Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 15
1.1 Современные представления об этиологии и патогенезе вирусных гепатитов 15
1.2. Патоморфологические изменения в печени и динамика цитокинов у больных хроническими вирусными гепатиами В, С и Д. 40
1.3. Аутоиммунные проявления при вирусных гепатитах 54
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования. 74
2.1. Определение уровней (ИЛ-1(3, ИЛ-6, ИЛ-4,ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у) 76
2.2. Выделение мононулеарных клеток периферической крови (МНПК) 78
2.3. проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител 78
2.4. Определение уровней ANTI-LKM-1. 79
2.5.. Определение ANA, АМА, ASMA 80
2.6 Определение криоглобулинов 81
2.7. Определение ревматоидного фактора 81
2.8. Определение белков CORE, NS3, NS4, NS5.. 82
2.9. Определение маркеров вирусных гепатитов 84
2.10.. Определение биохимических показателей крови. 84
2.11. Определение ДНК HBV, РНК HCV и генотипирование вируса 84
2.12..Пункционная биопсия печени 84
2.13. Выделение мите печени 87
2.14. Определение фенотипа иммунных клеток печени 87
ГЛАВА 3. Общая клиническая характеристика больных вирусными гепатитами различной этиологии 90
3.1. Общая клиническая характеристика больных острыми вирусными гепатитами различной этиологии 93
3.2. Общая клиническая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии 111
ГЛАВА 4. Динамика аутоиммунных проявлений и уровня'цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГА 130
ГЛАВА 5. Динамика аутоиммунных проявлений и уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГВ 161
ГЛАВА 6. Динамика аутоиммунных проявлений уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГС 175
ГЛАВА 7. Динамика аутоиммунных проявлений и уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГД 202
ГЛАВА 8. Динамика аутоиммунных проявлений и уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ХВГВ и ХВГС 206
ГЛАВА 9. Цитокиновый профиль и характер клеточной популяции в сопоставлении с гистологической активностью у больных ХВГВ и ХВГС 239
ГЛАВА 10. Морфологические изменения в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С. 282
Заключение 294
Выводы 340
Практические рекомендации. 342
Список литературы. 343
- Патоморфологические изменения в печени и динамика цитокинов у больных хроническими вирусными гепатиами В, С и Д.
- Общая клиническая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии
- Динамика аутоиммунных проявлений и уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГВ
- Цитокиновый профиль и характер клеточной популяции в сопоставлении с гистологической активностью у больных ХВГВ и ХВГС
Введение к работе
Актуальность темы.
В патогенезе вирусных поражений печени особое место отводится аутоиммунным нарушениям, т.к. высокая частота внепечёночных проявлений при хронических гепатитах В и С в сочетании с выявлением широкого спектра аутоантител позволяет предположить роль гепатотропных вирусов в этиологии некоторых аутоиммунных заболеваний. В тоже время остаётся открытым вопрос о значении и месте аутоиммунных нарушений в патогенезе вирусных поражений печени.
В настоящее время существует гипотеза, что прогрессирование вирусных инфекций ассоциируется со специфическими дефектами и дисбалансом в системе Th1 и Th2 типа (Царегородцева Т.М., Серова Т.И. 2003, Наследникова И.О., Белобородова Е.В. 2005, Hempel G. 2000, McClary H. 2000, . 2005). Для Th1 типа характерен цитокиновый ответ, ассоциирующийся с продукцией ИФН- и ИЛ-2 в результате антигенной или митогенной стимуляции мононуклеаров периферической крови, а для Th2 типа цитокиновый ответ ассоциируется с продукцией ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 и ИЛ -10. Существует гипотеза, что у лиц, формирующих иммунный ответ по первому типу, хронизация вирусных инфекций маловероятна. В случае же формирования персистирующей вирусной инфекции иммунный ответ формируется по второму варианту, причём независимо от возбудителя обязательно присутствует аутоиммунный компонент (Walker B.D., 1996). Предполагается, что основой развития аутоиммунных реакций может быть нарушение баланса цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-) за счет активации аутореактивных Т-клеток антигенпредставляющими клетками, в том числе мононуклеарами периферической крови (МНПК). Следствием этого является развитие иммунодефицитного состояния при котором снижается толерантность организма к собственным антигенам (Чепель Э., 2008), но когда происходит присоединение аутоиммунного компонента, в острый или хронический период заболевания, остаётся неустановленным. На этом фоне нарушение дифференцировки Т-клеточного звена приводит к дисбалансу синтеза провоспалительных цитокинов, что способствует реактивации пула аутореактивных лимфоцитов и развитию аутоиммунного процесса.
Известно, что высокий уровень ФНО-a характеризуется иммунологическими реакциями, опосредованными ИФН-g, и в конечном итоге активацией Т-клеточного звена иммунитета, усилением активности натуральных киллеров (NK), росту и дифференцировке В-клеток (Рязанцева Н. В. с соавт. 2005, Сепиашвили Р.И. с соавт. 2000, Ohta A., Sekimoto M., Sato M. 2000). В настоящее время установлено, что ассоциированный с макрофагами выброс ФНО-a и экспрессируемые Тх1-лимфоцитами ИЛ-2, ИФН- связан с активацией и прогрессированием аутоиммунных процессов в паренхиме печени (Лейшнер У. 2005).
В настоящее время рядом авторов при онкологических заболеваниях выявлена особая субпопуляция Т-клеток - комплекс T-регуляторных клеток CD4+/CD25+ (T рег.), которые проявляют гипопролиферативную активность, обладают способностью угнетать активацию и ингибировать секрецию цитокинов CD4+/CD25+ T-хелперами и CD8+ и таким образом препятствуют развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена (, , 2005, , , , 2006, , , ., 2006),в тоже время комплекс CD4+/CD25+ (T рег.) сдерживают активацию аутореактивных Т и В лимфоцитов, тем самым препятствуют развитию аутоиммунных реакций (Рабсон А., Ройт А., Делвз П., 2006). Но все эти исследования были проведены при изучении пула регуляторных Т лимфоцитов в сыворотке крови. Данных по изучению роли комплекса Т рег. лимфоцитов (CD4+/CD25+) в паренхиме печени при хронических вирусных гепатитах в инициации иммунного ответа в доступной нам литературе отсутствуют.
В связи с выше изложенным представляло интерес установить наличие аутоиммунных проявлений (ASMA, ANA, AMA, РФ, КГ) у больных острыми и хроническим вирусными гепатитами в сопоставлении с показателями цитокинового профиля (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6). Так как при хронических вирусных гепатитах аутоиммунные нарушения достигают максимальной выраженности, необходимо было изучить в органе-мишени (печени) морфологическую основу формирования этих реакций. С этой целью необходимо проанализировать популяционный состав лимфоцитов в гепатобиоптате и в сыворотке крови. Особое место следует уделить выявлению комплекса T-регуляторных клеток (CD4+CD25+) в биоптате на фоне изучения гистологической активности и фиброза в сопоставлении со спонтанной и индуцированной продукцией цитокинов МНПК в сыворотке крови. На основании полученных данных попытаться определить роль этих показателей в развитии аутоиммунных проявлений при хронических вирусных гепатитах и возможные пути коррекции этих нарушений.
Цель исследования – сопоставить уровень процитокинов воспаления в сыворотке крови, субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и характер клеточной популяции в печеночной ткани для определения их роли в реализации аутоиммунных проявлений в патогенезе вирусных гепатитов.
Задачи исследования:
1. Изучить у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами наличие ASMA, AMA, ANA, a-LKM-1, криоглобулинов и ревматоидного фактора в сыворотке крови при различной степени тяжести болезни и активности процесса в ткани печени.
2. Исследовать в динамике заболевания уровни цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-) в сыворотке крови при ОВГ различной этиологии.
3. Исследовать уровни цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-) в сыворотке крови при ХВГВ и С.
4. Сопоставить изменения цитокинового профиля в сыворотке крови у больных острым и хроническими ВГ с наличием у них аутоиммунных нарушений и без них.
5. Изучить концентрацию цитокинов ИФН-, ИФН-, ФНО-,ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.
6. Изучить спонтанную и индуцированную NDV и ФГА продукцию цитокинов ИФН-, ИФН-, ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6 МНПК у больных ХГВ и С с различными показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.
7. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза в печеночной ткани у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.
8. Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита и выраженностью фиброза.
9. Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС.
Научная новизна исследования.
Впервые у больных острыми вирусными гепатитами в динамике заболевания и у больных ХВГВ и ХВГС различной степени активности проведено комплексное определение маркеров аутоиммунных проявлений (аутоанител, криоглобулинемии и ревматоидного фактора).
Показана динамика аутоантител, ревматоидного фактора и криоглобулинов у больных с острыми вирусными гепатитами на ранних этапах инфекционного процесса. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С выявлены аутоантитела, криоглобулины и ревматоидный фактор в высоких титрах.
Установлено, что наличие аутоиммунных проявлений у больных ОВГ не зависят от выраженности цитолитического синдрома.
Изучена динамика цитокинов у больных ОВГ и ХВГ в сопоставлении с наличием аутоантител и показано, что у больных ОВГА и ОВГВ с аутоантителами концентрации ИЛ-1 и ФНО- значительно выше, чем у больных без аутоантител, а у больных ОВГС легкого течения с аутоантителами уровень ИЛ-1 умеренно превышает контрольные значения на фоне нулевых значений ФНО- и ИЛ-6. У больных ХВГС с умеренной степенью активности и у больных с ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных проявлений уровни ИЛ-6 и ФНО- были достоверно выше, чем у больных с аутоиммунными нарушениями.
Выявлена прямая связь между уровнем ИЛ-1b, ФНО-a и наличием аутоиммунных проявлений, что связано с дисбалансом провоспалительных цитокинов, активацией В-лимфоцитов, их клональной пролиферацией и продукцией широкого спектра аутоантител с образованием иммунных комплексов.
Впервые установлено, что у больных хроническими вирусными гепатитами отсутствуют резервные возможности МНПК вырабатывать ИФН-, следовательно, развивается иммунодефицитное состояние при котором снижается толерантность организма к собственным антигенам.
Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов CD3+, цитоксических лимфоцитов CD8+, Т регуляторных. лимфоцитов CD4+CD25+, NK- клеток CD16+CD56+, NKT- клеток CD3+CD16+CD56+.
Впервые в гепатобиобтатах у больных ХВГС умеренной и высокой степени активности обнаружен комплекс Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+), что свидетельствует о возможности развития персистирующей вирусной инфекции с аутоиммунным компонентом.
Практическая значимость работы.
Выявленное наличие аутоиммунных проявлений у больных вирусными гепатитами на ранних этапах заболевания позволяет рекомендовать исследование сыворотки крови больных ОВГ на наличие маркеров аутоиммунных нарушений (неорганоспецифические аутоантитела, ревматоидный фактор, криоглобулины) для решения вопроса о необходимости дальнейшего наблюдения и прогнозирования течения заболевания.
Для адекватной оценки активности и прогноза инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя выявление аутоиммунных проявлений, концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также определение субпопуляции лимфоцитов периферической крови для подбора адекватного противовирусного лечения
Снижение стимулированной NDV продукции ИФН- МНПК может рассматриваться в качестве диагностического критерия состояния иммунодефицита, а также применяться для определения лечебной тактики.
При оценке морфофункционального состояния гепатобиобтатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С прогностическим критерием является не только гистологическая активность и выраженность фиброза, но и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме печени.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На ранних этапах острых вирусных гепатитов выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений.
2. Характер изменений провоспалительных цитокинов находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ОВГ.
3. У больных хроническими вирусными гепатитами выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений не зависимо от степени гистологической активности .
4. Характер изменений баланса цитокиновой продукции Th1/Th2 находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ХВГ.
5. Отражением аутоиммунных процессов у больных ХВГ, не зависимо от этиологии, по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза, является нарушение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови.
6. Характер лимфоидной инфильтрации в ткани печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С является основой для реализации аутоиммунных реакций в клинике данных нозологических форм.
Внедрение полученных результатов в практику.
Результаты проведенного исследования и практические рекомендации используются в процессе преподавания на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова и в практике работы 2-й клинической инфекционной больницы г.Москвы.
Апробация работы.
Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (зав. кафедрой, член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак).
Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях: патогенез и механизмы адаптации», № 01.200.110439.
Материалы диссертационной работы были доложены на научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (24-26 мая 2000г.), на Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня» (20-23 марта 2001г., Москва), на научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (22-23 мая 2003 г., Москва), на научно-практической конференции КИБ №2 (5июня 2003 г.), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов С.Петербург 2003 г., на Пятой научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (4-5 ноября 2007г., Москва), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гастроэнтерологии» (14 декабря, 2007 г., Москва), на Евроазиатском конгрессе инфекционистов (4-6 июня 2008 г., г. Витебск, Беларусь).
Отдельные фрагменты работы опубликованы в журналах «Терапевтический архив», «Военно-медицинский журнал», «Эпидемиология и инфекционные болезни», «Врач», «Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии».
Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний при кафедре ММА имени И.М. Сеченова 4 марта 2010г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научные работы.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, заключения с обсуждением полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 343 страницах машинописного текста, иллюстрирована 84 таблицами, 98 рисунками и 8 фотографиями. Библиографический указатель содержит 412 источников литературы (отечественных 67, зарубежных 345).
Патоморфологические изменения в печени и динамика цитокинов у больных хроническими вирусными гепатиами В, С и Д.
Исследованиями отечественных и зарубежных авторов было установлено, что длительная персистенция вируса и хронизация при вирусных гепатитах сопровождаются дисбалансом в иммунном ответе организма. Основой развития иммунокомплексных, повреждающих реакций являются нарушения цитокинового профиля, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени (62). Развитие хронического воспалительного процесса в печени контролируется комплексом эндотелиальных клеток синусоидов, звездчатых клеток Ито и клеток Купффера. Они составляют основу формирования воспалительных реакций посредством выработки ими первичных медиаторов — цитокинов (6,21,24,37,66,381). В связи с этим представляло интерес изучить уровень цитокинов не только на периферии, но и в печеночной ткани в сопоставлении с патоморфологическими изменениями в ней.
Есть данные, наглядно демонстрирующие обусловленность гетерогенности течения вирусного гепатита в соответствии с изменениями в цитокиновом звене. Отмечено, что длительная активация ТЫ-лимфоцитов с гиперпродукцией IFN-y и ФНО-сс способствуют активному прогрессирующему течению заболевания, тогда как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых ТЪ2-клетками, напротив, ассоциируется с вирусной персистенциеи и хронизациеи процесса (31,54,68,96,154,195,245).
Таким образом, изменение цитокинового статуса в виде нарушения баланса Thl/Th2 цитокиновой продукции является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии и прогрессировании заболевания.
Основное место среди провоспалительных цитокинов в настоящее время отводят ШГ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а. Однако роль и место этих интерлеикинов в каскаде иммунопатологических реакций при вирусных гепатитах различной этиологии остается не до конца выясненной.
ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а вносят определенный вклад в иммунопатогенез HCV-инфекции, однако имеющиеся данные весьма немногочисленны и противоречивы. Предполагают, что эти цитокины способствуют развитию поражения печени, усиливая процессы прогрессирования фиброза и портального воспаления у больных ХГС, но не оказывают влияния на экспрессию генов или репликацию вируса (279). У больных ХГС отмечают повышенный уровень ФНО-а, коррелирующий с маркерами гепатоцеллюлярного повреждения и содержанием АЛТ (50,67,298). Выявлялось повышенное содержание ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а в сыворотке крови больных циррозом печени .вирусной этиологии (278), ХГС (281,309,324), при аутоиммунном гепатите (283,321). Обнаруживалась корреляция концентрации ФНО-а в сыворотке с апоптозом гепатоцитов (314), а также с индексом гистологической активности по Knodell (289).
Показано, что при HCV-зависимом хроническом гепатите имеется дисбаланс ИЛ-1(3 и его рецептора-антагониста в ткани печени, т.е. преобладание высоких концентраций ИЛ-1(3 обнаруживается у пациентов с высокой степенью фиброза (281).
При ХВГВ рядом авторов показано усиление синтеза ФНО-а мононуклеарами периферической крови пропорциональное активности патологического процесса (64), участие ФНО-а в эффекторной фазе повреждения печени при HBV-инфекции (225), роль ФНО-а в элиминации HBV (209), а также отмечалось повышенное содержание ИЛ-6 в сыворотке крови(186). Таким образом, при вирусных гепатитах различной этиологии имеет место раздражение макрофагального звена имунитета избыточным количеством антигенов вирусов, что приводит к выбросу провоспалительных цитокинов и следующему за этим каскаду иммунных реакций.
Установлена зависимость активности морфологических изменений печени (по шкале Knodell) от уровня внутрипеченочных CD4+ клеток и отсутствие корреляции с выраженностью виремии и содержанием трансаминаз. В связи с выше изложенным ряд авторов изучал сывороточную продукцию отдельных цитокинов в сопоставлении с уровнем гистологической активности и выраженностью фиброза (53); При этом не установлена взаимосвязь между выраженностью отдельных параметров, характеризующих гистологическую активность и цитокиновым профилем у больных хроническими вирусными гепатитами. Данные этих работ разноречивы. По данным Л.Ф. Скляр и соавт. (2005) в сыворотке крови при ХГС наблюдалось достоверное-увеличение концентраций IL-1, TNF- а, цитокинов Тх2 типа IL-4, IL-10 и достоверное снижение уровня Txl-цитокинов - IFN-y. При изучении корреляционных взаимоотношений между содержанием цитокинов и морфологическими параметрами зафиксирована высокая степень корреляционных связей между повышением уровня TNF- а, IL-4, IL-10 и выраженностью воспалительных изменений и фиброза в ткани печени (53).
В работах И.О. Наследниковой и соавт. (2005) показано статистически значимое увеличение продукции мононуклеарами периферической крови IL-4, IL-10 на фоне снижения секреции TNF-a (в 2,5 раза) по сравнению с показателями у здоровых доноров. При этом не обнаружены какие-либо различия в уровне синтеза TNF-a в зависимости от ИГА и стадии хронизации у больных хроническими вирусными гепатитами. При возрастании гистологической активности воспаления и выраженности фиброза в печени выявлено достоверное и значительное повышение концентрации IL-4 (37).
По данным А.Е. Грязина и соавт. (2005) выявлено достоверное повышение концентрации IFN-y, TNF-a в сыворотке крови у больных ХГС по сравнению с группой контроля, установлена прямая корреляционная связь уровня апоптоза и сывороточной концентрации TNF- a (16).
Общая клиническая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии
Исследования производились на базе 2КИБ г. Москвы (кафедра инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова) в период с 2000 по 2007 гг. Объектом исследований были больные острыми и хроническими вирусными гепатитами. У всех больных в динамике заболевания проводился забор крови. В целях верификации этиологии вирусного поражения печени определялись серологические маркеры в сыворотке крови методом ИФА: HBsAg, anti-HBcor IgM, anti-HAV IgM, anti-HCV IgM, anti-HCV IgG, anti-HDV IgM, anti-HDV IgG. Для дополнительного подтверждения диагноза ОВГС в сыворотке крови у больных этой группы определяли белки core, NS3, NS4, NS5.
С целью подтверждения активной репликации вируса всем больным хроническим вирусным гепатитом С проведен полуколичественный анализ ПЦР на HCV-PHK в сыворотке крови с определением генотипа вируса гепатита С. Для установления диагноза хронический вирусный гепатит В выполнены серологические исследования сыворотки крови на HbsAg, anti-HBcorYgG, anti-HBcorYgM. У больных с хроническим вирусным гепатитом В был использован полуколичественный анализ для выявления HBV-ДНК в сыворотке крови методом ПЦР.
Для оценки цитокинового профиля у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами изучена концентрация цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-1J3, IL-4, IL-6) в сыворотке крови, а у больных с ХВГ также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукция данных цитокинов МНПК. Изучение иммунного статуса у больных ХВГ проводилось с помощью определения CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 антигенов методом иммунофлюоресценции. Перечисленные исследования проведены в лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (зав. лабораторией д.м.н., проф. М.В. Киселевский). Больным с ХВГ проводилась аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим гистологическим и морфологическим исследованием полученных биоптатов печени. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином для выявления лимфоидной инфильтрации печени и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани. В лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН определяли иммунофенотип клеток печени методом иммуногистохимии на криосрезах и иммуноцитохимии на мононуклеарных клетках, выделенных из биоптатов. Из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов были приготовлены мазки, которые окрашивались эозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой. Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия).
Дополнительно проводилось ультразвуковое исследование печени. Таким образом, для решения поставленных задач каждому больному было проведено больше 40 специальных исследований. В сыворотке крови больных острыми и хроническими вирусными гепатитами определялись следующие показатели: 1. уровни ИЛ-6, ИЛ-ір, ФНО-а, IFN-а, IFN-y, IL-4. 2. титры аутоантител anti-LKM-1, ANA, АМА, ASMA, РФ 3.наличие криоглобулинов в динамике заболевания 4. белки core, NS3, NS4, NS5. 5. маркеры вирусных гепатитов. 6. уровни свободного и связанного билирубина, АЛТ, ACT, щелочной фосфатазы (ЩФ), ГГТ, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, СОЭ в динамике заболевания. 7. ДНК НВV, РНК HCV и генотипирование вируса. Объем крови для комплексного исследования составил 15мл. Кровь центрифугировали при 3000об\мин в течение 15 минут. Полученную сыворотку замораживалипри -20 С. 2.1. Определение уровней (ИЛ-ір, ИЛ-6, ИЛ-4,ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у). Определение уровней ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-4) производилось«сендвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (наборы реагентов ИЛ-ір, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-4 ООО «Протеиновый контур», С-Петербург). Сущность метода: соответствующий тип моноклональных антител иммобилизуется на внутренних поверхностях планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимым эпитопам ИЛ-ір, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-а находится в наборе в виде конъюгата с биотином. В первый вертикальный ряд ячеек планшета вносят по 100 мкл стандартов исследуемого цитокина в различных концентрациях: для ИЛ-lp: А"-1300 пг/мл, В,-750 пг/мл, С -250 пг/мл, D -50 пг/мл, Е -0 пг/мл цитокина; для ИЛ-6: А -500 пг/мл, В -250 пг/мл, С -100 пг/мл, D -50 пг/мл, Е -0 пг/мл цитокина; для ИЛ-10: А -0 пг/мл, В -62,5 пг/мл, С -250 пг/мл, D -500. пг/мл, Е -1000 пг/мл, F - 4000 пг/мл цитокина; для ФНО-а: А -1300 пг/мл, В -800 пг/мл, С -300 пг/мл, D-80 пг/мл, Е -0 пг/мл цитокина. В остальные ячейки вносят по 100 мкл образцов для определения ФНО-а, ИЛ-6 и по 200 мкл образцов для определения ИЛ-ір и ИЛ-10. Образцы и стандарты вносят в рекомендуемых буферах. Планшет инкубируют в течение 1 часа при определении ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10 и 2-х часов для ИЛ-lp при І температуре 37С и непрерывном встряхивании. После инкубации раствор из ячеек удаляется с помощью пипетки. Затем ячейки трижды промываются внесением 300 мкл промывочного раствора в каждую из , них. Остатки промывочного раствора удаляются с помощью пипетки.
Моноклональные антитела, меченные биотином, вносят в образцы по 100 мкл для ФНО-сс, ИЛ-б и по 200 мкл при определении ИЛ-13, ИЛ-10 и инкубируют при температуре 37С и непрерывном встряхивании в течении 30 минут. После инкубации раствор из ячеек удаляется с помощью пипетки. Ячейки трижды промываются внесением 300 мкл промывочного раствора в каждую из них. Остатки промывочного раствора удаляются с помощью пипетки.
После инкубации и промывки в ячейки вносят конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - индикаторным компонентом, имеющим очень высокое сродство к биотину. Конъюгат, разбавленный 1:40 для ФНО-а, ИЛ-6 и 1:20 для ИЛ-1(3, ИЛ-10 вносят по 200 мкл во все ячейки, вновь инкубируют 30 минут при 37С и непрерывном встряхивании, промывают, вносят по 200 мкл субстрат-хромогенной смеси во все лунки, инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых солнечных лучей месте. Останавливают реакцию добавлением 50 мкл раствора серной кислоты в каждую лунку.
Динамика аутоиммунных проявлений и уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ОВГВ
В группе больных ОВГС легкого течения РФ определялся в 1-ом периодез в титрах 1:2, 1:4, 1:8, во 2-ом периоде в титрах 1:2 и 1:8. Следует отметить, что титр 1:2 был зарегистрирован у болыпинства,больных - у 10 (22,7%) человек в 1 периоде и у 8 (18,2%) пациентов во 2-ом периоде. В группе больных среднетяжелого течения в разгар1 клинических проявлений и в периоде реконвалесценции РФ определялся в титрах 1:2, 1:4, 1:6 и 1:8. В 1-м периоде в большинстве случаев встречался титр 1:2 (у 11,9% больных) и 1:8 (у 10,9% пациентов), во 2-ом периоде наибольшую группу составили больные с титром 1:2 - 14 больных (15,2%). Достоверных отличий в частоте выявления РФ у больных ОВГС легкого и среднетяжелого течения в динамике заболевания не было. Наличие криоглобулинов у 56% больных ОВГС легкого течения и у 59% больных среднетяжелого течения нами было установлено в 1-ом периоде, причем у всех этих пациентов выявлен мочевой синдром (протеинурия, гематурия, лейкоцитурия и цилиндрурия), который сохранялся к моменту реконвалесценции. Несмотря на то, что в 1-ом периоде у 56% больных ОВГС легкого течения и у 59% больных среднетяжелого течения выявлена криоглобулинемия, ревматоидный фактор обнаружен только у 14% и- 28% из них соответственно. Это позволяет предположить, что в основном криоглобулинемия представлена поликлональными IgG, связанными с моноклональными IgM (криоглобулинемия II типа), в то время как криоглобулинемия IIIі типа (поликлональные IgG, связанные с поликлональными IgM с активностью ревматоидного фактора) выявлены у относительного незначительного числа больных ВГС. Для удобства сопоставления результатов мы перевели титры ревматоидного фактора в десятичные логарифмы.
У больных ОВГС легкого течения десятичный логарифм титров РФ в динамике заболевание не изменялся (колебался с 0,45±0,07 в 1 периоде до 0,42±0,08 во 2-ом периоде). У больных ОВГС среднетяжелого течения десятичный логарифм титров РФ в динамике заболевания снижался с 0,63±0,05 в 1-м периоде до 0,51±0,05 во 2-ом периоде. Следует отметить, что значения десятичного логарифма титров РФ у больных среднетяжелого течения были выше по сравнению с больными легкого течения, но достоверно не отличались.
Полученные нами результаты свидетельствуют, что аутоиммунные реакции у больных ОВГС на ранних этапах заболевания отражают глубокие структурные поражения гепатоцитов (66), поскольку продукция аутоантител обусловлена деструкцией гепатоцитов (4,7). Появление ASMA и АМА свидетельствует о глубоких структурных поражениях гепатоцитов (66); ANA о высокой воспалительной активности, что подтверждается высоким уровнем цитолитических ферментов у обследованных нами пациентов. В то же время известно об общности митохондрий млекопитающих и бактерий, особенно грамотрицательных энтеробактерий (66); что может обусловливать перекрестные реакции АМА с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, в избытке циркулирующих у больных ОВГ при недостаточной дезинтоксикационной функции печени в разгаре инфекционного процесса (66). Возможно, что АМА с самого начала направлены против антигенов энтеробактерий, и таким образом поддерживают аутоиммунный процесс. В нашем исследовании АМА диагностировались только в 1-ом периоде, при нарушенной дезинтоксикационной функции печени. Следовательно, появление АМА объясняется перекрестными реакциями с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, которые активируются в толстом кишечнике в разгаре интоксикации. ( Обнаружение анти-LKM-l напрямую связывают с молекулярной мимикрией между антигенными структурами квазивидов вируса и эпитопами клеток хозяина (66). В частности, установлена способность поверхностных белков HCV инициировать аутореактивность цитолитических лимфоцитов на эпитопы цитохрома Р450 2Д (66). У обследованных нами больных ОВГС легкого течения анти-LKM-l определялись только во 2-ом периоде, т.е. при длительной персистенции HCV вируса и достаточном, уровне вирусемии, обеспечивающем в результате сходства антигенов HCV с эпитопами клеток хозяина аутореактивность цитолитических лимфоцитов на эпитопы цитохрома Р450 2Д.
Обнаруженные КГ и РФ на ранних этапах инфекционного процесса свидетельствуют, что подобные аутоиммунные проявления возникают уже на ранних стадиях инфекционного процесса, что совпадает с единичными сообщениями в доступной нам литературе (2), в то время, когда большинство исследователей считает, что развитие криоглобулинемии является итогом длительной персистенции вируса (24,190,294,349).
Цитокиновый профиль и характер клеточной популяции в сопоставлении с гистологической активностью у больных ХВГВ и ХВГС
Полученные нами результаты даже на небольшой выборке больных свидетельствуют, что длительная персистенция HBV приводит к развитию аутоиммунных механизмов.
У 11 больных с хроническим вирусным гепатитом В была изучена сывороточная концентрация ИЛ-ір, ИЛ-6 и ФНО-а и аутоиммунные реакции. В связи с малым количеством больных в данной группе мы рассматривали уровни интерлейкинов не разделяя обследрванных на группы по гистологической активности. Уровни ИЛ-ір, ИЛ-6 и ФНО-а в сыворотке крови у больных ХВГВ с различными степенями гистологической активности представлены в таблице 76. Как видно из таблицы 76, у больных ХВГВ уровень ИЛ-ір и ФНО-а в сыворотке значительно превышал контрольные значения на фоне нормальных значений уровня ИЛ-6, что отражает подавление гуморального звена иммунитета. Для исследования резервных возможностей МНПК мы исследовали уровень стимулированных ФГА и NDV ФНО-а , ИЛ-ір и ИЛ-6 (таблица 77). Как видно из таблицы 77, стимулированный ФГА и NDV уровень ФНО-а значительно превышал контрольные значения, в то время как концентрация ИЛ-ір после стимуляции наоборот снижалась, а низкий уровень ИЛ-6 после стимуляции возрастал до высоких значений. Снижение выработки ИЛ-ір после стимуляции МНПК ФГА и NDV вероятно можно объяснить истощением резервных возможностей макрофагов и клеток Купфера на фоне раздражения Txl-лимфоцитов длительной вирусемией. Повышение ФНО-а после стимуляции МНПК ФГА и NDV вероятно отражает действие скрытых механизмов развития аутоиммунных механизмов, так как известно, что ассоциированный с макрофагами ФНО- а и экспрессируемые Txl-лимфоцитами ИЛ-2 и ИФН-у скорее всего отвечают за активацию и прогрессирование аутоиммунных механизмов в печени (32). Повышенная стимулированная NDV и ФГА продукция МНПК ИЛ-6 отражает сохранение резервных возможностей МНПК к антителообразованию. Данные антитела не обладают вируснейтрализующим действием и способствуют формированию хронического процесса, так как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых Тп2-клетками, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса (31,54,68,96,154,198,245). Следовательно, циркулирующие при ХВГ антитела не обеспечивают элиминацию вируса.
У больных ХВГВ уровень ИЛ-4 в сыворотке крови был достоверно ниже контрольных значений, уровень спонтанного ИЛ-4 соответствовал нулю. После стимуляции ФГА и NDV МНПК концентрация ИЛ-4 значительно превышала контрольные значения.
Как известно, ИЛ-4 стимулирует Т - лимфоциты, способствуя дифференцировке Тп2-лимфоцитов и усиливая тем самым антителообразование (217,295,307). Поэтому повышенная стимулированная NDV и ФГА продукция МНПК ИЛ-4 вместе с ИЛ-6 отражает сохранение резервных возможностей МНПК к антителообразованию при недостаточности клеточного звена иммунитета, что при вирусных инфекциях автоматически ведет к формированию хронического процесса, в основе которого лежит персистенция вируса. Следует отметить, что после стимуляции Т-клеточным митогеном ФГА концентрации ИЛ-б и ИЛ-4 повышаются значительнее, чем после стимуляции NDV, что косвенно отражает резервные возможности Т - лимфоцитов.
У больных ХВГВ в сыворотке крови IFN-a и IFN-y определялись в пределах контрольных значений, однако после стимуляции NDV уровень IFN-a значительно возрастал, а уровень IFN-y увеличивался после стимуляции MFflTK ФГА (таб. 79).
Максимальное повышение IFN-a после стимуляции NDV отражает резервные возможности МНПК, которые реализуются только после стимуляции NDV, который усиливает в макроорганизме выработку интерферонов и ФНО-a, что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток (28). Полученные нами результаты подтверждают литературные данные о том, что концентрация ФНО-a и IFN-a достигает максимальных значений после стимуляции NDV МНПК. В свою очередь ФГА стимулирует выработку IFN-y, что и нашло подтверждение в наших результатах исследования, когда после стимуляции ФГА МНПК уровень IFN-y был наиболее высоким.
Полученные результаты свидетельствуют, что уровень цитокинов в сыворотке крови не отражает резервные возможности МНПК. После стимуляции МНПК NDV усиливается выработка IFN-a, что может найти практическое применение в лечении больных ХВГВ.
