Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литературы CLASS 13
1.1. Психопатология, нейропатология и этиология БА 14
1.2. Моделирование нейродегенеративных процессов у животных: современные подходы к моделированию болезни Альцгеймера на грызунах 17
1.3. Нейротоксины как средство моделирования симптоматики и патогенетических механизмов нейродегенеративных патологий 20
1.3.1. Моделирование когнитивных нарушений 20
1.3.2. Моделирование нейропатологических признаков ., 25
1.3.3. Холинергическая природа когнитивных нарушений при моделировании Б А 27
1.4. Окислительный стресс в патогенезе болезни Альцгеймера 29
1.4.1. Роль окислительного стресса в патогенезе болезни Альцгеймера: центральная роль р-амилоидного пептида 34
1.4.2. Окислительный стресс при моделировании БА 41
1.5. N0 и NO-сиптаза в патогенезе болезни Альцгеймера 43
1.5.1. Функции N0 и NO-синтазы в нервной системе 43
1.5.2. Роль N0 и NO-синтазы в нейродегенеративных процессах 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Работа с лабораторными животными 52
2.2. Моделирование нейродегенеративных процессов 52
2.3. Получение гомогенатов ткани мозга и сыворотки крови 53
2.4. Биохимические методы исследования 54
2.4.1. Оценка состояния процессов перекисного окисления липидов в мозге и крови 54
2.4.1.1. Определение содержания ТБКРП 54
2.4Л .2. Определение интенсивности перехвата супероксидных радикалов 55
2.4.1.3. Хемилюминесцентный метод определения генерации активных форм кислорода (ГАФК) 55
2.4.2. Радиометрический метод определения активности NOC 57
2.4.3. Определение белка 58
2.5. Морфологические методы исследования 58
2.6. Статистическая обработка данных 59
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Исследование свободнорадикальных процессов и активности синтазы оксида азота в мозге крыс после интрацеребровентрикулярного введения холинотоксина AF64A 60
3.1.1. Перекисное окисление липидов в отделах мозга крыс после введения AF64А 61
3.1.2. Генерация активных форм кислорода и
супер оке идперехватывающая активность в отделах мозга крыс после введения AF64A 64
3.1.3. Активность синтазы оксида азота в отделах мозга крыс после введения AF64A 68
3.1.4. Исследование эффектов окислительного стресса на активность синтазы оксида азота в гомогенатах мозга крыс 71
3.1.5. Активность холинацетилтрансферазы в мозге крыс после введения холинотоксина AF64A (гистохимическое исследование) 71
3.1.6. Обсуждение результатов 75
3.2. Исследование свободнорадикальных процессов и активности синтазы оксида азота в мозге крыс после
интрацеребровентрикулярного введения фрагмента (25-35) р- амилоидного пептида
3.2.1. Перекисное окисление липидов в отделах мозга крыс после введения РА(25-35)
3.2.2. Генерация активных форм кислорода и супероксидперехватывающая активность в отделах мозга крыс после введения рА(25-35) 81
3.2.3. Перекисное окисление липидов в сыворотке крыс после введения рА(25-35) 85
3.2.4. Активность синтазы оксида азота в отделах мозга крыс после введения рА(25-35) 85
3.2.5. Исследование нейродегенеративных изменений в мозге крыс, вызванных фрагментом (25-35) р-амилоидного пептида 88
3.3. Обсуждение результатов 95
Заключение 101
Выводы 103
Литература 105
- Моделирование нейродегенеративных процессов у животных: современные подходы к моделированию болезни Альцгеймера на грызунах
- Оценка состояния процессов перекисного окисления липидов в мозге и крови
- Перекисное окисление липидов в отделах мозга крыс после введения AF64А
- Активность синтазы оксида азота в отделах мозга крыс после введения рА(25-35)
Введение к работе
Актуальность исследования
В конце двадцатого века старение населения стало одной из центральных проблем, с которой столкнулось большинство развитых стран мира. Это связано как с общим улучшением жизненных стандартов, так и с достижениями современной медицины. Поэтому значительные усилия ученых в различных станах мира направлены в настоящее время на понимание фундаментальных основ и разработку методов коррекции патологий, связанных со старением организма человека. Одним из ведущих научных направлений является исследование нарушений высших функций мозга, составляющих основу различного рода деменций. Среди причин старческих деменций по мнению некоторых авторов центральное место занимает болезнь Альцгеймера (БА). Это заболевание было впервые описано как самостоятельное заболевание в 1907 г. А.
Альцгеймером и в настоящее время большинством авторов признается в качестве самостоятельной нозологической единицы. Данные о распространенности БА среди различных возрастных групп населения существенно расходятся. Принято считать, что БА не встречается среди подростков, отдельные случаи регистрируются среди людей моложе 40 лет, в 5-
10% случаев БА регистрируется у людей старше 65, тогда как в возрастной группе старше 85 - Б А является причиной деменций в 25-35% случаев (Katzman,
1993). На территории бывшего СССР БА регистрировали в 0,3-7,6% случаев от числа всех пациентов психиатрических клиник (Гаврилова, 1977; Сметанников,
1997). В последние годы во многих странах наметилась тенденция к увеличению частоты встречаемости БА. По мнению A. Katzman (2000), при отсутствии эффективных методов лечения 22 миллиона человек по всему миру будут страдать от этого заболевания в ближайшие два десятилетия. В связи с этим актуальной проблемой является выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе данного заболевания. Эта задача не может быть решена без использования моделей на животных, что позволяет с одной стороны лучше понять природу человеческих заболеваний, оценить их причины и последствия, а с другой стороны является лучшим экспериментальным инструментом для разработки и скрининга различных стратегий лечения патологий.
Наиболее распространенным подходом к моделированию нейродегенеративных патологий является использование специфических нейротоксинов. В качестве средства для моделирования Б А наиболее часто используются этил хол ин азиридиний (AF64A) и р-амилоидные пептиды (РА). К настоящему времени установлено, что эти вещества вызывают возникновение у животных амнезии, связанной с гипофункцией холинергической системы. В то же время точные механизмы, опосредующие токсические эффекты обоих веществ, остаются малоисследованными.
Одним из возможных механизмов, которые обусловливают токсические эффекты AF64A и рА, может являться окислительный стресс. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные большого числа экспериментов, проведенных на образцах аутопсийного материала, а также в культуре клеток (Greene et al., 1976; Hedley, 1992; Behl et al., 1994; Schubert et al, 1995; Richardson et al., 1996; Yan, 1996; Avdulov et al., 1997; Rinner et al., 1997; Hanin, 1998; Galeazzi et al., 1999). Антиоксиданты в значительной степени позволяют уменьшить повреждающее воздействие этих токсинов (Emerich et al., 1992; Behl et al., 1994; Thomas et al., 1996; Miranda et al., 2000). Вместе с тем прямого подтверждения участия окислительного стресса в токсичности AF64A или PA in vivo до сих пор получено не было. Указанные факты позволили определить цель и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы явилось исследование изменения свободнорадикальных процессов в отделах мозга крыс при развитии нейродегенерации в «инъекционных» экспериментальных моделях болезни
Альцгеймера у грызунов, при использовании двух видов нейротоксинов - холинотоксин этилхолин азиридиний (AF64A) и р-амилоидный пептид (рА), в частности фрагмент рА(25-35). Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить показатели свободнорадикального окисления в отделах мозга крыс (кора, мозжечок, гиппокамп) при моделировании нейродегенерации, вызванной интрацеребровентрикулярным введением нейротоксинов AF64A или pA(25-35).
Измерить активность синтазы оксида азота (NOC) в отделах мозга крыс (кора, мозжечок, гиппокамп) in vivo при моделировании нейродегенерации, вызванной интрацеребровентрикулярным введением нейротоксинов АР64А или рА(25-35).
Оценить активность NOC мозга крыс при индукции окислительного стресса in vitro.
Провести сопоставление развития окислительного стресса в мозге крыс на двух вышеуказанных моделях нейродегенерации.
Научная новизна работы
В работе впервые проведено систематическое исследование ряда значимых биохимических показателей, характеризующих процессы свободнорадикального окисления в мозге крыс в условиях экспериментально вызванной нейродегенерации in vivo.
Установлено, что интрацеребровентрикулярное введение рА(25-35) вызывает нейродегенеративные изменения в гиппокампе и коре больших полушарий крыс, сопровождающиеся усилением процессов свободнорадикального окисления в этих отделах мозга, Таким образом получены прямые доказательства, подтверждающие участие окислительного стресса в нейротоксических эффектах 0А(25-35) in vivo.
Впервые показано, что холинергичеекая нейродегенерация, вызванная интрацеребровентрикулярным введением холинотоксина AF64A, сопровождается развитием окислительного стресса в отделах мозга крыс.
Впервые продемонстрирована динамика изменений активности NOC после введения рА(25-35) и AF64A. РА(25-35) вызывает кратковременное снижение активности фермента в гиппокампе и неокортексе, сменяющееся существенным увеличением активности NOC в неокортексе. Введение AF64A вызывает более длительное снижение активности нейрональной NOC в гиппокампе.
В экспериментах in vitro впервые установлено, что окислители (пероксид водорода и гипохлорит натрия) вызывают дозозовисимое падение активности сиптазы оксида азота в гомогенатах коры больших полушарий.
Впервые продемонстрированы особенности развития окислительного стресса после введения рА(25-35) и AF64A. 0А(25-35) вызывает медленное и продолжительное (по крайней мере в течение 30 дней) накопление продуктов свободнорадикалыюго окисления, тогда как введение AF64A приводит к быстрой активации процессов свободнорадикального окисления, достигающей максимального уровня в течение первых 5 дней после введения хол иного ксииа.
Теоретическое значение работы
В работе рассмотрены патофизиологические механизмы возможной связи между свободнорадикальными процессами, включая генерацию оксида азота, и холинергическои нейродегенерацией, вызванной двумя различными нейротоксинами. Выявлены закономерности развития окислительного стресса в зависимости от использованного нейротоксина (быстро развивающийся окислительный стресс и последующая холинергическая нейродегенерация при центральном введении AF64A и медленное усиление свободнорадикальных процессов в результате введения рА(25-35)). Сделан фундаментальный вывод о том, что окислительный стресс может быть одним из важнейших молекулярных механизмов, опосредующих холинергическую нейродегенерацию.
Практическое значение работы
Практическая ценность работы состоит в развитии моделей холинергическои дегенерации и получении практически важных характеристик этих моделей. Из использованных моделей наиболее перспективной представляется модель с использованием агрегированного нейротоксичного фрагмента рА, поскольку именно для этой модели показано развитие амнезии альцгеймеровского типа у крыс (Степаничев и соавт., 1997; Stepanichev et al., 2003; 2004). Подтверждение вовлеченности окислительного стресса в механизмы нейродегенерации при центральном введении агрегированного нейротоксичного фрагмента РА принципиально важно для разработки патогенетически направленной коррекции когнитивных расстройств, связанных с холинергической нейродегенерацией. Модель может быть использована как для дальнейшего, более глубокого исследования молекулярных механизмов болезни Альцгеймера, так и для скрининга лекарственных препаратов для лечения этого заболевания.
Положения, выносимые на защиту
Моделирование нейродегенерации путем центрального введения холинотоксина AF64A или агрегированного нейротоксичного фрагмента р-амилоидного пептида приводит к развитию окислительного стресса в определенных областях мозга крыс.
Динамика окислительного стресса зависит от природы нейротоксина и исследуемого отдела мозга.
Окислительный стресс может быть одним из важнейших молекулярных механизмов холинергической нейродегенерации.
Апробация диссертации
Основные результаты работы доложены на съезде федерации Европейских физиологических обществ (Маастрихт, 1995), 1-м региональном конгрессе FAONS (Патайя, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе физиологических обществ (Санкт-Петербург, 1997), конференциях Американского общества по нейронаукам (Вашингтон, 1996, Новый Орлеан, 1997), 12-м съезде Европейского нейрохимического общества (Санкт-Петербург, 1998), Европейском форуме по нейронаукам (Берлин, 1998), Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова: Новое в концепциях о механизмах ассоциативного обучения и памяти (Москва, 1999), Международной школе по биокибернетике «Память и эмоции» (Неаполь, 1999), конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), XXX Всероссийском Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000), конференции Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Перуджа, 2001), 14-м съезде Европейского нейрохимического общества «Достижения в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Варшава, 2003) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНДиНФ РАН.
Моделирование нейродегенеративных процессов у животных: современные подходы к моделированию болезни Альцгеймера на грызунах
Для понимания механизмов развития БА принципиально важной представляется разработка этиологической модели заболевания на животных, сочетающей ее когнитивные и нейропатологические признаки. Создание модели БА на животных имеет целый ряд трудностей как методического, так и методологического характера. Это связано с одной стороны с многофакторной этиологией Б А, включающей как генетические, так и негенетические факторы. С другой стороны - с особенностями моделирования различных патологических процессов у животных. Моделирование на животных может иметь различную специфику в зависимости от поставленой задачи. С этой точки зрения модели могут отражать отдельные симптомы заболевания, сходные с клиническим течением конкретного заболевания. Вторым важным аспектом моделей является сходство патофизиологических механизмов течения заболевания в клинике и у животных. Третьим по счету, но не менее важным моментом является приемлемость данной модели для тестирования вероятных методов лечения какой-либо патологии.
БА - нейродегенеративное заболевание, которое приводит к нарушению деятельности отделов головного мозга, связанных с когнитивными функциями. В связи с этим может быть использован ряд стратегий для моделирования Б A in vivo в зависимости от конечной цели, например: исследования природы нарушения того или иного вида памяти или механизмов, лежащих в основе гибели нейронов. К традиционным моделям, которые использовали как в экспериментах на грызунах, так и в работах на приматах следует отнести введение антагонистов мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, таких как скополамин, или повреждение определенных структур мозга. К последней категории относятся модели, включающие разрушение крупноклеточного базального ядра, септо-гиппокампального пути или гиппокампа, которые могут быть реализованы различными средствами, например при помощи возбуждающих аминокислот (ТЧ-метил-Б-аспартата, каината, хинолината, квискволата и т.п.). Как правило, эти модели позволяют получить у животных нарушения обучения и памяти, которые в большей или меньшей степени связаны с гипофункцией холинергической системы. Критический обзор этих моделей был дан в работе М. McDonald и В. Overmeier (1998). Такой подход позволяет получить так называемые аналогичные модели - моделировать поведенческий и холинергический дефицит у животных, однако без характерной патоморфологической картины течения БА (т.е. без образования амилоидных бляшек и НФС).
В конце 1980-х - 1990-х годах были разработаны новые подходы к моделированию БА на животных, прежде всего грызунах. Среди них можно выделить использование интрацеребральных инъекций специфических холинотоксинов, таких как AF64A или 192-rgG-canopHH (Walsh, 1998), а также различных фрагментов РА. Кроме того, было создано по крайней мере 16 линий трансгенных мышей (ТМ), которые активно исследуются различными группами (Janus, Westaway, 2001; Blanchard et al., 2003; Kurt et al., 2003; Oddo et al., 2003).
У ТМ наблюдается увеличение биосинтеза БПА, что ведет к повышению его концентрации в мозге, нарушению метаболизма и образованию отложений рА (Quon et al., 1991; Games et al., 1995; Oster-Granite, 1996; Capsoni et al., 2000; Kane et al., 2000). Образование депозитов рА приводит к нарушению синаптической пластичности в гиппокампе. В частности G. Seabrook et al. (1999) обнаружили нарушение механизма длительной потенциации (ДП) в гиппокампе ТМ с оверэкспрессией БПА. ТМ характеризуются нарушением процессов обучения и памяти. Вместе с тем следует отметить, что использование мутантных животных имеет определенные проблемы. Одной из таких проблем следует признать отсутствие выраженной неиродегенерацин в мозге этих животных, несмотря на наличие довольно большого числа амилоидных бляшек (Games et al., 1995). Более того, до сих пор не удалось добиться образования НФС, а нарушения памяти у ТМ проявляются в разном возрасте в зависимости от линии животных. В некоторых тестах, например, при выработке условной реакции пассивного избегания (УРПИ), авторам не удалось наблюдать нарушений обучения и памяти (Seabrook et.al., 1999), а снижение эффективности обучения в водном лабиринте может быть связано с нарушениями способности мышей к плаванию и моторным дефицитом (Yamaguchi et al., 1991). Несмотря на это такой подход является безусловно перспективным. Совершенствование молекулярно-генетических методов и возможное сочетание нескольких генетических нарушений (например, сочетание мутаций в пресенилинах и оверэкспрессии БПА у одного животного) поможет добиться прогресса в развитии моделирования БА на грызунах.
AF64A - токсический аналог холина, который был исходно предложен в качестве холинергического нейроспецифичного токсина. Установлено, что в малых дозах (1-3 нмоль) AF64A вызывает продолжительную холинергическую гипофункцию (Hanin et al., 1987) и гибель холинергических нейронов в медиальном септуме (Chrobak et al., 1988; Lorens et al., 1991). Холинергическая гипофункция сопровождается когнитивными нарушениями, установленными в различных поведенческих тестах, позволяющих оценить состояние пространственной рабочей памяти у крыс (Chrobak et al., 1988; Walsh et al., 1994; Hanin, 1996). Более подробно эти вопросы будут рассмотрены ниже.
Нейротоксические свойства целого пептида рА(1-42) сохраняются и у ряда фрагментов, в частности характерны для фрагмента рА(25-35). РА(25-35), нейротоксичный фрагмент бета-амилоидного пептида (Pike et al., 1995), широко используется в последние годы для изучения механизмов, вовлеченных в поведенческие, клеточные и молекулярные нарушения, характерные для Б А. Введение рА(1-40) или РА(25-35) мышам и крысам приводит к возникновению амнезии альцгеймеровского типа, что выражается прежде всего в нарушении рабочей памяти (Степаничев и соавт., 1997; Sigurdsson et al., 1995, 1996, 1997а; Maurice et al., 1996; Chen et al., 1996a, 1996b; Terranova et al., 1996; Stepanichev et al., 1997a; Morimoto et al., 1998). Центральное введение PA(25-35) мышам вызывает нарушения памяти, сопровождающиеся нейродегенерацией и холинергической дисфункцией (Maurice et al. 1996). Важно заметить, что нарушения поведения, вызываемые рА наблюдаются после острой инъекции и происходят при отсутствии накоплений рА в мозге. Это особенно интересно с точки зрения патофизиологии и симптоматики БА (McDonald, Overmier, 1998). Известно, что специфические нарушения памяти при БА происходят в первые несколько лет развития болезни, когда значительных накоплений рА в форме бляшек еще не наблюдается (Braak, Braak, 1991). Следовательно острые введения рА могут служить моделью для изучения изменений в мозге, наблюдаемых на ранних стадиях Б А.
Современные методы моделирования БА на животных позволяют не только воспроизводить отдельные симптомы этого заболевания, но и исследовать механизмы, лежащие в основе нейродегенеративных процессов в мозге.
Оценка состояния процессов перекисного окисления липидов в мозге и крови
Состояние процессов ПОЛ в тканях исследовали с применением широко известного метода, основанного на определении содержания ТБКРП. Определение ТБКРП проводили по методу, предложенному Н. Ohkawa et al. (1979), согласно которому биологический материал нагревают в ацетатном буфере (рН 3,0 - 3,5) в присутствии додсцилсульфата натрия и ТБК в течение 1 часа до полного развития окраски. Кроме того, использовали метод, описанный В.Е. Каганом с соавт. (1979), при котором проводят нагревание исследуемых образцов с ТБК в Трис-буфере (рН 7,4) в присутствии трихлоруксусной кислоты до и после индукции ПОЛ ионами железа (II) и аскорбата в течение 1 часа при 37 С. Содержание ТБКРП определяли в обоих случаях по разности оптических плотностей при 535 и 560 нм.
2.4.1.2. Определение интенсивности перехвата супероксидных радикалов
Величину СПА определяли методом, основанным на генерации супероксидного радикала системой феназинметасульфат/НАДН и восстановлении нитросинего тетразолия с образованием синего формазана. Оптическую плотность накопления последнего измеряли при 560 нм (Nishikimi et al., 1972, Gulyaeva et al., 1990).
За единицу активности принимали количество СОД — основного фермента антирадикальной защиты мозга, - обеспечивающее снижение скорости восстановления акцептора электронов на 50%. Для удобства расчетов использовали величину степени ингибирования (СИ) скорости восстановления нитросинего тетразолиевого, рассчитанную по формуле:
V (контроль) - V (опыт)
СИ = х 100,
V(контроль)
где V (контроль) и V (опыт) - скорость восстановления нитросинего тетразолиевого в отсутствии и присутствии СОД (биологического материала) соответственно.
Метод Н202-индуциро ванной люминол-зависимой хемилюминесценции позволяет оценить потенциальную способность ткани к ГАФК. Люминол вступает в прямое химическое взаимодействие с АФК, в частности, с гидроксильным и супероксидным радикалами, и в результате ряда внутримолекулярных перестроек образуется 3-аминофталат в возбужденном электронном состоянии. Переход 3-аминофталата в основное состояние сопровождается испусканием кванта света (Владимиров и соавт., 1991). Разложение Н2О2 и ГАФК зависят от присутствия в пробах с биоматериалом металлов переменной валентности (в основном железа), что подтверждается результатами ингибиторного анализа с применением хелаторов железа -диэтилтриаминопентоуксусной кислоты и десферала (Моисеева и соавт., 1995). Интенсивность хемилюминесценции определяется соотношением эндогенных перехватчиков свободных радикалов (НАДФН, восстановленный глутатион, аскорбат, а-токоферол и др.) и металлов переменной валентности. В данной системе могут протекать следующие реакции образования АФК, которые взаимодействуют с люминолом и инициируют хемилюминесценцию (Halliwell, Gutteridge, 1989):
1. Реакция Фентона
Fe2+ + Н202 - Fe34" + ОН + ОН"
2. Fe3+ в дальнейшем может восстанавливаться Н202, но эта реакция протекает медленно и в несколько стадий: Fe3+ + Н2О2 = промежуточный комплекс = Fe2+ + О2- + 2Н+
3. OH + H2O2 = H2O + FT+O2 4. 02 + Fe3+ = Fe2+ + 02
5. ОН + Fe2+ = Fe3+ + ОН"
Для оценки ГАФК показатели индуцированной перекисью водорода люминол-зависимой ХЛ регистрировали на отечественном хемилюминометре ХЛМ-ЗМ при 20С, используя метод определения, модифицированный нами для применения к исследованию нервной ткани (Моисеева и соавт., 1995; Gulyaeva et al.,1994).
Согласно этому методу к буферу (рН 7,4), содержащему 20 мМ КН2РО4 и 115 мМ КО, прибавляли 50 мкл 0,34 мМ люминола и 200 мкл разведенного в 400 раз супернатанта; реакцию запускали добавлением Н2О2 (конечная концентрация 14 мМ). Контрольные образцы не содержали аликвот биологического материала. Показатели ХЛ - максимум быстрой вспышки (max) (отражает интенсивность ХЛ) и светосумма (S) (общее количество АФК) -пересчитывали в процентах по отношению к контролю. Результаты ингибиторного анализа перекись-индуцированной люминол-зависимой ХЛ свидетельствуют о том, что в данной системе индукции свободнорадикального окисления исходно происходит, возможно, металлозависимая продукция преимущественно супероксида и синглетного кислорода, а таюке ОН. Добавление супернатанта мозга вызывает генерацию АФК, по-видимому, такого же состава, как и в системе без биоматериала (Моисеева и соавт., 1995). Этот метод позволяет охарактеризовать потенциальную способность ткани к образованию некоторых АФК.
Перекисное окисление липидов в отделах мозга крыс после введения AF64А
Следует отметить, что стресс и физическая травма, которые животные получают от операционного воздействия, способны сами по себе вызывать существеные сдвиги в процессах ПОЛ в мозге. Поэтому мы провели сравнительное исследование параметров, характеризующих ПОЛ в мозге интактных крыс и крыс группы ЛО. Было обнаружено, что даже введение искусственной спинномозговой жидкости животным приводит к значительному увеличению уровня ТБКРП в сравнении с интактными животными (рис. 2). Это увеличение было достоверным в группе ЛО в 1-5 дни после операции (р 0.01, t-тест Стьюдента), Увеличение содержания ТБКРП относительно интактного контроля наблюдалось также и в отделах мозга животных, получивших инъекцию AF64A (р 0.01). Вместе с тем имелись достоверные отличия этого показателя окислительного стресса в группе AF64A от крыс группы ЛО. Эффект AF64A на уровень ТБКРП существенно отличался в зависимости от исследуемого отдела мозга и времени после введения. Так, содержание ТБКРП в гиппокампе и в коре больших полушарий было значительно выше (примерно на 25-40%) в группе AF64A относительно группы ЛО в 1-ый день после операции, однако к 5-му дню после операции базальный уровень ТБКРП был значительно ниже (на 20-30%) во всех областях мозга в группе AF64A.
Индукция ПОЛ железом/аскорбатом в супернатантах мозга в течение 60 мин. вызывала 14-кратное увеличение уровня ТБКРП в разных отделах мозга интактных животных по сравнению с базальными значениями. Операционный стресс снижал накопление ТБКРП после индукции железом/аскорбатом как в группе ЛО, так и в группе AF64A (рис.3). Вместе с тем, у крыс с AF64A индуцированное железом/аскорбатом накопление ТБКРП было значительно выше, чем у крыс группы ЛО как на 3-ий (51-91%) так и на 5-ый (31-54%) дни после операции (Р 0,01, t-тест Стьюдента). Этот эффект был выражен в гиппокампе и коре больших полушарий и не наблюдался в подкорковых структурах.
Экспериментальное воздействие приводило к усилению ГАФК, регистрируемой по показателям индуцированной перекисью водорода ХЛ. Увеличение показателей ХЛ на 12-18% в 1-ый день после операции было отмечено в группах ЛО и AF64A по сравнению с интактным контролем (рис. 4). Рост ГАФК был еще более выражен (35-67%-ный рост ХЛ) в этих двух группах в 3-иЙ и 5-ый дни после операции. Указанные изменения имели место во всех исследованных отделах мозга. Единственным заметным эффектом нейротоксина было достоверное снижение показателей ХЛ в 5-ый день после введения в гиппокампе крыс группы AF64A в сравнении с группой ЛО (р 0.05).
Исследование генерации и перехвата супероксидиого анион-радикала не выявило различий между двумя экспериментальными группами и интактными крысами по СПА в коре больших полушарий. Таким образом, показатели СПА в коре практически не зависели от операционного воздействия, тогда как в гиппокампе и подкорковых структурах наблюдалось существенное преобладание генерации супероксидного анион-радикала в группе ЛО относительно интактного контроля на 3-ий день после операции.
СПА не различалась во всех изученных областях мозга крыс ЛО и AF64A в 1-ый день после операции (рис. 5). В дальнейшем достоверный рост СПА был отмечен в гиппокампе крыс группы AF64A. Так более высокая в сравнении с группой ЛО СПА была отмечена в гиппокампе крыс AF64A на 3-ий (Р 0.05) и 5-ый (РО.01) дни после введения и в подкорковых структурах на 3-ий (Р 0.05) день после воздействия. Необходимо отметить, что увеличение СПА в гиппокампе животных группы AF64A было длительным и сохранялось на более высоком уровне по сравнению с группой Л О даже через 126 дней (18 недель) после операции (таб. 3).
Примечания: Для СПА данные представлены в виде M±S.E.M в усл.ед. по редукции нитросинего тетразолия - доля ингибирования (перехватывающая активность, положительные значения) или генерации (генерирующая активность, отрицательные значения) супероксида. Для ХЛ данные представлены в виде M±SEM в усл. ед. - р 0.05, достоверность различий между группами AF64A и ЛО. Для всех групп п=7
Активность синтазы оксида азота в отделах мозга крыс после введения рА(25-35)
Введение рА(25-35) вызывало изменения активности NOC в коре больших полушарий и гиппокампе крыс (рис. 13; табл. 9). Так, в гиппокампе крыс группы AM наблюдалось достоверное кратковременное снижение активности NOC на 40% по сравнению с группой ЛО (р 0.05). Активность NOC в гиппокампе постепенно восстанавливалась до уровня группы ЛО и через 30 дней после операции увеличивалось на 43% по отношению к группе ЛО, однако это увеличение не было достоверным из-за больших индивидуальных различий у животных группы AM. В коре больших полушарий существенное снижение активности NOC наблюдалось на 3-ий день после введения пептида (на 38% по сравнению с группой ЛО; рО.ОЗ). На 5-ый день после операции в этом отделе мозга было обнаружено достоверное увеличение активности NOC на 66% по сравнению с группой ЛО. Следует отметить, что уменьшение активности NOC в течение первых дней после операции в коре и гиппокампе предшествовало накоплению ТБКРП на 5-ый и 3-ий дни соответственно (рис. 9). В коре снижение NOC соответствовало увеличению генерации супероксида на 5-ый день (рис. 11). 88
Исследование нейродегенеративных изменений в мозге крыс, вызванных фрагментом (25-35) р-амнлоидного пептида
В срезах мозга интактных животных и крыс группы ЛО морфологические характеристики большинства нейронов соответствовали норме. У этих животных единичные хроматофильные нейроны и незначительное число поврежденных нейронов были обнаружены в неокортексе, поле СА1 гиппокампа и в первичной ольфакториой коре. Отложения рА не были обнаружены в структурах переднего мозга всех изученных животных из этих групп.
Для исследования эффектов рА(25-35) использовали срезы мозга животных, которые были взяты через 1 и б месяцев после инъекции. Через 1 месяц после введения ЗА(25-35) было обнаружено большое число хроматофильных и ацидофильных нейронов во фронто-париетальной моторной области неокортекса (рис. 14 а, 14 в), гиппокампе (рис. 14 с), в ретросплениальной (цингулярной) коре, первичной ольфакториой коре, а также в базальных ядрах переднего мозга. В неокортексе некротические нейроны были локализованы, главным образом, в III и V слоях. В некоторых случаях было отмечено колоночное расположение ацидофильных (некротических) нейронов (рис. 14 в). Примечательно, что в целом ряде случаев некротические нейроны в неокортексе были найдены вблизи кровеносных сосудов (рис. 14 d). Нам не удалось выявить отложений рА в структурах переднего мозга экспериментальных животных.
Через 6 месяцев после интрацеребровентрикулярной инъекции рА(25-35) также наблюдалось большое число хроматофильных нейронов в срезах мозга, окрашенных по Нисслю. Хроматофильные нервные клетки были обнаружены, главным образом, в неокортексе и гиппокампе (рис. 15 в, 15 d; рис. 16 а). Единичные хроматофильные нейроны были локализованы в таламусе, гипоталамусе и миндалине. Однако, в отличие от крыс, исследованных через 1 месяц после операции, острых некротических изменений в структурах мозга на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином и ванадиево-кислым фуксином-толуидиновым синим, не было обнаружено.
В неокортексе животных, получивших РА(25-35), наблюдалась активация сателлитной микроглии и нейронофагия (рис. 16 Ь; 16 с). Эти изменения были еще более выражены в базальных ганглиях переднего мозга (рис. 17 Ъ; 17 с; 17 d).
Количественный анализ числа интактных и поврежденных нервных клеток был проведен во фронто-париетальной и фронтальной коре и в поле СА1 гиппокампа. Было установлено, что введение рА(25-35) приводило к снижению числа нейронов на 19.8% в поле СА1 гиппокампа в сравнении с контрольными животными (р 0,05). Данные, приведенные в таблице 10, показывают, что аналогичный эффект наблюдался во фронтальной и фронто-париетальной коре. Вместе с тем уменьшение числа нервных клеток было более значительным, чем в гиппокампе. Так, число нервных клеток снизилось после введения рА(25-35) во фронтальной коре на 25.7% и во фронто-париетальной коре па 23.9%. Кроме того, в указанных отделах мозга резко возрастало число поврежденных нервных клеток (табл. 10).