Содержание к диссертации
Список принятых сокращений и обозначений 4
Введение п .. 5
Глава 1. Литературный обзор » 7
1.1. Ядра р-лактамных антибиотиков 7
1.1.1. Р-лактамные антибиотики - представители класса антиинфекционных
препаратов 7
Ядра р-лактамных антибиотиков 10
Физикохимические свойства ядер Р-лактамных антибиотиков 11
Основные методы получения ядер антибиотиков 13
1.2. Пенициллинацилаза - основной фермент химии антибиотиков 17
Первый биокаталитический промышленный процесс 17
Пенициллинацилаза - представитель семейства Ntn-гидролаз 18
Субстратная специфичность пенициллинацилаз 20
1.3. Получение ядер антибиотиков трансформацией пенициллинов и цефалоспоринов
22
1.3.1. Термодинамика гидролиза пенициллинов и цефалоспоринов 22
Кинетические закономерности ферментативного гидролиза р-лактамных антибиотиков 25
Биокаталитическая трансформация пенициллинов и цефалоспоринов в промышленности 26
1.4. Современные подходы к повышению производительности стадии
биотрансформации антибиотиков .29
Глава 2. Экспериментальная часть 31
Материалы 31
Методы 32
Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы 32
Определение активности пенициллинацилазы по гидролизу NIPAB 32
Определение каталитических параметров гидролиза NIPАВ в воде 32
Определение каталитических параметров гидролиза NIPAB в DjO 33
Анализ компонентов реакции гидролиза антибиотиков в двухфазных системах 'вода-бутилацетат' 33
Ферментативный гидролиз в двухфазных системах 33
2.2.7. Проведение реакций гидролиза антибиотиков в двухфазных системах в
условиях, близких к равновесию 34
Очистка L.D-PGCN-HCI 34
Синтез изопропилового эфира фенилглицина .....34
Синтез амида триптофана 35
Синтез изопропиламида фенилглицина 35
Анализ компонентов реакционной смеси при получении ядер антибиотиков ацильным переносом 36
2.2.13. Получение 6-АРА ферментативным переносом с PenG или PenV на амиды
аминокислот 36
2.2.14. Получение 7-ADCA ферментативным переносом с CephG на амиды
аминокислот 37
2.2.15. Получение 6-АРА ферментативным переносом с PenG на эфиры аминокислот
37
2.2.16. Получение 6-АРА ферментативным переносом на с PenG на нитрилы
аминокислот 38
Определение рК аминогрупп производных аминокислот 38
Определение растворимости ацилированных производных аминокислот 38
2.2.19. Определение термодинамических констант синтеза фенилацетильных
производных аминокислот 39
Синтез Petuj-L-PGCNH* 39
Синтез CephG'-L-PGCNH+ 40
Получение 6-АРА, исходя из PenG'-L-PGCNH* 40
Получение 7-ADCA, исходя из CephG"-L-PGCNH+ 40
Анализ компонентов реакционной смеси при конденсации фенилуксусной кислоты с фенилглицинонитрилом 41
Анализ оптической чистоты фенилглицинонитрила при его конденсации с фенилуксусной кислотой 41
2.2.26. Ферментативная конденсация фенилуксусной кислоты с
фенилглицинонитрилом 41
2.2.27. Синтез ионных комплексов антибиотиков и производных аминокислот 42
Глава 3. Результаты и их обсуждение 43
3.1. Ферментативный гидролиз В-лактамных антибиотиков в кислой среде в
двухфазных системах «водный раствор - несмешивающийся с водой органический
растворитель» .„ „ 43
Введение 43
3.1.1. Теоретический анализ модели гидролиза антибиотиков в кислой среде в
двухфазных системах 45
Термодинамика гидролиза в двухфазных системах 45
Факторы, влияющие на выход гидролиза 49
3.1.2. Экспериментальное исследование гидролиза антибиотиков в кислой среде в
двухфазных системах 52
3.1.2.1. Особенности гидролиза антибиотиков в кислой среде в двухфазных системах
52
Экспериментальная зависимость выхода ядра антибиотика от рН 53
Зависимость выхода от начальной концентрации антибиотика 54
Динамическое пересыщение раствора ядра антибиотика в ходе реакции 55
Состояние равновесия при гидролизе антибиотиков в двухфазной системе... 56
3.1.2.6. Соответствие между термодинамически равновесным и кинетически
достижимым выходом в исследуемых системах 58
3.2. Катализ пенициллинацилазой в кислых средах 60
Введение 60
3.2.1. рН-зависимость каталитических параметров гидролиза NIPАВ..... 61
3.3. Получение ядер антибиотиков аиильным переносом на внешний иуклеофил ....70
Введение 70
3.3.1. Идея метода 71
3.3.2 Критерии эффективности получения ядер антибиотиков ацильным переносом 73
3.3.3. Реализация ацильного переноса: термодинамически и кинетически
контролируемые режимы 74
Процессы, сопряженные с ацильным переносом 76
Математическая модель термодинамики ацильного переноса..... 78
Качественный анализ термодинамики образования амидной связи в рамках синтетических потенциалов 84
Величины синтетических потенциалов 88
3.3.4.5. Количественный анализ термодинамики получения ядер антибиотиков
ацильным переносом 91
3.5. Синтетические потенциалы N-фенилацетильных производных амидов, эфиров и
нитрилов аминокислот. 98
3.3.6. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер
антибиотиков ацильным переносом: эфиры аминокислот 105
Бензиловый эфир аланина 106
Метиловый эфир гистидина 106
Метиловый эфир фенилглицина 106
Метиловый эфир триптофана 108
Этиловый эфир фенилаланина 111
Изопропиловый эфир L-фенилглицина 113
3.3.7. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер
антибиотиков ацильным переносом: амиды аминокислот 117
Амид фенилглицина 118
Амид триптофана 120
N-изопропиламид фенилглицина.... 122
3.3.8. Использование различных классов нуклеофилов для получения ядер
антибиотиков ацильным переносом: нитрилы аминокислот 125
Нитрил фенилглицина........ 126
Нитрил фенилаланина 136
3.4. Комплексообразованне между З-лактамными антибиотиками и производными
аминокислот „ 144
Введение 144
Определение термодинамических параметров комплексообразования из экспериментальных данных 145
Влияние комплексообразования между антибиотиком и нуклеофилом на термодинамику ацильного переноса 148
3.4.3. Энантиоселективность комплексообразования 153
3.4.4 Использование комплексообразования 158
3.5. Разделение рацемата фенилглицинонитпила ферментативным ацилированием в
водной среде 161
Введение 161
3.5.1. Эффективность ферментативного прямого ацилирования 162
3.5.2. Перспективы использования разделения аминонитрилов прямым
ацилированием 165
Выводы 167
Список литературы.... 168
Список принятых сокращений и обозначений
К л константа синтеза
К "^ кажущаяся константа синтеза
К константа кислотности
К р константа распределения
е.е. энантиомерный избыток
Введение к работе
Актуальность темы исследования. По всеобщим прогнозам антибиотики будут активно востребованы медициной по крайней мере еще несколько десятков лет, что ставит новые требования к эффективности и качеству их производства. Использование ферментов, пеницштлинацилаз, для получения ядер Р-лактамных антибиотиков гидролизом пенициллинов и цефалоспоринов стало в свое время первым промышленным биокаталитическим процессом, открывшим новые перспективы развития фармацевтической промышленности. Благодаря этому, антибиотики стали самыми распространенными и доступными медикаментами; потребность в них возрастает и по сей день. В этой связи разработка новых подходов, позволяющих заменить химические стадии производства биотехнологическими, интегрировать процесс, сократить расход реагентов и т.д. являются весьма актуальными.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось исследование
принципиально новых подходов, новых ферментативных процессов получения ядер Р-
лактамных антибиотиков - 6-аминопенициллановой (6-АРА) и 7-
аминодезацетоксицефалоспорановой (7-ADCA) кислот, исходя из таких субстратов как
бензилпенициллин (PenG), фе ноксиметил пенициллин (PenV),
бензилдезацетоксицефалоспорин (CephG). В задачи входило изучение термодинамики соответствующих процессов а также кинетических закономерностей их протекания, оценка эффективности предложенных подходов в сравнении с традиционным процессом -ферментативным гидролизом.
Научная новизна. Впервые документирована и детально исследована активность пенициллинацилазы из Е.соІі в кислых средах (рН 3-4). Предложены и исследованы новые методы получения ядер р-лактамных антибиотиков - 6-аминопенициллановой (б-АРА) и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой (7-ADCA) кислот. Один из них заключается в ферментативном гидролизе соответствующих антибиотиков в кислых средах в двухфазных системах «водный раствор - неемешивающийся с водой органический растворитель». Другой оригинальный подход состоит в получении ядер не гидролизом, как в традиционной схеме, а ферментативным ацильном переносом на внешний нуклеофил: эфиры, амиды и нитрилы аминокислот. Проведено детальное изучение термодинамических и кинетических закономерностей протекания предложенных процессов получения ядер антибиотиков. Попутно обнаружено и исследовано явление образования ионных комплексов между антибиотиками и производными аминокислот.
Показана способность ПА из E.coli эффективно использовать фенилуксусную кислоту в качестве ацилируюшего агента в кислых средах.
Практическая значимость работы, Благодаря установленной активности фермента (ПА из Е.СОІІ) в кислых средах расширен спектр его применений в биокатализе. В частности, показана его эффективность в получении ядер антибиотиков гидролизом в кислых средах в двухфазных системах, что позволяет интегрировать стадии биосинтеза антибиотика и его трансформации с получением соответствующего ядра. Показана возможность получения ядер антибиотиков ферментативным ацильным переносом с выходом, превышающим 99%. Производительность предложенного процесса в несколько раз превышает производительность традиционного ферментативного гидролиза. Показана эффективность получения ядер антибиотиков ацильным переносом в кислых средах на нуклеофилы с низким рК (нитрилы аминокислот). Высокая энантиоселективность ацильного переноса, демонстрируемая ПА из Ecoli, позволила также сопрячь процессы получения ядра антибиотика с разделением рацемата нуклеофила. Было показано, что фенилуксусная кислота способна выступать в кислых средах ацилирующим агентом, не уступающим по эффективности активированным производным.
