Содержание к диссертации
Введение
1. Некоторые физико-химические свойства гидрогеназы белков 7
1. Гидрогеназы - железо-серные белки 7
2. Структура активного центра и окислительно-восстановительные свойства низкомолекулярных железо-серных белков 9
3. Физические свойства 4Fe-4s кластеров в низкомолекулярных белках 13
4. 3Fe-nS кластеры
2. Физико-химические свойства гйдрогеназ 17
1. Окислительно-восстановительные свойства 17
2. Оптические свойства
3. Спектры ЭПР 19
4. Взаимосвязь физических и каталитических свойств гидрогеназ 21
5. Роль никеля в гидрогеназном катализе 24
3. Влияние различных эффекторов на активность гидрогеназ 23
1. Роль ионной силы раствора 23
2. Влияние комплексонов железа 23
3. Механизмы инактивации гидрогеназ кислородом 30
4. рН Зависимость гидрогеназного катализа 33
4. Кинетика действия гидрогеназ 34
5. Материалы и методы исследования 43
1. Материалы 43
2. Кинетика окисления водорода 43
3. Определение активности гидрогеназ по выделению водорода 46
4. Приготовление ферментного электрода 47
5. Запись поляризационных кривых 47
6. Стационарная кинетика одномаршрутнои каталитической реакции.обойденное уравнение скорости 69.
7. Кинетика окисления водорода, катализирующего гидрогеназами. Последовательность эжжнтарных стадий 66
8. Кинетика окисления водорода, мтализирушего гйдрогеназой из thiocapsa roseopersicina окисжтельно-восстановитмьные стадии 77
9. Особенности кинетики действия гидрогеназы из rhodopseudomonas capsulata 96
6. Водородный ферментный электрод на основе иммобилизованной гидрогеназы из thiocapsa roseopersicina 106
1. Исследование ферментов как катализаторов электродных реакций
2. Биоэлектрокатализ гидрогеназой из Th. roseopersicinja.
7. Электрохимическая кинетика действия гидрогеназы из thiocapsa roseopersicina
1. Кинетические закономерности электроокисления водорода
2. Обратная реакция: электровыделение водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой из Th.roseopersicina 130
Заключение
Выводы
- Структура активного центра и окислительно-восстановительные свойства низкомолекулярных железо-серных белков
- Взаимосвязь физических и каталитических свойств гидрогеназ
- Определение активности гидрогеназ по выделению водорода
- Кинетика окисления водорода, мтализирушего гйдрогеназой из thiocapsa roseopersicina окисжтельно-восстановитмьные стадии
Введение к работе
Растущий в последнее время интерес к биологическим объектам, осуществляющим процессы активации и образования молекулярного водорода, вполне закономерен.
Процессы поглощения и образования молекулярного водорода в биологических системах, как правило, связаны с наличием специфического класса ферментов, субстратом или продуктом которых является молекулярный водород. В 1931 г. Стефенсоном и Стикландом [і] . для них было предложено тривиальное название "гидрогеназы" (1.98.1.1).
Как общенаучный, так и практический интерес к этим ферментам стимулируется рядом крайне интересных особенностей и возможностей гидрогеназ.
Во-первых, водород является простейшей с физико-химической точки зрения молекулярной системой. Детальное исследование механизма активации водорода биологическими катализаторами может существенно продвинуть нас в понимании физико-химических основ ферментативного катализа окислительно-восстановительных реакций в целом [2J .
Во-вторых, гидрогеназы как катализаторы, активирующие молекулярный водород, весьма интересны с точки зрения инженерной энзимологии. Понимание механизма действия этих ферментов облегчит поиск катализаторов реакций гидрогенизации-дегидрогенизации органических соединений, находящих широкое применение в практике [2, 3J .
В-третьих, особый интерес вызывает возможность использования ферментов в качестве катализаторов в системах биоконверсии энергии. Биоэлектрокатализ гидрогеназами может быть положен в основу создания топливных электродов в электрохимических преобразователях (биотопливных элементах) | 4-81 .
Гидрогеназы являются в достаточной степени распространенными ферментами, обеспечивающими энергоснабжение ряда микроорганизмов за счет окисления водорода. К настоящему времени хорошо изучены метаболические пути микроорганизмов, проявляющих гидрогеназную активность, а также локализация и функции самих гидрогеназ. Имеются также многочисленные данные по биохимии этих ферментов (см. Гз, 9-II ). Однако в литературе не встречаются сколько-нибудь общие взгляды относительно каталитических свойств гидрогеназ, весьма неполно и противоречиво представлены кинетические характеристики отдельных ферментов.
Целью данной работы было изучение кинетики действия гид рогеназ: термостабильной - из Thiocapsa roseopersicina и "односторонней" ИЗ Rhodopseudomonas capsulata , - включение гидрогеназы в биоэлектрокатализ по механизму прямого обмена электронами между электродом и активным центром фермента.
Исследование возможности создания водородного ферментного электрода являлось весьма важным в плане последующего использования в системах биоконверсии энергии. С другой стороны, значительный интерес представляло сравнение кинетических закономерностей, проявляемых гидрогеназои в гомогенном и электрохимическом катализе.
Структура активного центра и окислительно-восстановительные свойства низкомолекулярных железо-серных белков
Бурное исследование железо-серных белков началось с 1962г., когда был открыт ферредоксин из Cl.pasterianum [24]. Одним из отличительных свойств этого класса металлопротеидов являлось наличие негеминового железа в активном центре 125j. Как уже указывалось, ферредоксины обладают относительно низким молекулярным весом (6000-30000) [25J. Основные их различия связаны со строением активного центра. I-Fe белки, или рубредоксины, содержат один атом железа, связанный с четырьмя атомами серы аминокислотных цистеиновых остатков. Структура 2Fe-2S ферредоксинов представлена на рис. 1а. Кроме двух атомов железа, они содержат 2 атома кислотолабильной серы. Наиболее интересен класс 4Fe-4s белков (рис. 16). Сюда входят как ферредоксины, так и высокопотенциальные белки, или HI PIP (High. Potential Iron Protein ), различающиеся потенциалами окислительно-восстановительных переходов. 8Fe-fiS и более сложные, как было показано, не образуют самостоятельных структур, а формируют активный центр из 2Fe-2S H4Fe-4S кластеров. Гидрогеназы содержат в активном центре, в основном, 4Fe-4S и, в ряде случаев, 2Fe-2S кластеры, которые мы и рассмотрим более подробно. Железо-серные белки принято разделять на две группы по величине окислительно-восстановительного потенциала. Наиболее широк класс ферредоксинов, включающий 2Fe-2S и 4Fe-4S белки, потенциалы которых лежат в отрицательной области относительно нормального водородного электрода (-0.3 -0.4 В). Группу высокопотенциальных (HIPIP) представляют исключительно 4Fe-4S белки с величинами окислительно-восстановительных потенциалов Важным является также вопрос о числе переносимых электронов на кластер. Установлено [26, что в 2Fe-2S H4Fe-4S белках окислительно-восстановительный переход в нормальных условиях является одноэлектронным, тогда как более сложные структуры ( 8Fe-8Sn др.) обмениваются большим числом электронов, но не более одного на кластер. Наиболее остро возникал вопрос о различии окислительно-восстановительных свойств при рассмотрении 4Fe-4S белков. Решение было найдено Картером [27I, предложившим в 1972 г. гипотезу "трех состояний". Окислительно-восстановительные процессы в железо-серных белках определяются изменением степени окисления железа (+3/+2). Различие состояний кластера заключается в соотношении атомов Fe3+ и Fe2+. Электронные структуры восстановленного HIPIP и окисленного ферредоксина оказались эквивалентными. Таким образом, ферредоксиновые и HIPIP переходы происходят между разными степенями окисления 4Fe-4S кластера.
Получение суперокисленных ферредоксинов и супервос-становленных HIPIP позволило дополнить модель Картера и получить окончательную схему окислительно-восстановительных переходов в 4Fe-4S белках [28]: заряд кластера здесь и далее будет приводиться как сумма зарядов атомов железа и кислотолабильной серы. -гена основании физических свойств удалось также выяснить природу ферредоксинового перехода в 2Fe-2s белках. Установлено, что в окисленном состоянии оба атома железа находятся в степени окисления +3; восстановление кластера приводят к восстановлению одного из атомов до двухвалентного состояния. Примечательным является то обстоятельство, что железо-серный кластер представляет собой единую электронную структуру. Как показали многочисленные исследования, атомы железа внутри кластера ведут себя крайне идентично [26 ]. Для объяснения этого явления предложена гипотеза "антиферромагнитного взаимодействия" [29J, основанная на методе валентных схем. Суть ее заключается в следующем: в результате гибридизации валентных электронов на атомах железа, связанных сульфидными мостиками, спины первых оказываются антипараллельными. Таким образом, если число валентных электронов кластера четно, все они оказываются спаренными. Как указывается многими исследователями (например, [30[), спектральные характеристики 2Fe-2s и 4Fe-4S кластеров весьма схожи, и в силу ряда причин бывает невозможно идентифицировать тип кластера. Гидрогеназы содержат в активном центре количество атомов железа, кратное четырем. Метод количественной экструзии кластеров в применении к 12-Fe гидрогеназе из CI. pasterianum [23 J показал наличие только 4Fe-4S кластеров. Кроме того, существует целый ряд ферментов, содержащих один 4Fe-4S кластер на молекулу белка. Однако,в результате исследования спектров ЭПР 12-Fe гидрогеназы из ATcaiigenes eutrophus н-16 [зі, 32j удалось определить наряду с двумя 4Fe-4S два 2Fe-2S кластера. Для других многокластерных гидро-геназ столь детального исследования проведено не было, однако необходимым для водородного катализа, по-видимому, является на- личие в активном центре фермента 4Fe-4S кластера. Рассмотрим кратко свойства последних. 3. Физические свойства 4Fe-4S кластеров в низкомолекулярных белках. Оптические свойства. Спектры поглощения видимой области идентичны для железо-серных белков, содержащих кластер в одинаковой степени окисления. Состоянию [Fe4 s4]2+ отвечает максимум поглощения в районе 400 нм, коэффициент экстинкции С- 4 10 W см [ЗО]. При восстановлении кластера величина абсорбции на этой длине волны падает приблизительно на 50$, максимум поглощения смещается к 420 нм.
При окислении состояния [Fe4 s.]2+ абсорбция на 400 нм возрастает. Таким образом, в ряду: наблюдается падение величины поглощения при 400 нм. Отношение величин абсорбции при 400 нм и 280 нм является мерой отношения хромофора к пептиду, оно обычно используется как индикатор чистоты железо-серного белка. Магнитные свойства. Четное число неспаренных электронов в кластере приводит к тому, что последний, не проявляет сигналов ЭПР. Таким обра- зом, ЭПР нечувствительным является состояние [Fe4 s4] . Кластеры [Fe4 s4] тлеют характерный ЭПР спектр, относительно слабо зависящий от полипептидного окружения. Наблюдается аксиальный или ромбический сигнал, средний д-фактор около 1.96. Элиминирование пептидного влияния в 80$ диметил-сульфоксиде [зз] приводит к аксиальному спектру: g1 =1.94, дп= 2.05. Ферредоксины, содержащие два и более железо-серных кластеров, находящихся в состоянии [Fe4 s4]1+ , проявляют более сложный сигнал ЭПР в результате спин-спинового взаимодействия [30j. ЭПР спектры [Fe4 s43 + кластеров гораздо более чувствительны к полипептидному окружению. В качестве характеристик можно выделить: g 2, один спин на четыре атома железа. Влияние белковой глобулы. Белковая глобула может оказывать двоякое воздействие на свойства железо-серных кластеров. Во-первых, в выборе оптимального окислительно-восстановительного перехода (ферредокси-ны и HIPIP). Во-вторых, в пределах одной и той же реакции возможна достаточно широкая вариация окислительно-восстановительного потенциала. Как отмечено в [зо], потенциалы ферредокси-нового перехода ([Fe4 s4]2+/1+) различаются в пределах до 650 мВ, HIPIP ([Fe4 S4]3+/2+) - до 750 мВ. Существуют термодинамические и кинетические трактовки ограничений, позволяющие осуществить выбор оптимальных окислительно-восстановительных состояний. Из механизмов возможных воздействий следует выделить влияние водородных связей, взаимодействие с растворителем и ограничение конформационной подвижности кластера (см. [ЗО]). Изменение геометрии последних при окислительно-восстановительных переходах является в настоящий момент установленным фактом. В работе [34І были зарегистрированы конформационные изменения ферредоксина из Caci-dі uric і в процессе восстановления. Картер с сотрудниками, изучая высокопотенциальный белок из chromatium sp. методом рентгеноструктурного анализа обнаружили [35] изменение симметрии железо-серного кластера при окислительно-восстановительном переходе. Белковая глобула может за счет конформационного влия- ния стабилизировать или дестабилизировать то или иное состояние кластера, влияя, с одной стороны, на выбор оптимального перехода, с другой стороны, смещая термодинамическое равновесие окислительно-восстановительной реакции и, следовательно, ее потенциал.
Взаимосвязь физических и каталитических свойств гидрогеназ
Представляет интерес сопоставление не только физических, но и каталитических свойств одноцентровых и многоцентровых гидрогеназ. Как видно из табл. I, активность последних как по поглощению, так и по выделению водорода в среднем на два порядка выше по сравнению с одноцентровыми. В дальнейшем будет показано, что расщепление молекулы водорода и обмен протонами с растворителем не лимитируют в реакциях активации и выделения Н. Ключевыми в механизме действия гидрогеназ являются окислительно-восстановительные стадии. Исходя из этого можно предположить две гипотезы о роли железо-серных кластеров в катализе. Во-первых, кластер представляет собой электронную структуру, стабилизирующую переходное состояние, и, тем самым, понижающую общий активационный барьер (см. напр. [701). С этой точки зрения маловероятными представляются предполагаемые механизмы окисления водорода, проходящие через промежуточное образование заряженных форм фермента (напр. [46 1). Чрезмерная стабилизация промежуточного комплекса в свою очередь приведет к увеличению суммарного активационного барьера [70 J. Во-вторых, на основании изменения симметрии железо-серных кластеров при окислительно-восстановительных переходах (см. выше) можно предположить вынужденную стабилизацию или дестабилизацию одного из электронных состояний под влиянием теплового движения белковой глобулы, что приведет к понижению энтальпии активации за счет энтропии. Однако наличия железо-серных кластеров в молекуле белка еще недостаточно для проявления гидрогеназной активности. В отличие от одноцентровых гидрогеназ низкопотенциальные НІРІР не катализируют ни выделения, ни поглощения водорода. В качестве примера можно привести ферредоксины из D.gigas [7l], M.flavum [721, содержащие 4 атома железа на молекулу и тлеющие окислительно-восстановительные потенциалы соответственно -130 мВ и -420 мВ, а также б-Fe ферредоксин из Т.thermophi!us [731, потенциал которого равен -250 мВ. 5. Роль никеля в гидрогеназном катализе. Как показали исследования последних лет, весьма важным для проявления каталитической активности является наличие никеля в активном центре гидрогеназ» Первоначально проводились эксперименты по влиянию содержания никеля в культуральной среде на синтез гидрогеназ в процессе роста микроорганизма. Добавление ЭДТА (150-мл) в среду роста трех различных культур: Azospirillum brasillense, A.lipoberum, Derxia gummosa, как было показано [741, не влияет на существующую активность, но подавляет синтез гидрогена-зы.
Только ионы двухвалентного никеля в каталитических концентрациях (10 цМ) способны снять ингибирующее действие ЭДТА. В работе [751 была найдена корреляция между поглощением радиоактивного Ni2+ клетками A. chroococcum и гидроге-назной активностью. Добавление ионов двухвалентного никеля в культуральную среду ch.vinosum [76J приводит к повышению активности гидрогеназы в три - шесть раз и не оказывает влияния на скорость роста микроорганизма. В процессе очистки гидрогеназы из Vibrio succinogenes [77J было обнаружено вымывание никеля из препаратов. Как указывают авторы, зависимость величины активности фермента от концентрации Ni представляет собой прямую, проходящую через начало координат. Правда, сравнивались образцы фермента разной степени чистоты. С другой стороны, участие никеля в гидрогеназном катализе подтверждается физико-химическими данными. ЭПР спектр фермента из Chromatium vinosura 176, 78, 791 свидетельствует о том, что 4Fe-4S кластер взаимодействует с никелевым центром. Воздействие последнего элиминируется в атмосфере водорода. Невозмущенный спектр кластера удается наблюдать при его переходе в форму 3Fe-nS , которая, как показывают авторы, неактивна в катализе. ЭПР - детектируемый никель найден также в гид-рогеназах из Methanobacterium thermoautotrophicum 80 И D.gigas [81А. Причем сигналы трехвалентного никеля исчезают при восстановлении ферментов в атмосфере Hg. Это дает основание предположить непосредственное взаимодействие никелевого центра с водородом. ЭПР спектры никеля в гидрогеназе из D.gigas изучались в различных окислительно-восстановительных состояниях фермента І8І-83І. Показано, что никелевый центр способен вступать в реакции одноэлектронного обмена, изменяя степень окисления Потенциал этого перехода равен -220 мВ при рН 7.0 82 и сильно зависит от рН ("йЕ/ рН = -60 мВ) Гвз]. Таким образом, реакция (I) является протонозависимой, причем однократно про тонируется форма Ni (пі). На основании приведенных данных можно предположить, что роль никелевого центра заключается в акцептировании гидрид-иона или атома водорода с частичной их стабилизацией. Іидрогеназа из Alcaligenes eutrophus включает еще одну группировку, участвующую в водородном катализе, флавинмоно-нуклеотид [50 , что обусловливает ее NADH - дегидрогеназную активность. Молекула фермента (180000 - 200000) содержит по 12 атомов железа и кислотолабильной серы, объединенные в два 4Fe-4S и два 2Fe-2S кластера 31, 32 и две молекулы FMN Г84 [. Фермент состоит из четырех субъединиц, причем гидроге-назная активность проявляется только в целиком собранном состоянии [85 L тогда как NADH- дегидрогеназная активность сохраняется вплоть до субъединиц в 60000. Фермент из A.eutrophus является уникальным синтезом гидрогеназы и NADH-дегидрогена-зы.
В процессе окисления водорода, по-видимому, в результате внутримолекулярного переноса электрона акцептором электронной плотности является FMN, который затем может реагировать с NAD восстанавливая его до NADH. В работе 86 J было показано, что метилвшлоген способен "снимать" электронную плотность на пути к молекуле FMN. Отметим, что восстановленный флавинмоно-нуклеотид, как и NADH, слабо окисляется кислородом. В результате NAD должен реагировать с FMNH даже в аэробных условиях. Действительно, скорость восстановления NAD водородом, катализируемого гидрогеназой из A.eutrophus Z-1 практически не меняется в открытой кювете по сравнению с анаэробной [87 . Для фермента из A.eutrophus н-1 б [88J отмечено только конкурентное ингибирование кислородом по Е . На последующих стадиях электронная плотность остается недоступной для Og. Таким образом, уникальность гидрогеназы из A.eutrophus состоит в том, что этот фермент способен проводить реакцию окисления водорода практически нечувствительно к присутствию кислорода, что невозможно осуществить пока ни на одном катализаторе. В литературе приводятся противоречивые данные относительно влияния на активность гидрогеназ ионной силы. Например, для ферментов из Paracoccus denitrificans [89, 901 И D.vu1garis[64 найдено ингибирующее действие последней. Активность гидрогена-зы из ch.vinosum [бо] значительно падает в присутствии сульфатов и хлорида кобальта. Для фермента из chromatium sp. [l8J отмечено ингибирование ионами тяжелых металлов. С другой стороны, гидрогеназа из Megasphaera elsdenii 162, 641 активируется при повышении ионной силы. Отмечено стабилизирующее влияние хлоридов в концентрациях, больших 0.7 М, на фермент из Rh.rubrum [91]. Гидрогеназа из Spirulina maxima [921 инактивируется ионами меди и цинка, однако, присутствие железа, марганца, магния и кальция приводит к незначительной активации. Противоречивость приведенных данных указывает на механизм влияния. Ионная сила, по-видимому, воздействует на белковые глобулы, Очевидно, белки даже одного микроорганизма, локализованные по-разному в клетке, могут иметь существенные различия. В заключение приведем факт сохранения активности гидрогеназой из D.vulgaris [931 в лиофилизованном состоянии. 2. Влияние комплексонов железа. В начале семидесятых годов многими авторами отмечалось сильное ингибирование активности гидрогеназ комплексонами железа: « - дипиридилом, о-фенантролином,ЕОТА , CN", N3 (см., напр. [16, 94).
Определение активности гидрогеназ по выделению водорода
Как уже указывалось в обзоре литературы, данная методика обладает рядом существенных недостатков, что делает ее малопригодной для кинетических исследований. В настоящей работе она применялась для определения сравнительной активности фер- ментов в иммобилизованном состоянии. В насыщенную аргоном реакционную смесь, содержащую ЮМ метилвиологена, добавлялся избыток дитионита натрия (5-Ю""3 М). В процессе эксперимента осуществлялось термостатирование и перемешивание на качалке со скоростью 200 циклов в минуту. Скорость выделения водорода контролировалась газохроматографическим методом на хроматографе "Хром-4", ЧССР. Детектором служил катаро-метр, в качестве газа - носителя использовался аргон. 4. Приготовление Ферментного электрода На золотую проволоку наносилась суспензия измельченной са жи из раствора фторопластового лака в ацетоне (10 мг сажи + I мг фторопласта в 0.1 мл ацетона). После высушивания получен ный сажевый электрод подвергался гидрофилизации в атмосфере кислорода при потенциале 0 0.1 В по Е . Потенциал задавал ся потенциостатом П-5827-М. Сорбцию гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina проводили в течение суток при 4С из рас- твора, содержащего 4 6 мг фермента на мл. 5. Запись поляризационных кривых Поляризационные кривые записывались гальваностатическим и потенциодинамическим методами с использованием трехэлектродной схемы (рис.2а): рабочий, сравнения и вспомогательный электроды. Конструкция электрохимической ячейки (рис.26) предусматривала продувку газом через раствор и поверх раствора, перемешивание и термостатирование пространства рабочего электрода, а также термостатирование электрода сравнения, которым служил водородный электрод в том же растворе. В момент записи поляризационных кривых гальваностатическим методом водород пропускался поверх раствора. Величина тока регистрировалась микроамперметром М-95 и миллиамперметром М-254. Разность потенциалов между рабочим электродом и электродом сравнения контролировалась цифровым вольтметром Щ-ІЗІ2. Потенциодинамические кривые записывались следующим образом. В описанной выше ячейке пространство рабочего электрода отдувалось аргоном, затем подавалась развертка потенциала со скоростью 1-5-40 мВ/сек в диапазоне -0.1 -5- +0.3 В. Развертка потенциала задавалась потенциостатом П-5827-М. Потенциодинами-ческие кривые фиксировались на двухкоординатном самописце типа XY 4103 (Laboratorni Pristoge Praha). Обработка экспериментальных данных проводилась на компьютере " Sord ", Япония. Искомые параметры кинетических уравнений во всех случаях удавалось представить в качестве коэффициентов полиномов.
Таким образом, для анализа использовался метод линейной множественной регрессии [І35І , позволяющий выбирать наилучшие функции для описания зависимой переменной. Критерием удовлетворительного описания кинетических и электрокинетических кривых служила величина коэффициента корреляции г 0.999. Отступление в область формальной кинетики не является самоцелью в данной работе. Наоборот, в процессе изучения механизмов многосубстратных каталитических реакций ставятся все новые задачи перед математическим аппаратом. Так,при исследовании кинетики действия гидрогеназ использование обобщенной формы записи уравнения скорости позволило, с одной стороны, существенно упростить выбор возможных кинетических схем и, с другой стороны, повысить надежность кинетического анализа. Это объясняется тем, что на основании вида полученного экспериментально уравнения скорости можно сделать некоторые общие выводы относительно условий протекания процесса (например, необратимость отдельных элементарных стадий, квазиравновесие и др.). Кроме того, при изучении последовательности присоединения субстратов и выброса продуктов из активного центра фермента становится возможным выписать уравнение скорости для всей совокупности исследуемых механизмов. В общем, как будет видно из дальнейшего, представления, развитые в данной главе, оказываются достаточно полезными. Примечательным является то обстоятельство, что задачи для теоретического рассмотрения были поставлены в результате непосредственного кинетического анализа экспериментальных данных. Однако прежде, чем обратиться к обсуждению полученных результатов, для иллюстрации актуальности и новизны теоретических выводов следует остановиться на некоторых существовавших положениях формальной кинетики одномаршрутных каталитических реакций. В рамках теории стационарных реакций, развитой в работах Дз.Хориути и М.И.Темкина [I36-I4IJ , дается алгоритм вывода кинетических уравнений сложной реакции. Для определения скоростей по маршруту необходимо решать систему уравнений стационарности. М.И.Темкин разработал общую методику вывода кинетических уравнений на основе детального механизма I38-I4I . Для линейного случая особенно эффективным оказывается использование методов теории графов Гі39, 142 . Они позволяют выписать кинетическое уравнение в явном виде. Это было сделано сначала в ]143, 144 ] для одномаршрутной ферментативной реакции, а затем обобщено на случай сложных многомаршрутных каталитических реакций 145J . Как правило, прямое использование алгоритмов, предложенных в 143-145 , приводит к сложным выражениям стационарной скорости реакции, использование и тем более анализ которых затруднительны. Дальнейшее развитие теория кинетики стационарных реакций получила в работах Г.С.Яблонского с сотр. [I46J На основе методов теории графов получена упрощенная форма записи кинетического уравнения стадийной одномаршрутной каталитической реакции 147J . Однако указанный алгоритм также весьма сложен для прямого использования.
Частный случай (необратимость одной из стадий) был записан в 148 в наиболее удобном для анализа виде. Целью данной работы был вывод общего уравнения скорости одномаршрутной каталитической реакции и выявление некоторых кинетических закономерностей последней. В химической и ферментативной кинетике часто бывает возможным проследить взаимное влияние различных субстратов и продуктов, в частности определить, входит или не входит их произведение (частное) в уравнение скорости процесса. I.a. Мультипликация субстратов. Пусть из уравнения скорости необходимо исключить произве дение двух субстратов, взаимодействующих с активным центром фермента на стадиях С и і . Для определенности положим і J . Тогда слагаемые уравнения скорости (10), подлежащие исключе нию, разделятся на две группы, обладающие следующим свойством: слагаемые первой группы, и только они будут содержать сомно житель г гс-н, а слагаемые второй группы, и только они, будут содержать сомножитель J J Ы . Прежде, чем перейти к возможности исключения указанных групп слагаемых, рассмотрим все остальные варианты. 1.6. Мультипликация продуктов. Проводя рассмотрение аналогично случаю I.a., выделяем две группы слагаемых: первая содержит сомножитель Pi fii+1 .,. Д/ , вторая - сомножитель ЦгІ.в. Мультипликация субстрата и продукта. а По аналогии с двумя предыдущими вариантами положим l \ Если теперь имеем С -ый продукт и І -ый субстрат, получаем две группы слагаемых, обладающих сомножителями г ri+i. В случае / -ого продукта и I -ого субстрата соответствующие сомножители имеют вид: Стадию (группу стадий) будем считать необратимой, если соответствующая константа (произведение констант) обратного направления не входит в уравнение скорости процесса. Варианты, рассмотренные в предыдущем разделе, требуют исключения произведения ряда J3t , причем сами J /d и другие их комбинации в произведениях morjT входить в уравнение скорости. Рассмотрим для примера первую группу. I.a. Требование исключить произведение j 6с-н » не исключая» в частности каждое Вл; (, 4 i( 4 і » назовем требованием "обобщенной необратимости" на стадиях между X; и X . Физический смысл этого утверждения легче интерпретировать в рамках теории графов: базовые определители не содержат деревьев, включающих путь реакции от X ; к X,- , следовательно, в процессе реакции о путь превращениях; в Х6- закрыт.
Кинетика окисления водорода, мтализирушего гйдрогеназой из thiocapsa roseopersicina окисжтельно-восстановитмьные стадии
Рассмотрение стадий взаимодействия с акцепторами элект ронов в реакции окисления водорода, катализируемого гидро- геназами, представляет интерес с различных точек зрения. Во= первых, для всех ферментов характерна многофакторность ката лиза. Так, для гидрогеназы из D.desulfuricans бы ло найдено, что цитохром Со значительно стимулирует активность 123 . Более того, скорость выделения водорода из восстановленной смеси метилвиологена и цитохрома Cg этой гидрогена-зой превышает сумму скоростей по MV и цитохрому, взятым по отдельности (1321 . Ингибиторный анализ показал, что оба акцептора взаимодействуют с одним участком в ферменте. К сожалению, для одноцентровых гидрогеназ не было найдено подобных аномалий. Во-вторых, как указывается некоторыми авторами 102,П7 1 г реакция дейтерообмена в активных центрах гидрогеназ может про текать с участием окислительно-восстановительных стадий за счет фермент-ферментного взаимодействия. Добавление акцептора электронов приводит к ингибированию дейтерообмена для гидро геназ ИЗ Clostridium pasterianum [ » А- eutrophus [lI7J , Rhizo b ium jaропі cum [ш] . Причем после полного восстановления акцептора дейтерообмен возобновляется. Следовательно, путь восстановления переносчика электронов является предпочтительным. Наконец, как было установлено в предыдущей главе, окислительно-восстановительные стадии играют важнейшую роль в катализе гидрогеназами реакции окисления молекулярного водо- рода. Прежде, чем перейти к рассмотрению дальнейшего экспериментального материала, вспомним некоторые результаты, полученные в предыдущей главе. В атмосфере водорода зависимость начальной скорости реакции от исходной концентрации окисленной формы метилвиологена подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Поскольку в реакции окисления водорода метилвиологен может выступать лишь как одноэлектронный акцептор, присоединение двух молекул последнего должно быть разделено необратимой стадией. Представляет интерес исследование параметров реакции в рамках интегральной кинетики. Полная кинетическая кривая линеаризуется в координатах интегральной формы уравнения Михаэ-лиса-Ментен с коэффициентами корреляции 0.999 (рис.5). Полученные константы Михаэлиса и максимальные скорости имели отрицательные значения, что свидетельствует о влиянии продукта на скорость реакции.
Зависимости кажущихся К и V от концентрации окисленной формы метилвиологена анализировались в широком диапазоне концентраций последнего. Как видно из рис.10, максимальная скорость является константой, в то время как кажущаяся константа Михаэлиса пропорциональна концентрации метилвиологена с коэффициентом 1.0: где К - некоторая постоянная. В знаменателе уравнения (22), как видно, отсутствует слагаемое, пропорциональное концентрации окисленной формы метилвиологена, то есть субстрата ферментативной реакции. Это объясняется тем, что константа связывания продукта, восстановленного метилвиологена, гораздо больше единицы. Речь идет о кажущихся константах, то есть о величинах, входящих в уравнение скорости (23). Таким образом, продукт оказывает доминирующее влияние на форму интегральной кри-вой. Для дальнейшего кинетического анализа необходимо более детальное изучение слагаемых уравнения скорости ферментативной реакции. На рис.II представлены зависимости скорости от концентрации окисленной формы метилвиологена при определенных концентрациях восстановленного метилвиологена в координатах Иди. Наблюдается хорошая линеаризация указанных зависимостей. Продукт ферментативной реакции в значительной степени влияет на величину кажущейся константы Михаэлиса; в то же время максимальная скорость остается постоянной. Как видно из рис.12, Км каж пропорциональна концентрации восстановленной формы метилвиологена. где "\Г » К и Кр - соответственно эффективные максимальная скорость, константа Михаэлиса и константа "ингибирования продуктом". Уравнения скорости типа (23) принято относить к механизмам, включающим конкурентное ингибирование продуктом ферментативной реакции [l49j Однако подобное рассмотрение не учитывает всех возможных кинетических схем, некоторые из которых являются важными в данном случае. Поэтому целесообразно еще раз обратиться к дискриминации механизмов, удовлетворяющих уравнению скорости типа (23). В процессе каталитического акта окисления молекулы водорода с активным центром гидроге-назы реагируют две молекулы акцептора электронов. Как было показано выше, эти взаимодействия разделены необратимой стадией (группой стадий). Рассмотрим различные возможные механизмы, удовлетворяющие уравнению скорости (23), учитывающие взаимодействие активного центра фермента с одной молекулой субстрата и одной молекулой продукта до необратимой стадии. І. В случае обратимой каталитической стадии (схема Михаэ-лиса-Ментен) для того, чтобы свести полученное уравнение скорости к уравнению типа (23) потребовалась бы минимизация слагаемого [5 J [PJ t /ft 4 кз) в знаменателе.
Последнее влечет за собой требование сильного сдвига равновесия на первой стадии в сторону образования субстрата: L \_S\ t_1 Легко показать, что в таком случае скорость ферментативной реакции будет иметь строго первый порядок по субстрату во всем диапазоне концентраций последнего. Следовательно, зависимость Михаэлиса с насыщением по субстрату не должна наблюдаться. Полученные выводы не соответствуют экспериментальным данным (см. предыдущую главу), таким образом рассмотренный вариант не проходит для описания механизма процесса. Введение в схему реакции стадий непродуктивного связывания с продуктом, например, формы Е , приводит лишь к появлению дополнительных членов в числителе уравнения скорости и не сводит последнее к уравнению типа (23). Видно, что полученное уравнение весьма похоже на (24). Однако в отличие от механизма Теорелла-Чанса каталитическая константа относится к реакции фермент-субстратного комплекса, а не к внутримолекулярному превращению. Для окислительно-восстановительной реакции следует ожидать, что величина L будет зависеть от red - ох потенциала акцептора электронов. Влияние окислительно-восстановительных свойств субстрата на "константу ингибирования продуктом" в уравнении (25) выражено менее явно. Экстраполяция на случай двух субстратов и двух продуктов приводит к еще более сложным для интерпретации комбинациям констант. Обратимся теперь к рассмотрению механизма Теорелла-Чанса. Как видно из кинетической схемы, каталитическая стадия относится к внутримолекулярному процессу в ферменте. Таким образом, величина lj_ не должна зависеть от физических свойств акцептора электронов. G другой стороны, знаменатель уравнения (24) является удобным для анализа. Так коэффициент при слагаемом, содержащем концентрацию продукта реакции, представляет собой константу равновесия на первой стадии. Поскольку окислительно-восстановительный процесс происходит в пределах этой стадии, логарифм константы равновесия должен быть пропорционален величине разности red - ох потенциалов переходов между Е и Е и между s и р (см. схему). Следовать і тельно, при неизменности потенциала превращения Е Е отношение констант равновесия на первой стадии для двух различных переносчиков будет определяться выражением: Таким образом, (29) представляет собой сумму с некоторыми коэффициентами констант равновесия на первой и третьей стадиях схемы (27). Согласно уравнению (26), отношение констант равновесия на фиксированной стадии для разных акцепторов электронов не зависит от потенциала окислительно-восстановительного перехода в ферменте, а определяется только разностью red - ох потенциалов переносчиков. Каждая из констант равновесия в выражении (29): -1 / L и і / к будет изменяться в одинаковое число раз, следовательно, величина выражения (29) должна подчиняться уравнению {26).
