Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Основные подходы в лечении ишемической болезни сердца 10
2.2. Альтернативные подходы в лечении ишемической болезни сердца 12
2.2.1. Терапевтический ангиогенез 13
2.2.2. Клеточная регенеративная терапия 15
2.3. Клеточная терапия в кардиологии 17
2.3.1. Использование фетальных кардиомиоцитов в терапии инфаркта миокарда 18
2.3.2. Использование скелетных миобластов в терапии инфаркта миокарда 19
2.3.3. Использование эндотелиальных клеток-предшественников в терапии инфаркта миокарда 20
2.3.4. Использование стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда 21
2.3.4.1. История развития учения о стволовых клетках 22
2.3.4.2. Использование эмбриональных стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда 23
2.3.4.3. Использование гемопоэтических стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда 25
2.3.4.4. Использование мезенхимальных стромальных клеток в терапии инфаркта миокарда 26
2.3.4.5. Использование ядросодержащих клеток костного мозга в терапии инфаркта миокарда 30
2.3.5 Способы введения клеток 34
3. Материалы и методы исследования 37
3.1. Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга 37
3.1.1. Получение ядросодержащих клеток костного мозга 37
3.1.2. Получение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 39
3.1.3. Характеристика культур мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 39
3.1.4. Окрашивание клеток 39
3.2. Моделирование инфаркта миокарда 40
3.3. Введение клеток животным 41
3.4. Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде 42
3.5. Электрокардиография 43
3.6.Ультразвуковое исследование сердца 43
3.7. Методика оценки перфузии миокарда 44
3.8. Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда 47
3.9. Методика измерения дилатации левого желудочка 48
3.10. Гистологическое исследование 48
3.11. Количественная оценка васкуляризации 49
3.12. Статистическая обработка 49
4. Результаты собственных исследований 50
4.1. Сравнение способов получения ядросодержащих клеток костного мозга 50
4.2. Характеристика клеток костного мозга 51
4.3. Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде кролика 55
4.4. Электрокардиография 56
4.5. Ультразвуковое исследование сердца 61
4.6. Перфузия миокарда 70
4.7.Течение инфаркта миокарда у кролика 76
4.8. Морфометрическая характеристика сердец кроликов 78
4.9. Морфологическая характеристика миокарда 83
Заключение 92
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Список литературы 103
- Использование мезенхимальных стромальных клеток в терапии инфаркта миокарда
- Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга
- Методика оценки перфузии миокарда
- Характеристика клеток костного мозга
Введение к работе
Несмотря на значительные успехи современной медицины, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему остаются главной причиной смертности и инвалидизации населения (Беленков Ю.Н. с соавт., 2003; Шахов В.П., Попов СВ., 2004). Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе ишемии кардиомиоциты замещаются соединительной тканью (Репин B.C., Сухих Г.Т., 1998). Необратимое повреждение кардиомиоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности (Gaudron P. et al., 1993). Используемые в настоящее время консервативные и оперативные методы лечения ишемии миокарда не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин. Так, например, у больных с дистальным поражением и диффузными изменениями в коронарных артериях достичь реваскуляризации миокарда с помощью методов хирургической коррекции становится невозможным (Бокерия Л.А. с соавт., 2004). В связи с этим разрабатываются новые способы регенерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии (Репин B.C., 1998; Потапов И.В. с соавт., 2001; Шевченко Ю.Л., 2006). Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирургии является использование клеток костного мозга. Данный подход основан на способности клеток костного мозга участвовать в регенерации поврежденного миокарда (Шахов В.П., Попов СВ., 2004; Chachques J.S. et al., 2005). В терапии инфаркта миокарда используют различные клетки костного мозга: гемопоэтические стволовые клетки (Limbourg F.P. et al., 2005), эндотелиальные прогениторные клетки (Katritsis D.G., 2005), мезенхимальные стромальные клетки (Tang Y.L., 2005), нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (Zhang S., 2004). Применяется как аллогенная, так и аутологичная трансплантация клеток, причем наиболее перспективным считается трансплантация аутологичных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем. Наибольшую популярность получила аутотрансплантация мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга. Растущее число экспериментальных работ демонстрирует положительный эффект трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда (Aceves J.L. et al., 2005; Piao H. et ah, 2005; Gao L.R. et ah, 2006; Krausgrill B. et ah, 2006; Meluzin J. et ah, 2006). Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Такими являются вопрос о наиболее эффективном типе клеток и вопрос об оптимальном способе введения клеток для восстановления миокарда.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: Изучить влияние аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и не фракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение острого инфаркта миокарда в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Отработать оптимальный способ получения клеток костного мозга кролика для последующей аутотрансплантации.
2. Определить местонахождение трансплантированных клеток в миокарде при различных путях введения.
3. Сравнить эффективность влияния культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда у кролика. 4. Оценить влияние трансплантации различных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда на различных сроках.
5. Изучить эффективность различных путей введения клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда.
Научная новизна.
Впервые выполнено сравнение различных способов получения клеток костного мозга.
Впервые на одной модели произведено сравнение влияния трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга при разных путях введения на течение инфаркта миокарда у кролика.
Впервые проведена комплексная оценка морфофункционального состояния миокарда после трансплантации различных клеток костного мозга на основе использования современных инструментальных методов обследования (эхокардиографии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии).
Впервые охарактеризовано состояние миокарда в отдаленные сроки (1 год) после трансплантации клеток костного мозга.
Получены новые данные о возможности использования витального флуоресцентного красителя для идентификации трансплантированных клеток в миокарде кролика.
Разработаны параметры оценки перфузии миокарда кролика методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии.
Теоретическая и практическая значимость.
Данные, полученные в исследовании, являются теоретической основой для внедрения клеточных технологий в клиническую практику, так как обосновывают оптимальный вид клеток костного мозга и их способ введения при лечении больных с инфарктом миокарда. Положения, выносимые на защиту:
1. Клетки костного мозга, трансплантированные интрамиокардиально, сохраняются в зоне введения в течение нескольких недель.
2. Введение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга оказывает выраженное положительное влияние на морфофункциональное состояние миокарда в разные сроки наблюдения после коронароокклюзии.
3. Применение не фракционированных ядросодержащих клеток костного мозга приводит к увеличению размера зоны повреждения и ухудшению функционального состояние миокарда при экспериментальном инфаркте у кроликов.
4. Внутривенное введение клеток костного мозга не изменяет течение экспериментального инфаркта миокарда у кроликов.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005; юбилейной студенческой научной конференции, посвященной 100-летию клинической больницы Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии и 80-летию Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии «Студенческая наука - 2005», Санкт-Петербург, 2005; конкурсе бизнес-идей и научно-исследовательских разработок «Молодые. Дерзкие. Перспективные», Санкт-Петербург, 2005; научной конференции «Новые технологии в ядерной медицине», Санкт-Петербург, 2006; Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2006; XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2006; Невском радиологическом форуме «Новые горизонты», Санкт-Петербург, 2007. Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Подана заявка №20006124343 (06.07.2006) на изобретение: «Способ лечения больных пороками клапанов сердца» (соавт. Давыденко В.В., Гриценко В.В.), на которую получено положительное решение (20.06.2007).
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 37 отечественных и 126 иностранных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 39 рисунками.
Использование мезенхимальных стромальных клеток в терапии инфаркта миокарда
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) - популяция клеток, формирующая систему соединительной ткани организма. МСК способны дифференцироваться в фибробласты, хондроциты, остеобласты, адипоциты, эндотелиоциты, кардиомиоциты, скелетные и гладкомышечные миоциты, стромальные элементы, формирующие гемопоэзининдуцирующее микроокружение (Шахов, Попов, 2004; Kahn J. et al., 2005; Bianco A. et al., 2000, 2001).
Источниками МСК являются костный мозг и жировая ткань. МСК имеют фибробластоподобный фенотип в культуре, образуют монослой и экспрессируют на своей поверхности CD 105, CD73, CD44, CD 166, CD90, STRO-1 (Смолянинов и др., 2005; Шахов, Попов, 2004; Marthur A., Martin J.F., 2004).
К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал, подтверждающий эффективность трансплантации МСК в поврежденный миокард. Пионерским в этой области является исследование D. Orlic (2001). В этой работе мышам-самкам в периинфарктную зону интрамиокардиально вводили МСК костного мозга здоровых самцов. В результате у оперированных мышей отмечалось появление нового полноценного миокарда с вновь воссозданными сосудистыми элементами, а регенерация миокарда за счет донорских МСК подтверждалась идентификацией в новых кардиомиоцитах мужской Y- хромосомы. В работах Zhang S. et al. (2003, 2004, 2005) на модели острого инфаркта миокарда у крыс показана возможность трансплантированных МСК участвовать в регенерации поврежденного миокарда за счет процессов кардиомиогенеза и неоангиогенеза. Через 7 суток после интрамиокардиального введения МСК отмечалось повышение в крови VEGF, увеличение плотности рецепторов к VEGF в миокарде, а через 14 суток в трансплантированных МСК выявлялись маркеры кардиомиогенной и ангиогенной дифференцировки. Подобные результаты были получены в исследованиях Piao Н. et al. (2005) и Wang J.A. et al. (2005). Nagaya N. et al. (2004) вводили МСК внутривенно крысам с инфарктом миокарда. Через 1 месяц после трансплантации меченые МСК определялись в миокарде, причем одна часть из них несла маркеры кардиомиоцитов (десмин, тропонин Т, коннексин 43), а другая - эндотелиоцитов (фактор Виллебранда). По данным морфологического исследования отмечалось уменьшение площади рубца и увеличение количества сосудов. В отличие от вышеописанных работ группа Tang Y.L. et al. (2004, 2005) в своих исследованиях не получила данных за миогенную и ангиогенную дифференцировку МСК после трансплантации в инфарцированный миокард крыс. Выявленные улучшения показателей сократительной функции миокарда и увеличение плотности капиллярного русла исследователи связали с паракринным цитопротективным действием МСК. Через 28 суток после трансплантации МСК отмечалось повышение концентрации VEGF, bFGF, SDF-1 (stromal cell derived factor) и SCF. Данные вещества, по данным Tang Y.L. et al., обладали антиапоптотическим действием, обеспечивая защиту и нормальное функционирование кардиомиоцитам, эндотелиоцитам и другим клеткам. Кругляков П.В. и др. (2005) на модели острого инфаркта миокарда у крыс изучали влияние трансплантации МСК. Было показано ускорение процессов воспаления и образования рубца, повышение васкуляризации поврежденной зоны, снижение дилятации полостей желудочков сердца. Эти же авторы, изучая влияние сроков трансплантации МСК на репарацию миокарда после инфаркта, показали, что все исследованные параметры изменялись в положительную сторону только у животных, которым МСК были введены в день моделирования инфаркта миокарда (Кругляков П.В. и др., 2004).
Клинический опыт использования МСК представлен единичными исследованиями. Данное обстоятельство объясняется сложностью получения культуры МСК, введения МСК после длительной экспансии ex vivo, малочисленностью МСК в костном мозге и их низким пролиферативным потенциалом у пожилых больных. При рождении в костном мозге на 10000 клеток приходится одна МСК, к 50 годам МСК остается очень мало - 1 на 400000, а к 80 годам - 1 на 2000000 (Беленков Ю.Н. и др., 2003). Клиническое исследование по применению МСК при остром инфаркте миокарда представлено Chen S.L. et al. (2004). В этом исследовании 34 пациентам с острым инфарктом миокарда интракоронарно вводились МСК после 10 дневного культивирования. Через 3 и 6 месяцев после трансплантации было отмечено значительное уменьшение зон гипо- и акинезии, увеличение фракции выброса левого желудочка и перфузии миокарда. В течение всего времени наблюдения не было выявлено нарушений сердечного ритма. Отечественные клинические работы по использованию МСК в лечении больных с ИБС были выполнены в Центральном научно-исследовательском рентгенорадиологическом институте, Санкт-Петербург и НИИ Трансплантологии и искусственных органов, Москва (Шумаков и др., 2003). В этих исследованиях культивированные МСК вводились интракоронарно, эффективность оценивалась через 3, 6, 9, и 12 месяцев после трансплантации. По результатам обследования пациентов было выявлено улучшение клинического течения ИБС, улучшение систолической и диастолической функции левого желудочка, увеличение перфузии и метаболизма в пораженной зоне.
Таким образом, трансплантация МСК приводит к восстановлению сократительной функции поврежденного миокарда. Однако вопросы о механизмах терапевтического эффекта МСК (кардиогенный, ангиогенный, паракринный, сочетанный), а также сроки наиболее эффективного использования клеток остаются открытым, что требует проведения дальнейших исследований в этой области.
Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга
В работе использовали нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (ЯСК) и культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК). 3.1.1. Получение ядросодержащих клеток костного мозга.
ЯСК получали двумя способами: резекционным и пункционным.
При резекционном способе животным после премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) под местной анестезией 0,5% раствором новокаина линейным разрезом в поясничной области с правой стороны осуществляли доступ к крылу подвздошной кости, отсекали мышцы и выполняли резекцию крыла. Рану послойно ушивали. В резецированном фрагменте удаляли кортикальную пластинку и механическим путем выскабливали костный мозг. Полученную костномозговую взвесь заливали питательной средой а-МЕМ (ICN, США) и осаждали центрифугированием (1000 g, 10 мин). Осадок подвергали диссоциации путем трехкратной ферментативной обработки смесью трипсин-ЭДТА (Difco, США) при 37. Затем клетки засевали в пластиковую посуду для дальнейшего культивирования (рис.5).
При пункционном способе выполняли пункцию крыла подвздошной кости после премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) под местной анестезией 0.5% раствором новокаина. Эксфузат в количестве 10 мл помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS (раствор декстрозы в цитрат-фосфатном буфере; Terumo, Япония). Полученный костный мозг фракционировали с помощью центрифугирования (1600 g, 20 мин) в градиенте плотности Перколла (63%). Образовавшееся интерфазное кольцо с ЯСК костного мозга промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+ и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали в среде а-МЕМ и использовали для дальнейшего культивирования (рис.6).
Культуру МСК получали путем культивирования ЯСК, выделенных резекционным и пункционным путем. Культивирование ЯСК проводили в среде а-МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл; Invitrogen, Великобритания) в СОг-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа в течение 3 недель. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл; ICN, США). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина (0,25%; Gibco, США) и ЭДТА (0,02% этилендиаминтетрауксусная кислота, Gibco, США).
Характеристика культур МСК.
Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат с нитросиним тетразолем, Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и смесью суданов III и IV (BDH, Великобритания) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.
Окрашивание клеток.
Для выявления введенных клеток костного мозга в миокарде перед трансплантацией их метили ядерным флуоресцентным красителем Hoechst (Sigma, США). Для этого перед трансплантацией в клеточную суспензию добавляли флуорохром в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут в СОг-инкубаторе на шейкере. Из суспензии клеток готовили препараты и изучали на флуоресцентном микроскопе. При этом ядра клеток светились ярко-голубым цветом. Перед трансплантацией производили подсчет клеток в камере Горяева, а жизнеспособность определяли с помощью окраски трипановым синим (Лабтех, Россия).
Методика оценки перфузии миокарда
Ультразвуковое эхокардиографическое исследование выполнено на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейного датчика 13 МГц. В каждой группе животных эхокардиографическое исследование выполнялось до операции, через 14 суток и 1 год после операции по стандартной методике. Эхокардиография проводилась с обязательной параллельной регистрацией ЭКГ-сигнала. Из парастернального доступа по длинной оси левого желудочка (с контролем из этого же доступа по короткой оси левого желудочка) в режиме М-модального сканирования регистрировался конечно-диастолический размер левого желудочка. Систолическую функцию левого желудочка мы регистрировали с помощью 2Б-сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фракции выброса по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхокамер. Кровоток в аорте оценивали в режиме импульсно-волновой допплерографии. Методика оценки перфузии миокарда.
Исследования проведены в отделе лучевой диагностики Центрального научно-исследовательского рентгенорадиологического института. Оценка перфузии выполнялась методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ).
1. Радиофармацевтический препарат (РФП). В работе использовался РФП Myoview (Nycomed, Великобритания), меченый технецием-99т. РФП в дозе 30-50 МБк вводился в краевую вену уха через периферический катетер. Спустя 10-15 минут после инъекции выполнялась однофотонная эмиссионная компьютерная томография.
2. Гамма-камера для ОФЭКТ. Исследования выполнены на двухдетекторной гамма-камере E.Cam. var (Siemens, Германия). Детекторы располагались параллельно друг другу под углом 180 (рис. 10). После премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) и фиксации в специальном станке кролика укладывали на кровать таким образом, чтобы визуализируемый миокард находился по центру детектора. Окно дискриминатора гамма-камеры настраивали на фотопик технеция (140 КэВ, 20%). Данные собирали на матрицу 256x256 пикселя, увеличение составляло 1,78, при этом размер пикселя был равен 1,6 мм. На каждый детектор приходилось 64 кадра, время сбора на каждый кадр составляло 20 секунд по орбите «контур тела» (рис.11).
3. Реконструкция изображения. Реконструкцию изображения проводили с использованием фильтра Shepp-Logan Hanning 0,6. Получали изображение левого желудочка в поперечной плоскости.
4. Оценка полученного изображения. В ходе реконструкции изображения получали перфузионные томосцинтиграммы миокарда левого желудочка кролика в поперечной плоскости. На томосцинтиграмме определялись отделы левого желудочка: передняя стенка, нижняя стенка, боковая стенка и перегородка (рис.12).
А - поперечный срез сердца кролика; Б - схематическое изображение левого желудочка, обозначены стенки левого желудочка; В - перфузионная томосцинтиграмма миокарда кролика, обозначены стенки левого желудочка а - левая коронарная артерия, передняя нисходящая ветвь; b - левая коронарная артерия, огибающая ветвь При моделировании инфаркта миокарда перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии, которая кровоснабжает переднюю стенку, часть боковой стенки и часть перегородки левого желудочка (рис.1 ЗА). Учитывая зону кровоснабжения лигированной артерии, на перфузионных томосцинтиграммах выделяли патологическую зону. Эта зона соответствовала передней стенке, части боковой стенки и части перегородки левого желудочка. Для сравнения на томограммах выделяли референтную зону, соответствующую перегородке левого желудочка (рис. 13Б,В).
А - поперечный срез сердца кролика, лигирована передняя нисходящая ветвь левой коронарной артерии; Б - схематическое изображение левого желудочка, обозначены стенки левого желудочка и локализация патологической и референтной зон; В - перфузионная томосцинтиграмма миокарда кролика, обозначена локализация патологической и референтной зон; а - левая коронарная артерия, передняя нисходящая ветвь; b - левая коронарная артерия, огибающая ветвь Для количественной оценки уровня перфузии миокарда использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в патологической зоне к таковому в референтной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значения пикселя в патологической и референтной зонах.
Характеристика клеток костного мозга
В результате фракционирования эксфузата костного мозга на градиенте Перколла были выделены ядросодержащие клетки. После подсчета и определения жизнеспособности клетки переносили в культуральную чашку диаметром 10 см . В ходе культивирования было показано, что начиная с 3-4 суток появлялись единичные адгезивные клетки, имеющие вытянутую форму. На 7-8 сутки адгезивные клетки формировали колонии, представленные клетками с разной морфологией: округлые, полигональные и веретиновидные. К 12-14 суткам адгезивные клетки формировали монослой, покрывая всё дно культуральной чашки. Морфологически культура становилась более гомогенной и, в основном, была представлена вытянутыми фибробластоподобными клетками. После пересева клетки вновь культивировали до образования монослоя. На 2 пассаже клетки костного мозга представляли собой гетерогенную популяцию, но в основном имели веретеновидную форму (рис.17). После ферментативной обработки и перевода клеток в суспензию их размер составлял в среднем 15-20 мкм. Общее количество клеток, полученное в ходе культивирования, составляло 2-3x106.
Для характеристики полученной культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга выполняли её окрашивание реактивами, позволяющими выявить клетки остеогенного и адипоцитарного рядов. В ходе культивирования на каждом пассаже делался отсев для проведения цитохимических реакций (на щелочную фосфатазу для выявление клеток остеогенного ряда и на нейтральные липиды для выявления клеток адипоцитарного ряда). В качестве контроля использовали культуры МСК костного мозга, дифференцированные в остеогенном и адипоцитарном направлениях. Для индукции дифференцировки в остеогенном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением р-глицерофосфата натрия (10 мМ; Sigma, США), дексаметазона (100 нМ; Sigma, США) и аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл); для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением дексаметазона (10 нМ), аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и ITS + LA-BSA (инсулин, трансферрин, селеновая кислота, линейная алкилбензосульфоновая кислота).
После окрашивания дифференцированной в остеогенном направлении первичной культуры МСК смесью реактивов BCIP-NBT выявлялись островки клеток с темно-синей цитоплазмой, положительно окрашенные на щелочную фосфатазу (рис.18). Площадь окрашенных участков составляла 27±5%. После окрашивания дифференцированной в адипоцитарном направлении первичной культуры МСК смесью суданов III и IV определялись единичные положительно окрашенные клетки. При этом клетки, содержащие в цитоплазме жирные кислоты, приобретали ярко красный цвет (рис.19).
Рис.18. Культура МСК, дифференцированная в остеогенном направлении, 1-й пассаж. Окраска на щелочную фосфатазу (контроль). Увеличение х20.
На 2-ом пассаже в культуре МСК, дифференцированной в остеогенном направлении, количество фосфатазоположительных клеток увеличивалось и составляло 40±9%. В культуре МСК, дифференцированной в адипоцитарном направлении, количество клеток, содержащих жировые включения, также увеличивалось.
Результаты цитохимический реакций в культуре МСК на всех пассажах дали отрицательный результат.
Таким образом, в результате культивирования ядросодержащих клеток костного мозга кролика была получена культура мезенхимальных стромальных клеток, представленная клетками фибробластоподобной формы и характеризующаяся отсутствием спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки. В то же время, проведенные исследования по стимуляции дифференцировки культуры МСК в остеогенном и адипоцитарном направлениях под действием индукторов указывали на их мультипотентность.
