Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1 Патогенетические механизмы развития атопии. Атопический дерматит как экологически обусловленное заболевание 12
1.2 Механизмы воздействия ксенобиотиков на организм ребенка 16
1.3 Система биотрансформации ксенобиотиков как механизм адаптации к воздействию токсических веществ 20
1.4 Суперсемейство глутатион S-трансфераз: структура и свойства 23
1.5 Полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков и предрасположенность к заболеваниям *. 27
Глава II. Материалы и методы исследования 31
2.1 Клиническая характеристика группы детей с атопическим дерматитом...33
2.2Характеристика группы контрольной группы 1 41
2.3 Характеристика группы контрольной группы II 42
2.4 Клинические, аллергологические и иммунологические методы исследования 42
2.5 Генотипические методы исследования 44
2.5.1 Реактивы 44
2.5.2 Оборудование 44
2.5.1 Получение образцов крови и выделение ДНК 45
2.5.2 Определение генотипов GSTM1 и GSTT1 45
2.6 Статистическая обработка результатов исследования 50
Глава III. Результаты собственных исследований 53
3.1 Ассоциация полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и ТІ с риском развития атопического дерматита у детей 53
3.2 Связь генотипов GSTT1 и GSTM1 с особенностями клинического течения атопического дерматита 59
3.3 Данные аллергологического обследования у детей с различными генотипами GSTM1 и GSTT1 70
3.4 Влияние пассивного курения на предрасположенность и особенности клинического течения атопического дерматита у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTT1 76
3.5 Эффективность терапии атопического дерматита у детей с различными генотипами GSTM1 и GSTT1 79
Глава IV. Обсуждение полученных результатов 84
Выводы 98
Список цитируемой литературы 100
- Механизмы воздействия ксенобиотиков на организм ребенка
- Суперсемейство глутатион S-трансфераз: структура и свойства
- Определение генотипов GSTM1 и GSTT1
- Влияние пассивного курения на предрасположенность и особенности клинического течения атопического дерматита у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTT1
Введение к работе
Актуальность проблемы: По данным эпидемиологических исследований, проведенных в рамках программы ISAAC (International study of astma and allergy in childhood), удельный вес атопического дерматита в общей структуре детской заболеваемости составляет от 3% до 18,5% (Хаитов P.M. и соавт. 1998; Кондюрина Е.Г. и соавт., 2003; Vichyanond Р., 1998; Montefort S., 2002; Di Domenicantonio R. et al, 2003). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью атопического дерматита, но и ранним началом заболевания, частым формированием сочетанных, торпидных и инвалидизирующих форм (Торопова Н.П., Синявская О.А. 1993.1997; Балаболкин И.И. 1998, 1999; Казначеева Л.Ф. и соавт., 2000; Ревякина ВА., 2000,2001).
В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль генетической
предрасположенности в развитии атопического дерматита: подчеркивается роль
семейной отягощенности по аллергическим заболеваниям, определен ряд «генов-
кандидатов», предрасполагающих к развитию атопии (Горланов И.А., 1999; Фрейдин
М.Б. и соавт. 2000; Cookson W.O.S.M., 1996; Tanaka К. et al., 1999; Takabayashi A. et
al., 2000; Sandford A.J., 2000; Wollenberg A., 2000). В то же время, высокая значимость
генетических признаков еще не составляет фенотипа заболевания, реализация
которого требует сочетания наследственной предрасположенности с воздействием
факторов внешней среды (Студеникин М.Я., 1998; Gilliland F.D. et al., 2002). К числу
таких факторов помимо аллергенной нагрузки относят социально-гигиенические,
социально-экономические, климато-гео графические, психоэмоциональные,
инфекционные экологические (Балаболкин И.И., 1991, 1999; Огородова Л.М., Козина О.В., 2002; Helms P.J., 2001; Wuthrich В., 2001).
Многие авторы подчеркивают значимость экологического фактора в формировании хронической патологии органов и систем ребенка, среди которых первое ранговое место занимают аллергические заболевания (Ефимова А.А. 1995; Студеникин МЛ. и соавт., 1998; Вельтищев Ю.Е., 2000). Увеличение заболеваемости атопическим дерматитом за последние десятилетия связывают в первую очередь с нарастающим загрязнением окружающей среды, так как величина носительства генетического «груза», предрасполагающего к развитию атопии, не могла кардинально измениться за столь короткий промежуток времени (Ревякина В.А., 2000; Beylot С. et al., 1998; Ring J.et al., 1999). Авторы в своих работах указывают, что заболеваемость атопическим дерматитом среди детей, проживающих в городах с высоким уровнем загрязненности, в среднем в 3 раза выше, чем в относительно «чистых» районах (Балаболкин И.И., 1999; Нечаева Н.И., 1999; Leung D.Y.et al., 2001; NicolaiT., 2002; Stipic-Markovic A., 2003).
Ксенобиотики оказывают прямое и опосредованное токсическое действие на органы и системы ребенка. К ряду ксенобиотиков у детей формируется специфическая сенсибилизация (Скепьян Н.А., 2000). В процессе эволюции организм выработал определенные механизмы адаптации к воздействию токсичных экзогенных и эндогенных веществ, суть которых сводится к процессам биотрансформации, осуществляемым ферментами биотрансформации ксенобиотиков, и элиминации (Гуляева Л.Ф. и соавт., 2000; Ляхович В.В. и соавт., 2000). В реализации аллергенных свойств ксенобиотиков существенное значение имеют ферменты 2-ой фазы биотрансформации - татион &іТртимфшцлл lUM,ta которые и р у ю т конъюгацию глутатиона с Множествр^Чяе*J^?«v№i5f соединений, что облегчает
выведение молекул ксенобиотика и таким образом уменьшается количество потенциально аллергенных молекул (Arita М., 1998; Lutz W., 2001; Gffliland F.D.et al., 2002). Субстратами GST являются широко распространение загрязнители окружающей среды: продукты сгорания бензина, органические растворители, побочные продукты синтеза пластиков. Глутатион S-трансферазы участвуют не только в метаболизме ксенобиотиков, но и широкого ряда эндогенных веществ, играющих важную роль в воспалительных и аллергических реакциях (лейкотриен А4, простагландин А2, J2, гидроперикиси жирных кислот, перекись водорода) (Fryer A. Et al., 2000; Hayes J.D., 2000; Kerb R. et al., 1997; Sheehan I, 2001).
В последнее десятилетие проведены исследования посвященные изучению роли глутатион S-трансфераз в развитии генетически детерминированных, но в большой степени зависящих от факторов внешней среды заболеваний, в первую очередь онкологических (Ляхович В.В., 1997; Вавилин В.А., 2000; Макарова СИ., 2000; Arrada V.R. et al, 2001; Rebbeck T.R.,1997; Katoh T. et al., 1998; Strange R.C. et al, 2001). Изучена роль GST в развитии атопической бронхиальной астмы - заболевания сходного с атопическим дерматитом1 во многих звеньях патогенеза (Гавалов СМ. и соавт., О.А. 2000; Вавилин В.А., 2000; Иващенко Т.Э. и соавт.,2001; Фрейлин М.Б. и соавт., 2002; ЖеленинаЛ.А. 2003;. Kabesch М., 2000).
Однако, несмотря на высокую распространенность атопического дерматита среди детского населения, явную связь заболевания с макро- и микро-экологическими факторами, до настоящего времени остается не изученной роль глутатион S-трансфераз в предрасположенности к атопическому дерматиту и формировании клинических особенностей заболевания у детей.
Необходимость изучения механизмов формирования предрасположенности к атопическому дерматиту, факторов, поддерживающих течение заболевания, уточнения прогностических признаков, имеющих значение для формирования групп риска и разработки индивидуальных программ оптимизации терапии и профилактики неблагоприятного течения АД определила актуальность данной работы.
Цель исследования: Изучить ассоциацию полиморфизма генов глутатион S-трансфераз классов Ml и ТІ с риском развития атопического дерматита и особенностями клинического течения заболевания.
Задачи исследования:
Изучить встречаемость генотипов глутатион S-трансфераз Ml и ТІ у детей больных атопическим дерматитом и здоровых детей без признаков атопии.
Исследовать роль генотипов GSTM1 и GSTT1 в формировании риска развития атопического дерматита и выявить их связь с клиническими особенностями течения заболевания.
Исследовать влияние пассивного курения на предрасположенность к атопическому дерматиту и его течение у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTTL
Оценить эффективность терапии у детей с атопическим дерматитом с учетом генотипов глутатион-S- трансфераз Ml и ТІ.
Определить генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза атопического дерматита основанные на полиморфизме генов глутатион S-трансфераз Ml и ТІ.
Научная новизна: Впервые дана характеристика частоты встречаемости полиморфных аллелей глутатион S-трансфераз Ml и ТІ у детей, больных
атопическим дерматитом. Установлено, что нуль-генотип GSTTJ является фактором риска развития атопического дерматита.
Впервые показана роль мутаций генов глутатион S-трансфераз Ml и ТІ в формировании клинических особенностей атопического дерматита у детей. Выявлена связь полиморфизма GSTM1 с длительным сохранением симптомов заболевания на фоне стандартной терапии АД.
Впервые выявлено, что нуль-генотип GSTM1 является фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита, диффузного поражения кожи и предрасполагает к частым обострениям и раннему появлению пролиферативных изменений на коже.
Определены генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза атопического дерматита, на основании оценки полиморфизма генов глутатион S-трансфераз Ml и ТІ.
Практическая значимость: При проведении исследований получены новые данные о генетических факторах предрасположенности к атопическому дерматиту у детей, что имеет значение при формировании группы риска по развитию заболевания.
Определение полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 может рекомендоваться для раннего определения прогноза клинического течения атопического дерматита у детей. Полученные данные позволяют на начальных этапах оценить риск развития тяжелых, форм атопического дерматита, разработать индивидуальную программу профилактики неблагоприятного течения АД.
Внедрение результатов исследования: Результаты исследования внедрены в практику работы Новосибирского областного аллергодерматологического центра (МУЗ МДКБ № 1, г. Новосибирск).
Основные положения исследования включены в процесс подготовки студентов, врачей-интернов, клинических ординаторов на кафедре госпитальной педиатрии Новосибирской государственной медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
Нуль-полиморфизм глутатион S-трансферазы ТІ в исследуемой популяции ассоциирован с предрасположенностью к атопическому дерматиту.
Нуль-генотипы GSTM1 и GSTT1 являются прогностическими факторами неблагоприятного течения атопического дерматита, при этом роль GSTM1-генотипа является доминирующей.
Комбинация мутантных генотипов GSTM1 и GSTT1 ассоциирована с риском развития атопического дерматита и является наиболее неблагоприятной для прогноза течения заболевания.
Пассивное курение увеличивает риск развития диффузного поражения кожи у детей с генотипами GSTM1- и снижает величину устойчивости к развитию атопического дерматита у детей с комбинацией генотипов GSTM1+/GSTT1+. Апробация- материалов диссертации: Основные положения диссертации
доложены на семинаре Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, 2002); на XII научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 23-25 апреля (Новосибирск, 2002); на второй межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» 1-3 октября (Новосибирск, 2003); на III Всероссийском съезде детских аллерологов 9-11 декабря (Москва 2003).
Автором опубликовано 13 научных работ по теме диссертации.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, главы с результатами собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 237 источников (из них 88 отечественных и 149 зарубежных). Работа иллюстрирована 17 рисунками и 28 таблицами.
Механизмы воздействия ксенобиотиков на организм ребенка
Существуют тысячи загрязнителей, оказывающих прямое и опосредованное токсическое действие на организм. Наиболее восприимчивыми к ним являются дети. Это можно объяснить следующими причинами: во 16 первых, еще в антенатальном периоде дети подвержены воздействию вредных факторов окружающей среды, во-вторых, анатомо-физиологические особенности детского организма определяют высокую проницаемость биологических барьеров, высокий уровень обмена веществ, незрелость ферментных систем детоксикации, недостаточность компенсаторных защитных механизмов, системного и местного иммунитета [18; 19; 38; 54; 79; 92; 142; 193;230]. Дети с атопической наследственностью еще более чувствительны к воздействию ксенобитиков, так как у них генетически детерминирована повышенная проницаемость и нестабильность клеточных мембран, аномальная направленность иммунного ответа [25; 44]. Влияние химических загрязнителей неоднозначно. Реакция организма на воздействие ксенобиотика зависит от предшествующего состояния здоровья ребенка, генетической предрасположенности, реактивности организма, концентрации, длительности воздействия токсического вещества.
Изменения в органах и системах неспецифичны, исключая случаи острого отравления, поэтому выявить четкую взаимосвязь между тем или иным химическим агентом и клинической картиной заболевания достаточно сложно (учитывая преморбидный фон) [19; 24; 33; 39; 87; 88; 92]. Наиболее часто регистрируется взаимосвязь концентрации загрязняющих веществ в окружающей среде с уровнем заболеваний тех органов и систем, которые выполняют барьерные функции: дыхательной, пищеварительной, иммунной, выделительной, а также печени и кожи [87]. Влияние химических веществ на развитие аллергических заболеваний, в том числе и атопического дерматита связано со многими факторами: вызванном ими дисбалансом иммунной, эндокринной систем, изменением метаболической активности, снижением барьерной функции органов и систем [11; 35; 57; 177, 182]. Воздействие солей тяжелых металлов часто вызывает развитие иммуносупрессии: снижение уровня иммуноглобулинов (IgG), комплемента, угнетение антителозависимой цитотоксичности. Воздействие диоксинов, азота, серы сопровождается нарушениями созревания и пролиферации тимоцитов, уменьшением количества В-лимфоцитов, изменениями синтеза антител, снижением резистентности к бактериальным инфекциям. Продукты табачного дыма активируют синтез IgE. Озон способен увеличивать количество провоспалительных медиаторов, активируя циклооксигеназу, повышает проницаемость сосудов и эпителия, что облегчает проникновение ксенобиотиков и аллергенов. Окиси серы и азота снижают фагоцитоз [11; 13; 19; 87; 178]. Иммунологические нарушения вызывают также повышенное содержание 3,4-бензпирена в атмосфере, длительный контакт с синтетическими органическими соединениями [44, 141]. В целом, воздействие ксенобиотиков нарушает тканевой метаболизм и физиологические свойства биомембран клеток, влияет на функцию иммунной системы, что сопровождается изменением реактивности организма, снижением защитных свойств и уменьшением порога чувствительности к аллергенам [10; 20; 39; 182].
Ряд промышленных химических веществ (с достаточно высокой молекулярной массой) могут обладать непосредственным сенсибилизирующим действием, либо (в случае гаптенов) приобретать такие свойства после адсорбции на белках организма, образуя конъюгированные антигены, что подтверждается положительными кожными пробами при проведении тестирования с химическими соединениями, а также обнаружением специфических IgE радиоаллергосорбентным методом. Под действием техногенного загрязнения атмосферного воздуха может изменяться структура и повышаться иммуногенность пыльцы и других "натуральных" аллергенов [12; 70; 88; 125; 220] Большинство химических веществ являются гаптенами. В организме гаптены соединяются с собственными белками организма, формируя, таким образом, полноценные аллергенные детерминанты. Иммунный ответ развивается на белок, входящий в конъюгат, а антигенная специфичность обусловлена химической структурой гаптена в его составе. Кроме этого, некоторые ксенобиотики могут вызывать денатурацию белка, который в свою очередь становится аутоаллергеном, при этом сам ксенобиотик не является антигеном [4; 5; 26; 32; 125]. Наиболее сильным сенсибилизирующим действием обладают вещества, имеющие стабильную конформацию, которая часто определяется наличием жестких циклических ароматических структур. Эталоном подобного гаптена является 2,4 - динитрохлорбензол, несущий фенилыюе кольцо с наличием полярных зарядов и активного радикала в виде хлора, способного конъюгировать с белком-носителем. Хлор, вещества, несущие NH2 группу, хлор- и нитропризводные бензола относятся к подобным аллергенам [70]. В дальнейшем конъюгированный антиген может быть представлен Т-лимфоцитам антигенпрезентирующими клетками, функцию которых в коже выполняют клетки Лангерганса (синоним - белые отростчатые эпидермоциты, КЛ) [51;52; 75]. Антиген, проникая в кожу, контактирует с КЛ и вызывает экспрессию высокоаффинного рецептора IgE на ее поверхности, после чего подвергается ферментативному расщеплению с представлением фрагментов антигена в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости для контакта и активации Т-лимфоцитов.
Таким образом, КЛ, находящиеся в эпидермисе, вызывают первичный и вторичный Т-клеточный ответ на гаптены и аллоантигены [68]. Известны также некоторые соединения, приобретающие сенсибилизирующие свойства in vivo после ферментативной биотрансформации [218]. Некоторые реактивные метаболиты способны фиксироваться на белках-переносчиках клеточной мембраны, вызывая аллергическую реакцию по цитотоксическому типу [226]. В последние годы придается большое значение влиянию пассивного курения на возникновение и развитие аллергических реакций [11; 69; 71] Большой интерес представляют работы F.D. Gilliland [132], который показал, что курение матери во время беременности способствует возникновению аллергических заболеваний у ребенка. D.P. Strachan, D.G. Cook [210] подчеркивают, что курение родителей, особенно матери, предрасполагает к появлению аллергических реакций, а у детей с бронхиальной астмой усиливает тяжесть течения заболевания. По_ данным Л.Ф. Казначеевой [75] у 60% детей формируется сенсибилизация к табаку. Однако, Н. Kurz [150] в своих исследованиях отмечает, что пассивное курение является фактором риска в большей степени для бронхиальной астмы, нежели для атопического дерматита. Изменение характера питания также влияет на развитие атопического дерматита. Частое употребление продуктов, содержащих консерванты, искусственные красители, эмульгаторы, антиокислители, стабилизаторы, способствует риску развития заболевания [40; 77; 142].
Резюмируя вышеизложенное, не представляет сомнения то, что зафязнение окружающей среды химическими веществами оказывает длительное прямое и опосредованное действие на ребенка, способствуя росту заболеваемости, формированию патологической реактивности, снижению адаптивных возможностей организма, и является фактором риска для возникновения и развития атопического дерматита.
Суперсемейство глутатион S-трансфераз: структура и свойства
Суперсемейство глутатион S-трансфераз (GST) играет ключевую роль во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков. GST катализируют конъюгацию восстановленного глутатиона (GSH) с широким спектром электрофильных субстратов, способных ковалентно связываться с функциональными и структурными белками, нуклеиновыми кислотами. Как правило, подобное взаимодействие определяет токсические, канцерогеные или сенсибилизирующие свойства химических веществ [178; 219]. Кроме этого, GST имеют также и некаталитические функции: могут связывать ряд экзогенных и эндогенных лигандов и, таким образом, активировать или ингибировать активность некоторых ферментов, рецепторов, БАВ, белков переносчиков [25; 90; 108; 132; 138; 187; 200]. Согласно действующей классификации, у млекопитающих суперсемейство глутатион S-трансфераз делится на шесть семейств, при этом гены глутатион S-трансфераз обозначаются наклонными, а белки — прямыми заглавными буквами. Наиболее широко в организме представлены цитозольные GST, включающие пять семейств, функционирующих как димеры, и кодирующиеся 16-ю генами [136; 224; 231]. Шестое семейство микросомальная GST (mGST-I), обозначаемая также как «мембраноассоциированный белок метаболизма эйкозаноидов и глутатиона» ( membran-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism -MAPEG), функционирующее как тример и состоящее из 6 генов на 12-ой хромосоме [144; 165; 200]. Вопрос о включении лейкотриен С4-синтстазы (LTC4S), а также mGST-II, mGST-III, обладающих подобной активностью, и белка-активатора липооксигеназы (FLAP) в семейство микросомалыюй GST остается открытым [136; 144; 152; 183].
Цитозольные GST человека подразделяется на пять отдельных функциональных семейств с частично перекрывающейся субстратной активностью и локализованных на разных хромосомах: Альфа {GSTA - 6р12), Мю (GSTM- ІрІЗ.З), Пи (GSTP - 1Ц13), Тэта (GSTT - 22qll), Зэта (GSTZ-14q24.3)[136;202]. Семейство GSTM локализовано на длинном плече 1-ой хромосомы -ІрІЗ.З и состоит из 5 генов: Ml, М2, МЗ, М4, М5 с высокой степенью гомологичности конечных продуктов (до 90%) и широко перекрывающейся субстратной специфичностью [112; 118; 180; 191; 199]. Ген GSTM1 состоит из двух аллельных вариантов GSTM1 A и GSTM1 B с последовательностью, различающейся на одну аминокислоту, и идентичной субстратной специфичностью («дикий генотип», GSTM1+). Третий аллельный вариант GSTM1 (мутантный) - GSTM1 0 - делеция гена GSTM1 (нуль-полиморфизм, GSTM1-) характеризуется полным отсутствием ферментативной активности [197]. По данным разных авторов делеция гена GSTM1 встречается у 40-50% европеоидной популяции [13; 99; 147; 231; 235]. Тестовым субстратом GSTM1 in vitro является транс-стильбен оксид [199]. Глутатион S-трансфераза Ml катализирует коньюгацию GSH со многими токсичнымими ксенобиотиками: эпоксидами, тиолами, галогеноидами, нитрогруппами, в том числе 1-хлор-2,4-динитробензеном, афлатоксином, бензпирепом, акролеином и другими продуктами, содержащимися в табачном дыме [25; 47; 110; 200]. Из эндогенных веществ субстратами GSTM1 являются продукты перекисного окисления липидов, гидроперекиси фосфолипидов, перекись водорода, простагландины А2 и J2, метаболиты хинона и катехоламинов (допахром) [100; 126; 136]. Кроме этого, GSTM1 участвует в транспорте гормонов (некаталитически связываясь с ядерными рецепторами), антиоксидаптной защите (связывая и облегчая элиминацию окисленных продуктов витамина Е) [90; 136]. В исследованиях R. Kerb, J. Brockmoller [148] получены данные о том, что GSTM1 участвует в защите кожи от воспаления, вызванного ультрафиолетовыми лучами. Авторы связывают такой эффект с торможением свободноради кального процесса и связыванием продуктов перекисного окисления липидов. GSTM1 экспрессируется в печени, почках, слизистой дыхательных путей, мозге, надпочечниках [30; 227]. Семейство GSTT расположено в коротком плече хромосомы 22 - 22ql 1 и включает два гена GSTT1 и GSTT2 со степенью гомологичности 55% [215]. Глутатион S-трансфераза ТІ имеет два аллельных варианта GSTTJ A («дикий» генотип, GSTT1+) с полной ферментативной активностью и GSTTJ 0 (мутантный генотип) - делеция гена с утратой функции (нуль-полиморфизм, GSTT1-). Нуль-полиморфизм GSTTI встречается у 10 - 20% европеоидной популяции [147; 200; 213]. Как и все глутатион S-трансферазы, GSTT1 катализирует связывание глутатиона с электрофильными метаболитами ксенобиотиков: относительно специфичными для GSTT1 являются дихлорметан (органический растворитель, побочный продукт синтеза пластиков), дибромэтан (образуется при сгорании бензина), галометан и метилбромид, а также химические вещества, содержащиеся в табачном дыме: оксид этилена, монозамещенные галоалкены и эпоксибутан [ПО; 136; 181]. Эндогенными субстратами GSTT1 являются окисленные липиды, образующиеся в результате перекисного окисления [126]. Экспрессия глутатион S-трансферазы ТІ доказана для печени, почек, эритроцитов [ПО; 136]. Мнения относительно экспрессии GSTM1 и GSTT1 в коже неоднозначны. W. Lutz, М. Tarkovsky [159] указывают на присутствие в коже обеих изоформ. S. Signal, М. Saxena [201] изучив активность GST в коже бедра, выявили активность только классов Альфа и Пи. У женщин активность этих ферментов была выше, чем у мужчин.
Исследовав экспрессию глутатион S-трансфераз в кератиноцитах и эпидермисе больных псориазом, A. Aceto, F. Martini [89] обнаружили активность GST класса Пи в указанных клетках. Изучив GST в коже человека и грызунов, используя поликлональные антитела, Н. Raza, Y.C. Awasthi [187] выявили присутствие всех изоформ как у человека, так и у грызунов, а также обнаружили ферментативную активность в отношении 1-хлор-2,4-динитробензола, бензпирен-4,5 оксида, лейкотриена А4 - субстратов GSTM1 Однако, исследовав те же ферменты методом Western-blott, обнаружили экспрессию только классов Пи и Альфа. Авторы подчеркивают, что GST, экспрессирующиеся в коже, могут метаболизировать эндогенные и экзогенные субстраты, также как и GST, находящиеся в других тканях. В. Jernstorm, L. Dock [145] методом иммуноблоттинга установили присутствие GST классов Альфа и Пи в коже и обнаружили ферментативную активность в отношении субстратов, характерных для всех классов GST. Вопрос об участии GST в защите организма от оксидативного стресса также остается открытым. При манифестном атопическом дерматите в результате воспалительного процесса организм подвергается оксидативному стрессу, в процессе которого вырабатывается огромное количеств БАВ, реактивных метаболитов кислорода, активируется перекисное окисление липидов и свободнорадпкальные процессы [50; 103; 138; 148]. У детей с атопическим дерматитом активация перекисного окисления липидов и выброс БАВ - наиболее ранние реакции на антигенную стимуляцию [9; 11]. Показано, что превращение лейкотриена С4 в лейкотриен D4 может быть иигибировано глутатионом [72]. В работах A. Fryer [126], S. Baez [95], Е. Bergamaschi [97], J. Не [140] показано, что GST Ml и ТІ защищают клетки от реактивных метаболитов кислорода и утилизируют ряд субстратов, образующихся при оксидативном стрессе (метаболиты хинона и катехоламинов, гидроперекиси для GSTM1, окисленные липиды и ДНК для GSTT1). I. Onaran [174; 175], изучив подверженность GSTT1- и GSTM1- лимфоцитов цитотоксичному влиянию оксидативного стресса in vitro (в качестве индуктора которого была взята гидроперекись кумена - CumOOH), выявили, что чувствительность лимфоцитов с генотипами GSTT1- и GSTM1- к прооксидантам in vitro не
Определение генотипов GSTM1 и GSTT1
Для выделения ДНК использовался микротермостат «Бис» 205 (ЗАО «Бис», п. Кольцово, Россия). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в амплификаторе «Бис» 105 (ЗАО «Бис», п. Кольцово, Россия). Для визуализации электрофореграммы использовались видеосистема «DNA Analyser» и программное обеспечение «Гель-имиджер» (г. Москва). 2Забор крови для генотипирования проводился в утреннее время в условиях процедурного кабинета стационара. Для последующего выделения ДНК забиралось 2 мл венозной крови в стандартную стеклянную пробирку. В качестве антикоагулянта использовалось 200 мкл 2% р-ра динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА). Далее материал упаковывался в пробирки типа Эппендорф и замораживался при температуре -18С. Выделение ДНК из образцов цельной крови проводилось по методу Кункеля [92]. К 0,5 мл цельной крови добавляли 0,5 мл. простерилизованного лизисного буфера ( 0,32 М сахароза, ЮмМ трисІІСІ рН 7,5, 5мМ MgCl2, 1% тритон X 100), суспендировали и затем центрифугировали в течении 5 мин при 5000 об/мин (lOOOg). Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 1мл лизисного буфера, после чего центрифугировали. Такую отмывку повторяли трижды. Оставшийся осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера для ПЦР (1мМ MgCl2, 67 мМ трисНСІ рН 8,7, 16,6 мМ (NHj SO и добавляли 5мкл протеиназы К (10мг/мл). Пробирки инкубировали в микротермостате при температуре 60С в течение часа, после чего проводили температурную инактивацию протеиназы К при 95С в течение 10 мин.
Выделенные лизаты хранились при температуре -30С. Генотипирование проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе «Бис»-105, последовательности олигонуклеотидных праймеров представлены в таблице 2.5. Полиморфизм гена GSTM1 определялся по методу, предложенному S. Zhong [234]. Амплификация гена GSTM1 проводилась в 0,5мл пробирках типа Эппендорф. Реакционная смесь (общий объем 25 мкл) содержала стандартный ПЦР буфер, ЮмМ /3-меркаптоэтанол, 10% DMSO (2,5мкл), ЮмМ MgCl2(2 мкл), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов dATP, dCTP, dGTP, dTTP (по 200мМ каждого), Taq-полимеразу (5ЕД/мкл) - 2,5 ЕД, синтетические олигонуклеотиды (праймеры) PI, Р2, РЗ в рабочей концентрации 100 пкМ/мкл -1мкл, 1,2 мкл, 1мкл соответственно, 5 мкл пробы ДНК пациента и бидистиллированную воду до общего объема 25 мкл. В каждую пробирку на реакционную смесь наслаивалось 25 мкл минерального масла для ПЦР. Терморежим амплификации приводится в таблице 2.6. Продукты амплификации подвергались электрофорезу в 2% агарозном геле в ТАЕ буфере (0,04М трисацетат, 0,002М ЭДТА, рН 8,0) При нанесении амплификатов ДНК на гель к каждой пробе добавлялось 2 мкл 0,25% раствора бромфенолового синего в 50% глицерине. Электрофорез проводился на аппарате для горизонтального электрофореза при наряженности 0,5В/см, после чего пластинки окрашивались 0,5 % бромидом этидия, визуализировались в ультрафиолетовом свете. Полученный объект отображался на мониторе компьютера с помощью видеосистемы «DNA Analyser» и сохранялся в виде электронного файла. В случае нормальной гомозиготы или гетерозиготы (плюс-генотип, GSTM1+) на фото выявлялась полоса в 230 пар нуклеотидов (п.н.) (продукт амплификации Р1 и РЗ) и полоса 157 п.н. (продукт амплификации Р1 и Р2) (рис. 2.1, дорожки 3, 4, 5). В случае гомозиготной делеции гена GSTM1 полосы в 230 п.н. не выявлялось (нуль-генотип, GSTM1-) (рис. 2.1, дорожки 1, 2, 6, 7, 8).
Определение полиморфизма гена GSTT1 проводилось по методу предложенному S. Pemble [181]. Реакционная смесь (общий объем 25 мкл) включала стандартный буфер ПЦР, ЮмМ /3-меркаптоэтанол, ЮмМ MgCb (2 мкл), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов dATP, dCTP, dGTP, dTTP (по 200 мМ каждого), Taq-полимеразу (5ЕД/мкл) - 2,5 ЕД, праймеры ТІ, Т2, PI, Р2 в рабочей концентрации ЮОпкМ/мкл по 0,25 мкл, бидистиллированную воду 7,5 мкл и 7,5 мкл пробы ДНК пациента. Терморежим амплификации представлен в таблице 2.7. Продукты амплификации также подвергались элктрофорезу в 2% агарозном геле в ТАЕ буфере, на аппарате для горизонтального электрофореза при напряжении 0,5В/см, после чего пластинки окрашивались 2% бромистым этидием и визуализировались в ультрафиолетовом свете. Комбинация праймеров ТІ и Т2 давала продукт длиной в 430 п.н. в случае нормальной гомозиготы или гетерозиготы (плюс-генотип, GSTT1+) (рис. 2.2, дорожки 1, 2). В случае делеции гена GSTT1 этот продукт не выявлялся (нуль-генотип, GSTT1-) (рис 2.2, дорожки 3, 4). Модификацией метода являлось использование в качестве контроля амплификации продукт комбинации праймеров Р1 и Р2 для GSTM1, так как данные праймеры у любого индивида дают продукт длиной в 157 п.н. в случае успешного проведения амплификации [15]. Дорожки 1,2- плюс-генотип (GSTT+) Дорожки 3,4- нуль-генотип (GSTT1-) Дорожка 5 - маркеры молекулярного веса
По результатам исследования была сформирована база данных в виде таблицы в пакете программ MS Excel 2000. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 5.0» для медико-биологических исследований. Произведен расчет среднеарифметических значений (М), средних квадратических отклонений (а). Оценка значимости различий проводилась по одному выделенному признаку: для средних величин с помощью t критерия Стьюдента (t), для качественных признаков по критерию х2 и точному критерию Фишера [59]. Сравнение содержания общего IgE и количества эозинофилов периферической крови у детей с разными генотипами проводилась с применением непараметрического критерия Манна-Уитни [65]. Оценка ассоциации генотипов с предрасположенностью к АД, тяжестью течения заболевания проводилась по величине отношения шансов (odds ratio, OR) - показателю, показывающему во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай» отличается от вероятности оказаться в группе «контроль» для носителя изучаемого генотипа. OR=(A/B)/(C/D), где А и В процент или абсолютное число носителей измененного и неизмененного признака в основной группе, а С и D - те же признаки в контрольной [179]. Для оценки ассоциации генетических признаков с клиническими особенностями атопического дерматита также использовалась величина отношения шансов. При этом «основной» группой являлись больные, имеющие клиническую особенность, а контрольной - больные без таковой особенности. Кроме этого, величины OR были рассчитаны отдельно для больных и здоровых пассивных курильщиков и для больных и здоровых некурящих, что показывает влияние генотипа на риск возникновения атопического дерматита в зависимости от фактора курения. Критерии оценки величины OR представлены табл. 2.8.
Влияние пассивного курения на предрасположенность и особенности клинического течения атопического дерматита у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTT1
По данным литературы пассивное курение является фактором, способствующим формированию и поддерживающим течение бронхиальной астмы у детей [12; 132; 210] В.А. Вавилин, О.А. Рябова [14; 15; 23] в своих исследованиях установили, что пассивное курение усиливает значимость генотипа GSTM1- как фактора риска развития бронхиальной астмы у детей, а также увеличивает ассоциированный с генотипом GSTM1- риск развития тяжелого течения, раннего начала БА, поливалентной аллергии. Исходя из этого, было предположено, что предрасположенность к АД и особенности клинического течения у больных с разными генотипами GSTM1 также изменяются в зависимости от воздействия фактора пассивного курения. Все здоровые и больные атопическим дерматитом дети были разделены на группы пассивных курильщиков («ПК») и не подвергавшихся воздействию табачного дыма («не ПК»).
Далее было проведено изучение риска возникновения атопического дерматита у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTT1 в зависимости от влияния пассивного курения. Выявлено, что нуль-генотип GSTM1 не является фактором риска развития атопического дерматита, как для пассивных курильщиков, так и для «некурящих» (табл. 3.19). Так как в контроле отсутствовали «некурящие» дети с мутантным GSTTI генотипом, изучение риска возникновения АД в группах «ПК» и «не ПК» для GSTT1- генотипа и комбинаций GSTM1+/GSTT1-, GSTM1-/GSTTI- не представилось возможным. Под воздействием пассивного курения комбинация генотипов GSTMl+fGSTTI+теряет свое значение как фактор устойчивости к развитию атопического дерматита. Далее была проанализирована взаимосвязь полиморфизма изучаемых генов с тяжестью течения АД и распространенностью кожного процесса в зависимости от воздействия пассивного курения (табл.3.20). Выявлено, что генотип GSTM1- является фактором риска развития тяжелого АД как для пассивных курильщиков, так и для «не ПК» (р=0,03 и р=0,03 соответственно) и диффузного поражения кожных покровов в группе «ПК» (р=0,04). Примечание: - достоверные различия при сравнении GSTM1- и GSTM1+ + - достоверные различия при сравнении GSTT1- и GSTT1+ Нуль-полиморфизм GSTT1 является более значимым для тяжелого течения АД (р=0,032) у «некурящих» детей. Тяжелое течение АД достоверно реже встречается у носителей комбинации генотипов GSTM1+IGSTT1+ в обеих группах (р=0,03 для «ПК» и р=0,01 для «не ПК»). При изучении влияния пассивного курения на частоту рецидивирования атопического дерматита выявлено, что у детей с генотипами GSTMI+ и GSTM1-частота обострений в группах «ПК» и «неПК» одинакова. У детей с генотипом GSTT1- в группе пассивных курильщиков достоверно чаще отмечалась частота рецидивирования 4-5 и более раз в год по сравнению с «некурящими» больными (р=0,043). Среди пациентов с GSTT1+ генотипом подобных различий не отмечалось. Оценить эти показатели для комбинаций генотипов не представилось возможным из-за малочисленных групп.
В целом исследования показали, что воздействие табачного дыма не увеличивает риск возникновения атопического дерматита у детей. Влияние пассивного курения на клинические особенности АД неоднозначно, тем не менее, при прогнозе течения заболевания у пациентов с нуль-полиморфизмом GSTM1 и GSTT1 следует учитывать фактор курения. Изучение динамики клинических проявлений на фоне лечения, выявило, что у части больных атопическим дерматитом проведение стандартной терапии, соответствующей форме и степени тяжести заболевания, не давало выраженного положительного эффекта. Было высказано предположение, что степень выраженности ответа на проводимое лечение может зависеть от полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и ТІ, которые принимают участие в метаболизме медиаторов аллергического воспаления и лекарственных средств. Под наблюдением находились 56 детей в возрасте от 3 до 14 лет (28 девочек и 28 мальчиков). Детская форма атопического дерматита была диагностирована у 31 ребенка, подростковая - у 25 пациентов. У 11 детей отмечалось диффузное поражения кожи, у 45- распространенное. Тяжелое течение атопического дерматита встречалось у 21 ребенка, среднетяжелое — у 35 детей. Клинические формы были представлены эритематозно-сквамозной (30 больных), и эритемато-сквамозной с лихенизацией (26 пациентов). Нуль-генотип GSTM1 встречался у 22 больных, плюс-генотип — у 34 пациентов. Распределение генотипов GSTT1 было следующим: 19 детей с GSTT1-, и 37 с GSTT1+. Все дети получали комплексную терапию, в которую входили: 1) Элиминационно-сорбционные мероприятия (гипоаллергенная диета, энтеросорбенты (активированный уголь, полифепан). 2) Антимедиаторная терапия (супрастин, тавегил, в случаях выраженной остроты кожного процесса и зуда в/м в возрастной дозе курсом 10 дней, далее препараты цетирезина и в возрастной дозе) 3) Мембраностабилизирующие средства (кетотифен) получали 37 детей. Курс — 3 месяца. 4) Наружная терапия: a)
Топические глюкокортикостероиды. Препаратами выбора были нефторированные кортикостероиды (адвантан, элоком) в виде крема и жирной мази (курсом 7-28 дней). b) В острую стадию назначались противовоспалительные, рассасывающие средства. c) В подострую - противоспалительныс, рассасывающие и смягчающие и средства, обладающие регенерирующими, улучшающими трофику свойствами. 5) Симптоматическая терапия Оценка эффективности терапии проводилась с учетом показателей шкалы SCORAD через 2 недели, 1 и 2 месяца от начала лечения. К 14 дню лечения у 28,6% пациентов отмечалась выраженная положительная динамика, что проявлялось в улучшении общего самочувствия, значительном уменьшении зуда, нормализации сна. Наблюдалось существенное снижение выраженности островоспалительных изменений на коже: уменьшение/исчезновение эритемы, значительное уменьшение инфильтрации, лихенизации и/или шелушения в очагах поражения, снижение индекса SCORAD более чем на 50%. У 44,6% детей на 14 день лечения отмечалась положительная динамика, что выражалось в уменьшении островоспалительных изменений, площади
![Роль аутоиммунных процессов в течении атопического дерматита у детей и оптимизация методов наружной терапии [Электронный ресурс]](/i/i/4478/187993.png "Роль аутоиммунных процессов в течении атопического дерматита у детей и оптимизация методов наружной терапии [Электронный ресурс] Сурков Александр Геннадьевич")
![Клинический и иммуномодулирующий эффекты магнитоинфракрасной лазерной терапии при тяжелом течении атопического дерматита у детей раннего возраста [Электронный ресурс]](/i/i/4327/207552.png "Клинический и иммуномодулирующий эффекты магнитоинфракрасной лазерной терапии при тяжелом течении атопического дерматита у детей раннего возраста [Электронный ресурс] Ковязина Наталья Анатольевна")
![Эффективность иммуномодуляторов нового поколения в коррекции ферментных и иммунных изменений при атопическом дерматите у детей [Электронный ресурс]](/i/i/4307/210575.png "Эффективность иммуномодуляторов нового поколения в коррекции ферментных и иммунных изменений при атопическом дерматите у детей [Электронный ресурс] Шутова Ольга Валентиновна")
