соединениям, представляющим собой БОВ. Природные штаммы, обладающие ОРН-активностью, не могут быть рассмотрены в качестве продуцентов данного фермента ввиду крайне низких уровней его синтеза в клетках (0,0085 мг белка из 1 г клеток). В связи с этим создание новых систем для биосинтеза ОРН в клетках Е. coli является весьма актуальным.
Биотехнологическое применение ОРН предполагает использование эффективных способов вьщеления и очистки фермента. Современое решение такой задачи предполагает модификацию ферментов путем введения аминокислотных последовательностей в молекулы белков для последующей иммобилизации на металл-хелатирующих хроматографических носителях. Исследование свойств гибридных белков является необходимым условием для решения фундаментальных задач изучения взаимосвязи структуры белковой молекулы со свойствами, и так как в связи с тем, что гибридные партнеры могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на свойства целевых белков, подвергнутых модификации. Кроме того, тип и характеристика носителя, используемого для хроматографического вьщеления гибридных белков, определяет скорость и качество процесса. Макропористые носители на основе криогелей полиакриламида (криоПААГ) являются новым словом в хроматографии, поскольку они формуются в виде монолитного блока, что позволяет получать желаемые размеры и формы носителя. Макропористая матрица обеспечивает высокие скорости потока элюента и гарантирует простоту выполнения самой процедуры выделения и очистки белка. Использование такого подхода для разработки способов очистки ОРН несомненно актуально и может иметь практическую значимость для биотехнологии.
Таким образом, разработка высокоэффективных способов получения ОРН или ее аналогов в клетках Е. coli является актуальной для применения фермента на практике, решения задач детекции ФОС в различных объектах in situ.
Кинетические характеристики и субстратная специфичность ОРН
Установлено [81], что реакция гидролиза ФО-соединений, катализируемая ОРН, протекает по 8к2-механизму с инверсией конфигурации атома фосфора.
Исследования ОРН методом рентгеноструктурного анализа [82-85] показали, что шесть остатков His находятся непосредственно вблизи активного центра фермента, а четыре из этих остатков (His-55, His-57, His-201 и His-230) являются лигандами ионов металла в активном центре. Кроме того, анализ апо- и холо-форм фермента выявил значительные различия в их структурах. Структура активного центра Cd2+/Cd2+-замещенного фермента приведена на рис. 3 [86].
Два иона металла связаны друг с другом посредством карбамилированного остатка Lys-169. В апо-форме фермента остаток Lys-169 не модифицирован. Авторами было продемонстрировано [87], что высокая концентрация бикарбоната ускоряет процесс формирования активного центра фермента при переходе апо-формы в холо-форму в присутствии ионов металла. При помощи С ЯМР-спектроскопии было доказано, что в образовании карбамилированного остатка Lys принимает участие диоксид углерода (рис. 3).
Вторым мостиковым лигандом между ионами металла служит молекула воды. Координационная сфера одного из ионов металла имеет конфигурацию тригональной би пирамиды, а второго - октаэдрическую. Расстояние между ионами металла в активном центре составляет 3.8 А. Остаток His-254, не образующий координационной связи с ионами металлов, находится на расстоянии 7 А от активного центра.
Важную роль в формировании активного центра ОРН, как оказалось, играет также остаток Asp-253 [83] (на рис. 4 не представлен), который образует водородную связь с имидазолом остатка His-55 в апо-форме фермента. В холо-форме карбоксильная группа Asp-253 образует водородную связь с остатком His-230, способствуя его оптимальной пространственной ориентации. Замена этого остатка Asp на Asn приводит к падению величины kcat в 1000 раз.
Помимо функциональных групп фермента, принимающих непосредственное участие в катализе, предполагается существование трех гидрофобных участков, влияющих на связывание субстрата и определяющих, таким образом, специфичность фермента [64, 80]. Расположение аминокислотных остатков, образующих микроокружение активного центра, представлено на рис. 4 [88-90]. Кроме того, на рис. 4 отражена предполагаемая ориентация субстрата в активном центре ОРН.
Метилбензильная группа негидролизуемого аналога параоксона располагается в полости, образуемой остатками His-257, Leu-271, Phe-306 и Met-317. Одна из этоксигрупп взаимодействует с группой, образованной Тф-131, Ile-106, Leu-303, Phe-306 и Ser-308, другая - с областью, содержащей Тф-131, Phe-132, Leu-271, Phe-306 и Tyr-3096 при этом роль остатка Gly-60 точно не установлена, a His-254 участвует в поддержании активной конформации фермента. Авторы высказали справедливое предположение о том, что первая из описанных групп более приспособлена к взаимодействию с большими и разветвленными гидрофобными радикалами, в то время как для двух других групп предпочтительны этокси-заместители у фосфорного центра. Поскольку вклад электростатических взаимодействий в связывание триэфиров фосфорной кислоты в активном центре фермента минимален, то, возможно, именно эти две группы аминокислотных остатков определяют специфичность и стереоселективность ОРН.
Кинетические исследования закономерностей взаимодействия органических аминов, вводимых в реакционную среду, с функциональными группами в активном центре фермента позволили прояснить роль ионов металла в катализе, осуществляемом ОРН [91]. Так, исследование влияния ряда аминов с различной геометрией и основностью на скорость ферментативного гидролиза параоксона показало, что по своему влиянию на ОРН амины могут быть разделены на две группы: 1) активирующие ОРН; 2) ингибирующие фермент или не оказывающие существенного воздействия на его каталитическую активность. Было установлено, что в интервале рН-оптимума ОРН (рН 8,5-9,5) эффект активации фермента пропорционален концентрации именно свободной, а не протонированной формы амина. Также было показано, что активирующее действие аминов на ОРН определяется как величиной рКа амина (уменьшается в ряду пиперидин диизопропиламин диэтиламин), так и его структурными особенностями, а именно, меньшее активирующее действие оказывают третичные амины (триэтиламин) и амины с разветвленным радикалом (трет-бутиламин). Установлено, что активация ОРН аминами носит неконкурентный характер [91].
Согласно предложенному механизму действия ОРН [91] (рис. 5), субстрат взаимодействует с ионом Col, вытесняя мостиковую молекулу воды. Именно с этим процессом связано резкое падение активности ОРН при рН выше 9,0. Субстрат (параоксон) способен вытеснить молекулу воды из координационной сферы иона Со , но не способен заместить гидроксид-ион при высоких значениях рН (более 11,0). При связывании амина с ионом Со2 в координационной сфере иона Со происходит замещение более слабого электронодонора - молекулы воды, на сильный донор электронов - амин. При этом увеличивается электронная плотность на ионе Со , что, в свою очередь, приводит к увеличению нуклеофильности атакующего ОН/НгО-лиганда. Если атакующей частицей в реакции является молекула воды, то присутствие амина в координационной сфере иона Со может способствовать ее депротонированию, то есть образованию сильного нуклеофила — гидроксид-иона. В наибольшей степени данный эффект проявляется, по всей видимости, в том случае, когда амин замещает молекулу воды, находящуюся в /ира//с-положении по отношению к атакующему аква/гидроксо-лиганду. Известно, что лиганд, находящийся в траис-положении по отношению к уходящему лиганду, оказывает значительно более сильное влияние на скорость его элиминирования из комплекса, чем группы, находящиеся в і/ис-положениях. Величина транс-эффекта лиганда уменьшается в следующем порядке: ЫЯз ОН НгО. Координация молекулы амина в траке-положении приводит к тому, что возрастает нуклеофильность «уходящего» аква-лиганда, кроме того, он становится более лабильным и легче вступает в реакции замещения [88].
Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН
Клетки из 10 мл ночной культуры осаждали центрифугированием при 4 тыс. об/мин в течение 8 мин согласно известной методике [217]. Осадок ресуспендировали в 1,5 мл буфера для кипячения, содержащего 5 мкл РНКазы и 3 мг лизоцима. Вьщерживали в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего переносили в пробирки объемом 2,2 мл и помещали в кипящую водяную баню на 1 мин 15 сек, сразу после этого помещали пробирки на 2 минуты в лед. Затем центрифугировали 15 мин при 10 тыс. об/мин. Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли равный объем изопропанола, перемешивали и снова центрифугировали 10 мин при 10 тыс. об/мин. Супернатант сливали, а осадок промывали 0,5 мл 70% этанола, центрифугировали 5 мин при 10 тыс. об/мин. Осадок высушивали и растворяли в 50 мкл дистиллированной воды. Для анализа выделенной плазмиды использовали электрофорез в агарозном геле с соответствующими маркерами молекулярного веса.
Рестрикцию проводили в реакционной смеси объемом 10 мкл следующего состава: 1 мкл плазмиды, 1 мкл буфера для рестрикции (10 - кратного), 0,5 - 0,8 мкл ферментов-рестриктаз (5 ед/мкл) и тридистиллированной воды до 10 мкл. Полученную смесь помещали на 1 ч в термостат на 37С.
Разделение фрагментов, полученных после рестрикции, проводили электрофоретически в агарозном геле. В пробирку с рестриктной смесью добавляли 1,5 мкл 10-кратной смеси красителей (Bromophenol blue, Xylene Cyanol), служащих маркерами, для самых маленьких фрагментов ДНК («500 пар нуклеотидов). В лунки агарозного геля вносили 10 мкл образца. Включали ток на 40-50 мин. Гель прокрашивали бромистым этидием, благодаря чему прокрашенные полосы ДНК просматриваются в УФ свете. Выше и ниже соответсвующей молекулярной массе полосы в геле делали надрезы, в которые вставляли полоски DEAE NA - 45 мембраны. Гель с вставленными мембранами помещали в электрическое поле на 6 мин, после чего проверяли полноту перенесения ДНК на мембрану. Элюцию ДНК с мембраны проводили в 100 мкл буфера hs при 68С в течение 45 мин. ДНК осаждали из раствора 2,5-кратным объемом 96% этанола. После чего ДНК отделяли центрифугированием при 9000g в течение 10 минут. Промывали осадок половинным объемом, использованным для осаждения, 70% этанола. Центрифугировали при 9000 g 6 мин. Максимально удаляли супернатант, осадок подсушивали до полного удаления спирта. Высушенный осадок растворяли тридистиллированной водой до нужной концентрации.
Лигирование фрагментов ДНК проводили в объеме 20 мкл при помощи ДНК-лигазы фага Т4 в буфере для лигирования. В реакционную смесь добавляли 20 - 100 нг лианеризованного вектора, 4-х кратный мольный избыток по отношению к вектору клонируемого фрагмента ДНК и 1 мкл ДНК-лигазы. Реакцию осуществляли при 12С в течение 4 ч при лигировании по липким концам, сразу после чего аликвотой лигазной смеси трансформировали клетки.
Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по методу Сенгера с модификациями [220]. Плазмидную ДНК (объемом не более 8 мкл) денатурировали добавлением 2 мкл 2 М NaOH. Затем добавляли 3 мкл З М ацетата натрия (рН 4,8) и 7 мкл воды для нейтрализации щелочи. ДНК осаждали тройным объемом 96% этанола (20 мин, -70С). Затем центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 10 мкл воды. К полученному раствору добавляли по 2 мкл буфера для отжига и праймер в количестве 2,5 пмоль. Отжиг проводили в течение 20 мин при 37С и 10 мин при комнатной температуре. К комплексу матрицы с праймером добавляли 1 мкл [а-Р33] АТФ (10 мкКи/мкл), 3 мкл смеси для мечения и 2 мкл разбавленной до концентрации 1,5 ед/мкл ДНК-полимеразы фага Т7. Достраивание второй цепи проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении этого времени раскапывали по 4 мкл смеси по пробиркам, содержащим по 2,5 мкл предварительно прогретых при 37 С терминирующих смесей, и инкубировали 5 мин при 37С. Реакцию останавливали добавлением 4 мкл стоп-раствора. Перед нанесением на гель образцы прогревали при 75С 2 мин.
После электрофореза гели фиксировали в растворе 10% уксусной кислоты, 2% глицерина, высушивали при температуре 90С и авторадиографировали в течение ночи.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в следующем режиме: денатурация - 1 мин., 94С; отжиг - 1 мин., 55С; достройка - 1 мин 30 сек, 72С; количество циклов - 35.
При подготовке вектора к клонированию pTrcES обработали рестриктазами Clal и Hindlll. Фрагмент СІаМНіпсЖІ размером 4232 п.о. выдели переносом из 0,8 % агарозного геля на DEAE-мембрану.
После чего ПЦР фрагменты, длинной 1027 п.о., были выделены и обработаны теми же рестриктазами Clal и Hindlll, и полученный фрагмент 1011 п.о. выделен из 1,2 % агарозного геля. Сборка вектора проводилась путем совместного лигирования двух полученных фрагментов с Т4-лигазой в течение 3 часов при 12С. Клетки E.coli XL blue были трансформированы полученной лигазной сшивкой. Одновременно, в качестве контроля провели лигирование вектора pTrcES/Clal/Hindlll самого на себя. Для анализа было отобрано 12 клонов. ПЦР анализ клонов с праймерами FORrc и SEQ-1 выявили два положительных клона. Оба клона были пересеяны в 50 мл LB среды с ампициллином, и после подращивания в течение 16-18 часов при 37С плазмидные ДНК были выделены щелочным методом, после чего был проведен рестриктный анализ с использованием рестриктаз Clal и Hindlll.
Окончательная структура полученной рекомбинантной ДНК pTES-OPH была подтверждена определением нуклеотидиой последовательности в области встроенного гена, для чего было проведено секвенирование созданной плазмидной ДНК с праймерами FORrc и TRC-2. Оба клона были полностью идентичны, поэтому дальнейшие исследования проводили только с одним из них.
Получение высокоэффективной системы биосинтеза рекомбинантной ОРН
Из литературы [47] было известно, что ген opd может быть выделен из клеток Pseudomonas и Flavobacterium. Следующие штаммы бактерий были приобретены в ВКМ:
Pseudomonas sp. (В-2172, В-1330, В-1298, В-1064, В-877, В-559, В-549); Pseudomonasputida (В-973, В-901, В-899, В-869, В-550, В-2182, В-1559, В-1461, В-1301, В-1292); Pseudomonas diminuta В-1297; Flavobacterium sp. В-1338; Flavobacterum resinovorum B-l 172; Flavobacterium aquatile B-l 173; Flavobacterium johnsoniae (B-l 171, B-1399).
Штаммы бактерий выращивали на агаризованной среде М9, содержащей 1 мМ параоксона. Скрининг штаммов по ОРН активности выявил ее наличие в штамме Pseudomonas diminuta ВКМ В-1297, вокруг колоний которого наблюдался желтый ареол, вызванный накоплением п-нитрофенола, образованного в результате гидролиза параоксона клетками.
Далее было осуществлено выделение гена opd. Для этого была выделена хромосомная ДНК клеток и проведена ее амплификация с использованием генспецифических праймеров FOR-Cla и REV-Hind. Праймер FOR-Cla представляет собой 27-звенный олигонуклеотид, в состав которого входят сайт узнавания рестриктазы Cla I, стартовый ATG-кодон и 13 нуклеотидов 5 -области ДНК ОРН. Праймер REV-Hind представляет собой 29-звенный олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания рестриктазы Hind III, а также последовательность, комплементарную стоп-кодону гена ОРН и прилегающим 15 нуклеотидам кодирующей области.
В качестве экспрессионного вектора была использована плазмида pTrcES, содержащая несколько основных элементов, необходимых для эффективной экспрессии: сильный индуцибельный trc-промотор Е. coli, синтетический усилитель трансляции TES гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген Ыа Р-лактамазы, определяющий устойчивость клеток, трансформированных плазмидой pTrcES, к ампициллину и участок ori инициации репликации. Клонирование проводили как описано вп.2.2.13.
Исследование эффективности полученной плазмиды pTES-OPH для биосинтеза ОРН было проведено в штаммах Е. coli W3110 и DH5a. Данные штаммы были выбраны для исследования в связи с тем, что они гарантированно обеспечивают высокий уровень биосинтеза различных белков [224]. Ночные культуры этих клеток, трансформированных полученной плазмидой pTES-OPH, выращивали на среде LB при 37С. В качестве контроля использовали клетки, не трансформированные плазмидой. После индукции ИПТГ до конечной концентрации в среде 1 мМ выращивали клетки в течение 4 ч. Наличие синтезируемого белка в клетках Е. coli контролировали с помощью электрофПри столь высоких уровнях экспрессии белков в клетках, которые наблюдались в случае штамма Е. coli W3110/pTES-ОРН, следовало ожидать высокую вероятность появления агрегатов белка с образованием телец включения. В связи с этим была исследована растворимость синтезируемого белка во вновь созданных экспрессионных системах. Культивирование клеток проводили при 37С.
Согласно данным рис. 11 количество ОРН, синтезированной клетками Е. coli W3110, составляло 45 - 50% от всего клеточного белка, а клетками Е. coli DH5a - 15%. Однако, при этом доля растворимой формы ОРН от общего количества рекомбинантного фермента составляла 20 - 25 % в штамме DH5a, тогда как в штамме W3110 - 5 %. Таким образом, в клетках W3110 практически 95% ОРН синтезировалось в виде телец включения.
SDS-PAGE электрофореграмма суммарных (с), растворимых (р) и нерастворимых (н) фракций клеточных лизатов штаммов Е. coli DH5a (1) и W3110 (2), трансформированных плазмидой pTES-OPH, выращенных при 37С. М - белковые маркеры молекулярного веса (14,4; 20,1; 30,0; 43,0; 67,0; 94,0 кДа), о - клетки не содержащие плазмиду.
Из полученных результатов следует, что штамм Е. coli W3110 может быть использован для высокоэффективной наработки ОРН в виде телец включения с последующей солюбилизацией и ренатурацией белка. Штамм Е. coli DH5a, напротив, перспективен для биосинтеза ОРН в растворимом виде.
Поскольку большая часть синтезируемого фермента оказалась в виде телец включения, и, следовательно, в неактивной форме, то были предприняты попытки для увеличения доли растворимого белка.
Из литературных данных известно, что температура культивирования и концентрация индуктора, вносимая в среду, могут оказывать существенное влияние на соотношение растворимой и нерастворимой фракций синтезируемого белка [139-141]. Было исследовано влияние температуры культивирования на синтез ОРН в клетках Е. coli W3110 и DH5a, для этого температура была снижена до 30С и проведено сравнение результатов с ранее полученными при 37С. Снижение температуры теоретически должно было привести к снижению скорости сворачивания синтезируемого фермента и, соответственно, доли правильно свернутого целевого белка в растворимой форме. Клетки Е. coli W3110 и DH5a трансформировали плазмидой pTES-OPH. В качестве контроля исследовали клетки, не содержащие плазмиды. Для оценки эффективности использования индуктора часть клеток, трансформированных плазмидой, культивировалась без добавления ИПТГ. Основные условия эксперимента, кроме температуры, были такими же, как в п. 3.1.1.2.1.
В отсутствие индуктора в обоих штаммах наблюдался базальный синтез ОРН, который составлял не более 0,1-0,3 % от суммарного клеточного белка. Добавление индуктора (1 мМ) приводило к увеличению синтеза белка в 8-10 раз в случае клеток Е. coli W3110 и в 3 раза в случае клеток Е. coli DH5a (рис. 12). Следует также отметить, что снижение температуры культивирования с 37С до 30С приводило лишь к незначительному увеличению доли растворимого белка: в случае клеток Е. coli DH5a доля растворимой ОРН составляла 30% от суммарного количества синтезированного фермента, а в клетках Е. coli W3110 - 10%. Сравнительный анализ влияния температуры культивирования на различные характеристики биосинтеза ОРН в обоих штаммах Е. coli приведены в табл. 6, из которой следует, что при снижении температуры культивирования до 30С доля растворимого фермента увеличивалась в 1,5 - 2 раза в зависимости от штамма.оретического анализа суммарных клеточных белков в SDS-PAGE. Результаты исследований представлены на рис.10.
Разработка высокоэффективной системы биосинтеза аналогов ОРН в клетках Е. coli, их выделение и очистка
Для сравнительного исследования уровня экспрессии полученных генетических конструкций в разных штаммах клеткок Е. coli были выбраны штаммы DH5a, W3110 и SG13009[pREP4]. Выбор именно этих штаммов был обусловлен тем, что первые два штамма были ранее использованы для биосинтеза немодифицированной ОРН, а штамм Е. coli SG13009[pREP4] обычно используется для биосинтеза рекомбинантных белков, содержащих Нізб-последовательность [174].
Было проверено влияние концентрации индуктора в диапазоне от 0,25 до 0,75 мМ на уровень биосинтеза Hiss-OPH и OPH-His6 в клетках Е. coli DH5a, W3110 и SG13009[pREP4] при 30С (рис. 23).
Из данных электрофоретического анализа белкового состава клеток следовало, что наибольший уровень экспрессии His6-OPH (40-45% от суммарного клеточного белка) и OPH-Hise (до 30%) наблюдался в клетках Е. coli SG13009[pREP4] (рис.23 а). При этом уровень биосинтеза His6-OPH был в 4 раза выше, чем уровень синтеза того же белка в клетках Е. coli DH5a. При использовании клеток Е. coli W3110 также наблюдался высокий уровень синтеза обоих белков. Было отмечено небольшое снижение уровня синтеза модифицированных аналогов ОРН по сравнению немодифицированной ОРН в тех же штаммах и аналогичных условиях культивирования клеток.
Согласно представленным данным, начало стационарной фазы роста наблюдалось почти у всех исследуемых вариантов клеток, начиная с 18-23 ч культивирования. Из полученных данных следует, что увеличение концентрации индуктора в пределах исследованного интервала не оказывало существенного влияния на скорость роста трансформированных клеток, но при этом уровень активности клеток при разных концентрациях ИПТГ варьировалась. Максимальный уровень накопления биомассы к этому моменту времени был отмечен у клеток Е. coli DH5a. Причем, это было характерно для клеток, трансформированных обеими полученными плазмидами.
Линеаризация экспоненциальных фаз роста клеток различных штаммов и проведение анализа полных кривых роста клеток позволили определить кинетические характеристики процесса культивирования клеток Е. coli штаммов W3110, DH5a и SG13009[pREP4] с различной концентрацией индуктора в среде (табл. 12). При проведении расчетов исходили из того, что изучалась закрытая система, в которой существенные для роста компоненты в процессе роста не поступали в систему дополнительно и не покидали ее в течение всего времени культивирования.
Из полученных данных видно, что для всех исследованных штаммов клеток наилучшие характеристики (удельная скорость роста) наблюдаются при конечной концентрации индуктора в среде 0,25 мМ.
Исследование уровня ферментативной активности клеток Е. coli разных штаммов, трансформированных генетическими конструкциями pTES-His6-OPH (рис.23 а-в) и pTES-OPH-His6 (рис. 23 г-е), выявило различия в кинетике накопления активности в клетках и в достигаемом максимальном удельном значении активности клеток в процессе их культивирования. Было установлено, что кинетические характеристики биосинтеза активных растворимых модифицированных аналогов ОРН зависят от локализации Hise-последовательности в молекуле белка.
Максимальный выход His6-OPH в растворимой форме был отмечен на 11 ч культивирования клеток после индукции при концентрации ИПТГ 0,25 мМ для штаммов Е. coli W3110 (начальный этапе роста), на 19 ч (к концу логарифмической фазы роста) для штамма Е. coli DH5a и на 21 ч (к середине логарифмической фазы роста) для штамма SG13009[pREP4]. При этом для обеспечения максимального выхода синтезируемого белка OPH-His6 в растворимой форме оптимальным оказался 9-й ч культивирования клеток после индукции биосинтеза для штаммов Е. coli W3110 и SG13009[pREP4], и 18 ч - для штамма Е. coli DH5a.
Дальнейший процесс культивирования клеток характеризовался лишь снижением их удельной активности (табл. 12).
Таким образом, кинетика роста клеток Е. coli DH5a и накопление активности практически не изменялись в зависимости от синтезируемого гибридного белка. В случае штаммов Е. coli W3110 и SG13009[pREP4] при биосинтезе белка, содержащего His6-последовательность на С-конце молекулы, происходил сдвиг времени достижения максимальной активности в область меньших времен культивирования. Максимальный уровень удельной ферментативной активности OPH-His6 был отмечен для клеток Е. coli DH5a и SG13009[pREP4] (рис. 23а и 236).
Анализ общей концентрации белка в клетках и электрофоретический анализ соотношения в клетках растворимой и нерастворимой фракций белка показал, что снижение удельной активности клеток с увеличением длительности культивирования сопровождается увеличением доли нерастворимой фракции при нарастающей удельной концентрации синтезируемого белка в клетках (данные не показаны).
Такие различия в параметрах роста клеток и биосинтезе ферментов могут быть связаны как с особенностями самих биосинтетических аппаратов клеток различных штаммов, так и с термодинамическими параметрами процессов биосинтеза и фолдинга гибридных белков, термодинамической стабильностью синтезируемых белковых интермедиатов.
Уровень биосинтеза белка к клетках Е. coli DH5a невысокий, т.е. скорость синтеза целевого белка также невысока, следовательно, нагрузка на биосинтетический аппарат клетки небольшая. Это, по-видимому, и определило слабую зависимость роста штамма и растворимости синтезируемого белка от типа плазмиды, которой трансформированы клетки, а также от концентрации индуктора в среде. В случае штаммов Е. coli W3110 и SG13009[pREP4], обладающих очень высокими уровнями синтеза целевых белков, эффективность процесса биосинтеза оказалась сильно зависимой от различных факторов. Так увеличение концентрации индуктора в среде приводило, с одной стороны, к увеличению скорости биосинтеза целевого белка, а с другой стороны, синтезированный белок мог не успевать проходить последующий процессинг, правильно фолдироваться, что, вероятно, приводило к его агрегации и образованию телец включения. В случае использования высокоэффективных штаммов для продукции гибридных белков обычно наблюдается конкуренция между процессами трансляции и фолдинга белка, и на первое место выходит именно термодинамика процесса сворачивания белка, которая в свою очередь зависит от его первичной структуры. Из полученных в работе данных следует, что локализация Нівб-последовательности на С-конце молекулы ОРН приводила к снижению скорости фолдинга данного белка, тогда как ее присутствие на N-конце не оказывало столь выраженного влияния.
Таким образом, штамм SG13009[pREP4] обеспечил наилучшие характеристики биосинтеза His6-OPH, а штамм DH5a оказался лучшим для биосинтеза OPH-His6 по всем параметрам.
