Введение к работе
Актуальность исследования
Острые кишечные инфекции (ОКИ) продолжают занимать существенное место в структуре инфекционных заболеваний, уступая по распространенности лишь острым респираторным вирусным инфекциям. [Онищенко Г.Г. с соавт., 2004-2008J. Ежегодно в мире число заболевших ОКИ достигает в 3-5 млрд. человек, при этом 5-10 млн. больных умирают [Guerrant R.L. et al., 2001, Thielman N.M. et al., 2004]. Как в развивающихся, так и в индустриально развитых странах, несмотря на определешіьіе успехи в диагностике и лечении, проблема ОКИ стоит достаточно остро [Подколзин А.Т. с соавт., 2007, М. de Wit, 2001, Parashar U.D., et al., 2003].
Значимость этой проблемы в патологии человека в настоящее время подтверждается также наблюдаемыми качественными изменениями в структуре и характере течения острых кишечных заболеваний [Michael J. Et al., 2006, de Wit et al, 2001, Wilhelmi I. et al, 2003]. Однако этиологическая диагностика их во многих случаях поздняя, большинство диарей остаются нерасшифрованными. В соответствии с официальной статистикой федерального Центра Госсанэпиднадзора РФ, в период с 2000 по 2004 год регистрировалось до 65-75% ОКИ с неустановленной этиологией. В 2006 г. заболеваемость ОКИ неустановленной этиологии составила 306,0 на 100 000 населения [Онищенко, Г.Г., 2008]. Поэтому современная этиологическая диагностика ОКИ характеризуется непрерывным совершенствованием уже существующих традиционных методов исследования и поисками новых, более эффективных направлений диагностики. Примером такого направления может служить молекулярная клиническая диагностика, и, в частности, методы, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) и различных ее модификаций. В отечественной литературе уже имеется ряд сообщений о преимуществе метода полимеразной цепной реакции в
этиологической расшифровке ОКИ [Подколзин А.Т. и соавт., 2003, Орлова К.А и соавт., 2003, Мазанкова Л. Н. и соавт., 2004]. Особенно перспективными в диагностике ОКИ являются методы, основанные на мультиплексной ПНР, когда появляется возможность единовременного выявления широкого спектра возбудителей, что существенно сокращает сроки этиологической верификации диагноза.
Одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии являются микрочипы, в частности, ДНК - чипы, позволяющие определять наличие в анализируемом материале большого количества разнообразных последовательностей ДНК [Мирзабеков А.Д. и соавт., 2003]. Тип ДНК-чипов, так называемые «чипы с низкой плотностью» (low density microarrays), достаточно широко применяются для обнаружения различных инфекционных агентов. Основным достоинством такого подхода является возможность быстрого и одновременного выявления множества потенциальных патогенов бактериальной и вирусной природы [Jaaskelainen A.J. et al.,2006]. Таким образом, биологические микрочипы служат идеальной платформой для единовременного выявления широкого спектра возбудителей.
Цель работы - разработка и клиническое применение биологических ДНК - микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы.
Задачи исследования:
1. Разработать и оптимизировать методику детекции генетического материала основных возбудителей острых кишечных инфекций бактериальной этиологии в копрофильграте с применением биологических ДНК-микрочипов.
Дать сравнительную характеристику диагностической эффективности бактериологического и ПЦР методов исследования в этиологической расшифровке ОКИ бактериальной природы.
Изучить особенности клинического течения ОКИ у больных в зависимости от метода верификации диагноза.
Оценить диагностические возможности детекции бактериальных возбудителей ОКИ с использованием ДНК-микрочипов на клиническом материале в сопоставлении с результатами референтного ПЦР исследования.
Впервые разработана диагностическая ПЦР тест-система для детекции трех патогенных и двух условно-патогенных микроорганизмов -бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций: Salmonella spp., Shigella spp. и Enteroinvasive Escherichia coli (ElEC), Campylobacter jejuni, Klebsiella pnneumoniae, Proteus mirabilis.
Впервые разработана методика идентификации бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций с использованием ДНК-микрочипов.
Клинически обосновано применение биологических микрочипов в диапіостике острых кишечных инфекций путем применения метода на копрофильтрате больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии.
Дана сравнительная характеристика метода диагностики ОКИ с использованием ДНК-микрочипов с бактериологическим и ПЦР методами
диагностики, описаны факторы, влияющие на результативность и информативность различных методов этиологической верификации ОКИ.
При использовании биологических ДНК-микрочипов описаны особенности клинического течения ОКИ при выявлении ассоциаций патогенных кишечных бактерий и условно-патогенных бактерий рода Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis.
Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики
острых кишечных инфекций бактериальной этиологии, который позволяет в
течение 12-14 часов протестировать диагностический
материал(копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов - патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ.
Разработанная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет единовременно выявлять в исследуемом материале следующие микроорганизмы: Shigella spp.+ЕШС, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis и не уступает по чувствительности и специфичности применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.
Результаты клинического применения метода позволили показать возможность использования методики на материале, полученном от больных.
Сравнительно невысокая себестоимость, автоматизация и неинвазивность диагностического процесса являются несомненными преимуществами предлагаемого метода олигонуклеотидного биочипа для диагностики ОКИ бактериальной этиологии.
Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления широкого спектра возбудителей на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.
Разработана диагностическая тест-система на основе мультиплексной ПЦР для единовременного выявления и идентификации ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций, а именно Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью, не уступающей специфичности и чувствительности используемых в настоящее время тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.
Разработан биологический ДНК - микрочип для комплексной этиологической верификации ОКИ бактериальной природы.
Информативность бактериологического исследования в этиологической верификации ОКИ достоверно уменьшается при заборе материала после использования антибактериальных препаратов, тогда как информативность метода ПЦР после этиотропной терапии достоверно не меняется.
При использовании биологических микрочипов появляется возможность сократить сроки исследования по сравнению с рутинными методами диагностики, выявлять ассоциации микроорганизмов, характерные для острых кишечных инфекций, а также описать особеноости клинического течения при выявлении ассоциаций патогенных и условнопатогенных кишечных бактерий Shigella+Klebsiella, в отличие от моно-инфекцией Shigella.
Разработанная мультиплексная система для идентификации возбудителей ОКИ бактериальной природы с детекцией результатов с использованием биологических микрочипов «ММТест-ОКИ-ГЩР-Биочип» успешно прошла первый этап испытаний в диагностической лаборатории НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифософского. Материалы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании соответствующего раздела.
Основные положения и результаты исследования были обуждены на VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, РУДН, ноябрь, 2007); научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н. Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного государственного больничного дела, медицинского образования и науки№ (Москва, 2007), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО (Москва, 2008), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Василенковские чтения), посвященной памяти академика В.Х. Василенко (20 ноября, 2008г., Москва), а также на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней и общебольничных конференциях 4 ГКБ. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний ГОУ ВПО
ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генной инженерии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова 13 июня 2009г.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на
страницах и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Библиография включает 209 отечественных и зарубежных источника. Полученные результаты иллюстрированы 18 таблицами и 23 рисунками.
![Комплексное лечение ишемических инсультов с применением препаратов нейропептидной природы [Электронный ресурс]](/i/i/4399/180664.png "Комплексное лечение ишемических инсультов с применением препаратов нейропептидной природы [Электронный ресурс] Потапова Алла Александровна")
