Введение к работе
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) известна как фермент, используемый в производстве Р-лактамных антибиотиков. Научный интерес к ПА обусловлен уникальными каталитическими свойствами и механизмом катализа. На примере ПА из Escherichia coli (E.coli) показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может быть использован для решения задач тонкого органического синтеза. Однако несмотря на обилие экспериментальных данных, описывающих каталитические свойства фермента, надежное понимание молекулярного механизма фермент-субстратной специфичности до сих пор отсутствует. Изучение ПА методами теоретической химии представляет значительный интерес, так как, с одной стороны, может дать важную информацию о молекулярных основах механизма действия ПА, и, с другой стороны, позволит использовать эту информацию для рационального дизайна фермента.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось использование методов молекулярного моделирования для решения следующих задач: изучения конформационной лабильности ПА из E.coli;
исследования связывания субстрата в реакции гидролиза Р-лактамных антибиотиков;
характеристики механизма связывания нуклеофила в реакции ацильного переноса на Р-лактамные нуклеофилы;
исследования субстратной специфичности ПА из E.coli и механизма хиральной дискриминации в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов.
Научная новизна. Методоми молекулярной динамики (МД) впервые охарактеризованы конформационные изменения ПА и их влияние на механизм связывания субстратов и каталитические свойства фермента. С помощью молекулярной динамики и молекулярного докинга обнаружен и охарактеризован продуктивный сайт связывания пенициллина и впервые проведен анализ вклада положительно заряженных аминокислотных остатков в связывание субстрата. Предложена модель ферментативного гидролиза Р-лактамных антибиотиков, учитывающая непродуктивное связывание и конформационную лабильность фермента на кинетические параметры реакции. Исследован механизм ацильного переноса на Р-лактамные нуклеофилы, катализируемого пенициллинацилазой, и выявлены факторы, влияющие на эффективность связывания нуклеофила, скорость превращения ацилфермента и накопление продуктов ацильного переноса. Впервые изучены особенности связывания энантиомеров N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов пенициллинацилазой. Охарактеризована роль заряженной группы и гидрофобного радикала в хиральной дискриминации энантиомеров субстрата. Показана важность упорядоченной структуры растворителя для связывания полярных групп субстратов и альтернативных центров связывания для хиральной дискриминации субстратов. Полученные результаты позволили количественно предсказать соотношение констант Михаэлиса для ферментативной реакции гидролиза энантиомеров.
Практическая значимость работы. С помощью методов молекулярного моделирования впервые реконструированы детали каталитического механизма синтеза и гидролиза Р-лактамных антибиотиков, без которых описание кинетики действия такого промышленно важного фермента, как ПА, является неполным. На основе разработанных молекулярных моделей предложен способ расчета кинетических параметров ферментативной реакции, позволяющий предсказывать эффективность связывания субстрата и его каталитического превращения. Разработанная методология молекулярного моделирования представляет возможность изучения субстратной специфичности ПА in silico и является основой для рационального дизайна ПА и других промышленных гидролаз.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международных конференциях: 8-ой Школе В.А.Фока по квантовой и вычислительной химии, г. Н.Новгород, 2004 г., "Ломоносов-2004", г. Москва, 2004 г., «Biomedical Engineering», Мюнхен, Германия, 2005 г., «Biocatalysis-2005 и «Biocatalysis-2007», г. Санкт-Петербург, 2005 и 2007 гг., "Biotrans-2005. The Key to Industrial Biotechnology", r. Делфт, Нидерланды, 2005 г., "Биотехнология и медицина", Москва, 2006 г., Научно-практической конференции «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002 -2006 гг.», г. Москва, 2006 г., "Environmental Biocatalysis. From remediation with enzymes to novel green processes", Кордоба, Испания, 2006 г., Международной школе молодых ученых «Theoretical Modeling of Ligand Binding and Enzyme Catalysis», Тромсе, Норвегия, 2005 г., Симпозиуме по сотрудничеству Европейского Союза и России в области биотехнологии, г. Суздаль, 2007 г., обсуждены на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета, семинарах отдела биокинетики НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и протоколов расчетов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 7 схем и 75 рисунков.
