Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Приближенное аналитическое описание движения ионов в радиочастотном (RF) квадруполе с газом в случае дополнительного вращающего электрического поля 20
2.1. Дрейф ионов в газе в случае постоянного электрического поля 21
2.2. Движение ионов в газонаполненном RF-квадруполе с дополнительным вращающим полем 22
2.3. Выводы 29
Глава 3. Моделирование движения ионов в газонаполненном RF-квадруполе с дополнительным вращающим полем 30
3.1. Ланжевеновская модель взаимодействия 30
3.2. Комбинированная модель взаимодействия 36
3.3. Выводы 40
Глава 4. Экспериментальная демонстрация возможностей метода 41
4.1. Времяпролетный масс-спектрометр 41
4.2. Молекулярно-ионный реактор (МИР-2) 44
4.3. Периферийное оборудование 46
4.4. Программа регистрации 47
4.5. Экспериментальное тестирование метода 49
4.7. Выводы 61
Глава 5. Аналитический подход к определению кинетических параметров реакций фрагментации ионов в МИР-2 63
Глава 6. Измерение подвижности ионов 67
6.1. Измерение подвижности ионов по их уходу на стержни квадруполя 67
6.2. Измерение подвижности ионов по времени их дрейфа в МИР-2 72
6.3. Выводы 94
Глава 7. Исследование кинетики реакций фрагментации ионов в МИР-2 96
7.1. Тестирование метода на примере реакции диссоциации комплексных ионов Cs+»H20 96
7.2. Исследование кинетики реакций фрагментации ионов: грамицидина С ([М+2Н] ), металл оорганического комплекса ([Fe3OL3+H]2+) и 9-(4-азидофенил) N-метилакридиния ([А]) 102
7.3. Исследование реакций фрагментации катион-радикалов комплексов [MX(DPPE)2] (М - Mo, W; X = (N2)2, (СО)2, Ы,) 106
7.4. Выводы 115
Выводы. 116
Список литературы 118
- Движение ионов в газонаполненном RF-квадруполе с дополнительным вращающим полем
- Комбинированная модель взаимодействия
- Измерение подвижности ионов по их уходу на стержни квадруполя
- Исследование кинетики реакций фрагментации ионов: грамицидина С ([М+2Н] ), металл оорганического комплекса ([Fe3OL3+H]2+) и 9-(4-азидофенил) N-метилакридиния ([А])
Введение к работе
За последние двадцать лет масс-спектрометрия стала одним из наиболее значимых аналитических методов исследования структуры сложных органических ионов и их газофазных реакций. Ранее в высокомолекулярной химии и биологии масс-спектрометры применялись для исследования ограниченного класса молекул, поскольку стабильно работающие ионные источники с электронным ударом предполагали термическое испарение образца в газовую фазу, что оказывалось эффективным только для термоустойчивых, летучих низкомолекулярных соединений. Структурные исследования основывались на изучении продуктов неконтролируемой диссоциации молекулярных ионов, происходящей либо в области ионизации, либо в бесполевом пространстве между ионным источником и масс-анализатором (метастабильные ионы). Появление и развитие методов "мягкой" ионизации, таких как ионизация электрораспылением (ESI) [1-8] и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) [9-14], а также использование методов тандемной масс-спектрометрии (MS/MS, MSn) [15,16], позволили существенно расширить область применения масс-спектрометрии для исследования структуры и газофазных превращений макроионов, включая квазимолекулярные ионы протеинов, полинуклеотидов, синтетических полимеров, металлоорганических комплексов и т.д.
В этот же период времени произошел резкий подъем в развитии времяпролетных масс-анализаторов, имеющих ряд принципиальных преимуществ перед другими масс-анализаторами: "неограниченный" диапазон масс регистрируемых ионов, высокая скорость регистрации спектров, одновременная регистрация в масс-спектре ионов в широком диапазоне отношения массы к заряду (m/z). Этот подъем объясняется несколькими причинами: увеличением интереса к использованию в масс- спектрометрии новых методов импульсной ионизации (лазерных, пучковых, радиоактивных); введением рефлектора в конструкцию масс-анализатора, что существенно повысило разрешение прибора [17]; прогрессом в цифровой электронике. Появление же ионных источников типа MALDI привело к настоящему триумфу времяпролетных масс-анализаторов. Действительно, импульсный характер ионизации при MALDI, а также то обстоятельство, что десорбция с плоскости решает проблему "времени разворота" (как поначалу казалось), сделали времяпролетные масс-анализаторы "масс-анализаторами для MALDI".
Ионные источники типа ESI, появившиеся несколько раньше источников MALDI и дающие квазинепрерывный поток ионов, первоначально использовались на магнитных и квадрупольных масс-спектрометрах; применение их в случае времяпролетного масс-спектрометра требовало стробирования ионного пучка, что приводило к катастрофическому падению эффективности использования ионного тока (0.1 % и меньше). Эта проблема была решена изобретением и созданием нового типа времяпролетных масс-спектрометров с ортогональным вводом ионов (О-ВПМС) [18]. Первый О-ВПМС ("рефлектрон") с ионным источником типа ESI, имеющий разрешение - 2000 на полувысоте пика, был создан в 1987 году в ФИНЭПХФ РАН (лаборатория проф. А.Ф.Додонова) [19]. Был проведен подробный анализ причин, влияющих на разрешение прибора такого типа, и сделаны теоретические оценки максимально достижимой разрешающей способности [20-22]. В результате сотрудниками ФИНЭПХФ РАН при участии автора в 1998 г. был создан О-ВПМС высокого разрешения, имеющий на тот момент рекордные характеристики для приборов такого класса (рабочее разрешение на полувысоте пика ~ 15000, точность определения величины m/z при внешней калибровке ~ 10"5) [23,24].
При работе с ионным источником типа ESI необходимым элементом масс-спектрометра является газодинамический интерфейс (несколько ступеней б дифференциальной откачки), посредством которого ионы транспортируются из области атмосферного давления в масс-анализатор, рабочее давление в котором — 10" -f 10" тор; при этом для повышения чувствительности необходима фокусировка ионов в условиях фоновых давлений ~ 1 4- 10"3 тор. Первоначально радиочастотные (RF) квадруполи в масс-спектрометрии использовались в качестве ячейки столкновений в квадрупольных тандемных масс-спектрометрах [25]. В 1992 г. было обнаружено явление столкновителыюй фокусировки ионов в RF-квадруполе при повышении давления буферного газа с 1 до 10 мтор [26]. Ионы, движущиеся под действием переменного радиочастотного (RF) поля, нормализуют свою энергию в столкновениях с молекулами буферного газа и фокусируются на оси квадруполя, т.е. фазовый объем ионного пучка уменьшается и распределение ионов по энергии приближается к Максвелл-Больцмановскому, соответствующему температуре буферного газа [27]. Такой способ уменьшения фазового объема оказался перспективным не только для развития квадрупольной тандемной масс-спектрометрии [28], но и для использования RF-квадруполя в интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра, поскольку разрешающая способность и чувствительность О-ВПМС напрямую связаны с фазовым объемом ионного пучка [23,29]. После первых удачных применений газонаполненного (несколько десятков мтор) RF-квадруполя для фокусировки и нормализации энергий ионов в О-ВПМС с ионными источниками типа ESI [30,31] и MALDI [32] эти устройства стали использоваться в газодинамическом интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом для транспорта и фокусировки ионов и в качестве ячеек столкновений в MS/MS приборах с времяпролетным масс-анализатором [33,34].
Традиционно фокусировка ионов в первой ступени дифференциальной откачки масс-спектрометра осуществлялась постоянным электрическим полем с помощью плоского или конического электрода перед скиммером. Сотрудниками ФИНЭПХФ РАН впервые для фокусировки ионов в первой ' ступени О-ВПМС был использован сегментированный RF-квадруполь, работающий при давлении буферного газа ~ 1 тор (молекулярно-ионный реактор — МИР) [23,35]. Его конструкция позволила фокусировать ионы RF-полем и двигать их вдоль оси квадруполя контролируемым постоянным продольным полем. Было обнаружено новое явление селективной пороговой ф) активации (в столкновениях с молекулами буферного газа) и фрагментации ионов при приближении к пределу неустойчивости Матье и показана возможность использования такого способа селективной фрагментации для анализа структуры исследуемых ионов [36]; таким образом, использование МИРа в газодинамическом интерфейсе О-ВПМС придавало масс- ~ спектрометру функции тандемного прибора. Сочетание селективной активации исследуемых ионов и их контролируемого времени пребывания в МИРе (времени реакции фрагментации) позволяло, в принципе, использовать этот квадруполь для исследования кинетики реакций фрагментации- Однако, трудность контроля степени «разогрева» исходных ионов в условиях » неустойчивого движения и невозможность регистрации ионов-фрагментов с величинами m/z, меньшими, чем у исходного иона ограничивали возможности использования МИРа для исследования кинетики реакций фрагментации. Движение ионов в МИРе под действием продольного электрического поля также (при определенных условиях) приводило к ^. значительному (выше 1000 К) увеличению их внутренней температуры, активируя различные реакции фрагментации, кинетика которых исследовалась [23]. Однако, и в этом случае имели место некоторые ограничения, вызванные "жесткой" связью между временем реакции и степенью «разогрева» исходных ионов (время реакции пропорционально 1/AU, а превышение внутренней температуры исходных ионов над температурой буферного газа пропорционально (AU)2, где AU - падение напряжения вдоль квадруполя), а также процессами декластеризации ионов, - идущими в МИРе, эффективность которых также зависела от величины AU.
Предложенный д.ф.-м.н. В.В.Разниковым и проф. А.Ф.Додоновым способ селективной активации исследуемых ионов в столкновениях с молекулами буферного газа посредством резонансного возбуждения вращательного движения этих ионов в RF-квадруполе лег в основу нового метода изучения ^ газофазных превращений ионов. Разработанный и реализованный при участии автора и описанный в диссертации метод позволяет исследовать процессы фрагментации сложных ионов для получения информации об их структуре и определять кинетические параметры реакций фрагментации. Достоинствами данного метода являются: высокая селективность активации исходных ионов; высокая эффективность регистрации первичных ионов-фрагментов в широком диапазоне m/z;
3. подавление вторичной фрагментации ионов-фрагментов;
4. возможность контролируемого изменения внутренней температуры исходных ионов при неизменном времени реакции.
Для реализации данного метода создан уникальный молекулярно-ионный реактор (МИР-2), представляющий собой газонаполненный сегментированный радиочастотный квадруполь с постоянным электрическим полем вдоль оси и дополнительным вращающим электрическим полем.
МИР-2 является интерфейсом ортогонального времяпролетного массив спектрометра высокого разрешения и позволяет исследовать реакции фрагментации в режиме непрерывного тока ионов.
На базе МИР-2 реализована методика измерения подвижности ионов при селективном возбуждении их вращательного движения в газонаполненном RF-квадруполе. Эта методика позволяет исследовать изменение подвижности ионов при вариации их средней кинетической энергии дрейфового движения. Такие измерения существенно уточняют определение кинетических параметров реакций фрагментации и дают информацию о пространственной структуре исследуемых ионов.
Цель работы:
Разработка нового метода исследования превращений сложных органических ионов при их селективном возбуждении в газонаполненном радиочастотном квадруполе времяпролетного масс-спектрометра.
Сюда включались: Теоретический анализ и компьютерное моделирование движения ионов в сегментированном радиочастотном квадруполе с газом в случае дополнительного переменного электрического вращающего поля для исследования возможностей разрабатываемого метода. Экспериментальное тестирование метода для исследования процессов фрагментации различных ионов при их резонансном вращательном возбуждении в МИР-2.
Разработка подхода к исследованию кинетики реакций фрагментации ионов с использованием МИР-2.
Реализация методики измерения подвижности исследуемых ионов при селективном возбуждении их вращательного движения в МИР-2. Исследование кинетики реакций фрагментации сложных органических ионов. Диссертационная работа состоит из введения и семи глав.
В первой главе приведен обзор литературы, посвященной селективной фрагментации ионов при их резонансном возбуждении в газонаполненном линейном радиочастотном квадруполе.
Вторая глава посвящена теоретическому анализу движения иона в радиочастотном квадруполе с газом при наличии дополнительного вращающего переменного электрического поля. Предлагаемое аналитическое описание было разработано в рамках Ланжевеновской модели взаимодействия ионов с молекулами газа (взаимодействие заряда с индуцированным диполем). Показано, что возбуждение вращения ионов с определенной величиной m/z вокруг оси квадруполя носит резонансный характер и может быть использовано для селективной активации ионов в столкновениях с молекулами газа.
Третья глава посвящена компьютерному моделированию движения ионов в радиочастотном квадруполе с дополнительным вращающим электрическим полем.
В четвертой главе описана экспериментальная установка, включающая в себя: времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения с ортогональным вводом ионов, молекулярно-ионный реактор нового типа (МИР-2) и периферийное оборудование. Приведены результаты экспериментального тестирования разрабатываемого метода, которые подтверждают справедливость аналитического описания и компьютерного моделирования движения иона в радиочастотном квадруполе с газом при наличии вращающего электрического поля, а также демонстрируют перспективность использования этого метода для исследования процессов фрагментации сложных органических ионов.
Пятая глава посвящена разработке подхода к исследованию кинетики реакций фрагментации ионов при их активации в столкновениях с молекулами буферного газа в МИР-2.
В шестой главе описана методика измерения подвижности исследуемых ионов при селективном возбуждении их вращательного движения в МИР-2. Измерения подвижностей исходных ионов в экспериментальных условиях близких к условиям кинетических экспериментов существенно уточнили определение кинетических параметров реакций фрагментации. Полученные зависимости подвижностей различных ионов от среднеквадратичной
11 скорости относительного движения ионов и молекул буферного газа сравниваются с выводами упрощенного аналитического описания и результатами компьютерного моделирования.
Седьмая глава посвящена исследованию кинетики реакций фрагментации различных ионов. Проведено тестирование метода на примере известной реакции диссоциации комплексного иона Cs+»H20. Определены величины энергии активации для ряда реакций фрагментации сложных органических ионов и проведен анализ полученных экспериментальных данных.
Благодарност и
Автор выражает благодарность своему научному руководителю, доктору физико-математических наук, Валерию Владиславовичу Разникову за постановку задач, постоянное внимание и помощь в работе.
Выполнение данной работы было бы невозможно без участия в ней профессора, доктора физико-математических наук, заведующего лабораторией «Масс-спектрометрия в энергетике и экологии» ФИНЭПХФ РАН, Александра Федоровича Додонова, безвременно ушедшего от нас 31 августа 2005 года.
Автор искренне благодарен: к.ф.-м.н. В.И.Козловскому за неоценимую помощь в работе; А.Р.ГТихтелеву за предоставленные программы регистрации и обработки масс-спектров; Т.Хорвату, А.Н.Комину и В.С.Брусову за техническую помощь в организации экспериментов; профессору, д.х.н. А.А.Штейнману и к.х.н. В.Д.Махаеву за предоставленные для исследования образцы и ценные советы при обсуждении результатов; профессору Г.Вольнику, к.ф.-м.н., И.В.Чернушевичу и к.ф.-м.н. А.В.Лободе за всестороннюю поддержку в работе.
Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории "Масс-спектрометрия в энергетике и экологии" ФИНЭПХФ РАН за помощь в работе, теплое отношение и дружеское участие.
Движение ионов в газонаполненном RF-квадруполе с дополнительным вращающим полем
В последние годы широкое распространение для исследования реакций с участием ионов в MS/MS масс-спектрометрии получили методы "медленного разогрева" ионов [74], к которым относятся: активация ионов в столкновениях с молекулами буферного газа (CID или CAD) (как вариант, активация ионов в столкновениях с газом при их возбуждении в камере FTICR на частоте близкой к резонансной (SORI)), инфракрасная многофотонная активация (IRMPD), активация инфракрасным излучением абсолютно черного тела (BIRD) [75]. Эти методы обеспечивают контролируемую (в той или иной степени) квазинепрерывную накачку внутренней энергии ионов до состояния активации за время 10"6 -ь 10 сек (в зависимости от способа активации и условий, в которых он реализуется). Наиболее распространенным среди этих методов является СЮ. После первых наблюдений процессов фрагментации ионов биополимеров при столкновениях с молекулами буферного газа в ESI-интерфейсе MS/MS квадрупольного масс-спектрометра [76] началось активное развитие метода CID для исследования превращений макроионов с помощью тандемной масс-спектрометрии, прежде всего, в масс-спектрометре с квадрупольной ионной ловушкой (3-D) в условиях резонансного возбуждения [77-86]. С помощью метода CID оказалось возможным не только качественно исследовать реакции фрагментации исходных ионов, но и определять кинетические параметры этих реакций (энергию активации и предэкспоненциальный фактор) [80-86]. Основная трудность заключалась в определении внутренней температуры исходных ионов в зависимости от экспериментальных условий (свойств исходного иона; электрических полей, в которых исходный ион ускорялся между столкновениями с молекулами буферного газа; свойств буферного газа). В ряде работ, в которых использовались различные подходы к решению этой проблемы [79,80,87,88], приведены близкие оценочные выражения для расчета внутренней температуры ионов в условиях CID.
G.Beaugrand et al. [89,90] впервые продемонстрировали эффект удержания ионов в линейном (2-D) RF-квадруполе (столкновительной ячейке MS/MS квадрупольного масс-спектрометра) для увеличения времени химической реакции с участием ионов. C.M.Whitehouse et al. [91] продемонстрировали увеличение чувствительности масс-спектрометра, обусловленной эффектом накопления ионов в 2-D квадрупольной ловушке, состыкованной с времяпролетным масс-анализатором. J.M.Campbell et al. [92] впервые применили резонансное «дипольное» возбуждение ионов в 2-D ионной ловушке, соединенной с линейным О-ВПМС. На пару противоположных стержней газонаполненного (N2, р = 1 мтор) RF-квадруполя (длина квадруполя, Lo = 20 см; вписанный радиус квадруполя, R0 = 4 мм) помимо базового RP-напряжения {URF - амплитуда, CORF - частота) подавалось дополнительное переменное напряжение. В течение первого полупериода удержания ионов в ловушке (4 мсек) подавалось широкополосное переменное напряжение (сумма синусоидальных напряжений с частотами в интервале от 10 до 500 кГц (шаг - 500 Гц) и амплитудами 30 В) с "окном" шириной 7 кГц и центром на частоте м = гг QM (основная резонансная частота для иона с величиной отношения массы к заряду m/z), где т/ 2 в2 " паРаметР Матье. Это приводило к тому, что только исходные ионы оставались в ловушке, а остальные уходили из объема квадруполя. Затем в течение 4 мсек осуществлялось резонансное возбуждение изолированного исходного иона переменным напряжением с частотой (ОгМ. Полный MS/MS цикл (инжекция ионов в ловушку + изоляция $ исходного иона + резонансное возбуждение + инжекция из ловушки и регистрация ионов в О-ВПМС) занимал 20 мсек. Были получены резонансные кривые как для исходного иона так и для суммы ионов-фрагментов (зависимости числа ионов от частоты «дипольного» возбуждения) и определена селективность «дипольного» возбуждения. Для трехзарядного иона ренина (renin) (m/z = 587, со= 221 кГц) она была 70, для однозарядного иона резерпина (reserpine) (m/z = 609, (О = 181 кГц) — 60. Эффективность регистрации ионов-фрагментов (отношение количества всех зарегистрированных ионов-фрагментов к убыли исходных ионов в результате реакции фрагментации) не превышала 50 % . Не удалось добиться полной изоляции исходных ионов, поскольку эффективность удаления ионов из квадруполя оказалась зависимой от величины m/z (ионы с большими m/z труднее удалялись из ловушки), а увеличение амплитуды широкополосного переменного напряжения приводило к частичной фрагментации изолируемых исходных ионов. Дальнейшая разработка этого метода [93-96] позволила повысить разрешение «дипольного» возбуждения для трехзарядных ионов ренина до 240 при уменьшении давления азота в квадруполе до 1.8 мтор, а также продемонстрировать MS3 свойства 2-D ионной ловушки с резонансным «дипольным» возбуждением ионов (введением двух последовательных циклов - (изоляция + возбуждение) для исходного иона и одного из ионов фрагментов) [94]. Однако, эффективность регистрации ионов-фрагментов в случае фрагментации трехзарядных ионов ренина уменьшилась в два раза по сравнению со случаем р = 7 мтор, а полный MS/MS цикл составил 34 мсек. В MS3 эксперименте эффективность регистрации ионов-фрагментов при селективной фрагментации трехзарядных ионов ренина была 18%, а при селективной фрагментации двухзарядного иона-фрагмента (m/z = 747) 60 %, полный MS3 цикл - 40 мсек. Позднее авторы использовали метод резонансного «дипольного» возбуждения в Q3- квадруполе модифицированного тандемного квадрупольного масс спектрометра API 4000 при давлении газа 0.05 мтор [96]. Была продемонстрирована высокая селективность резонансного «дипольного» возбуждения однозарядных ионов резерпина ( 1000), эффективность регистрации ионов-фрагментов составила - 40 %, однако, полный MS/MS цикл увеличился до 1 сек.
Поскольку источники типа ESI дают квазинепрерывный поток ионов, в целях более эффективного использования ионного тока и, как следствие, появления возможности работать с малыми количествами исследуемого образца, актуально разрабатывать методы селективной фрагментации исследуемых ионов в режиме непрерывного тока ионов. Возможность индуцирования селективной фрагментации ионов в устройствах с непрерывным током ионов была впервые продемонстрирована А.Ф.Додоновым с коллегами [36] при использовании газонаполненного ( 1 тор) сегментированного RF-квадруполя (L0 = 25 мм, Я0 = 2 мм), являющегося низко вакуумным интерфейсом О-ВПМС. Было обнаружено новое явление селективной пороговой активации ионов при приближении к пределу неустойчивости Матье и показана возможность использования такого способа фрагментации для анализа структуры исследуемых ионов, в частности, для определения первичной структуры (сиквенса) пептидов. Однако, невозможность регистрации ионов-фрагментов с величинами m/z, меньшими, чем у исходного иона, существенно усложняла анализ реакций фрагментации.
Комбинированная модель взаимодействия
Далее программа рассчитывала, решая систему уравнений движения иона в заданных полях методом Рунге-Кутта, координаты точки столкновения и скорость иона в момент столкновения, используя данные о начальном положении иона и о его начальной скорости. Дня Ланжевеновского типа взаимодействий распределение молекул, сталкивающихся с ионами, по скоростям совпадает с распределением по скоростям молекул внутри объема (Максвелловским распределением). Исходя из этого положения, моделировалась случайная скорость сталкивающейся молекулы. Считая, что угол рассеяния иона на молекуле в системе центра масс сталкивающихся частиц является случайной изотропно-распределенной величиной, моделировался этот случайный угол рассеяния иона в системе центра масс и рассчитывалась скорость иона после столкновения (из законов сохранения энергии и импульса для упругих столкновений). Координаты ионов в точках столкновений и скорости ионов после столкновений использовались для расчета средней кинетической энергии быстрых осцилляции ионов в радиочастотном (RF) поле и средней кинетической энергии ионов. Точка столкновения считалась новой точкой старта, а полученная скорость иона после столкновения - новой начальной скоростью иона, затем моделирование повторялось для заданного числа столкновений.
Все расчеты были выполнены для реальной геометрии сегментированного RF-квадруполя. Его длина 17 см, вписанный радиус квадруполя 3.6 мм, диаметр стержней 8.0 мм. Для создания вдоль оси квадруполя однородного продольного электрического поля стержни квадруполя поделены на сегменты длиной 6 мм с промежутками 0.1 мм между ними. На расстоянии 2 мм от последнего сегмента располагается плоскость при нулевом потенциале с выходным отверстием диаметром 2 мм.
На первом этапе моделирования использовались теоретические выражения для электрических полей в RF-квадруполе, действующих на небольших расстояниях от оси квадруполя. На рис.3.1 представлены результаты моделирования и результаты расчетов с помощью аналитических выражений.
Результаты моделирования движения ионов в RF-квадруполе в случае дополнительного вращающего поля при заданных экспериментальных условиях находятся в согласии с проведенным ранее (глава 2) аналитическим рассмотрением. Все важные параметры резонансных кривых, такие как: резонансная частота вращения, амплитуда и ширина резонансной кривой близки к параметрам, полученным аналитически (указаны в скобках на рис.3.1). Средняя кинетическая энергия ионов в условиях резонанса с хорошей точностью совпадает с удвоенной величиной средней кинетической энергии быстрых осцилляции ионов, в соответствии с выражением (2.36).
Поскольку уравнение (2.16), описывающее движение иона в RF-квадруполе с дополнительным вращающим полем, является линейным, естественно ожидать, что сумма вращающих полей с различными частотами привела бы к соответствующей сумме решений для каждого из полей. На рис.3.2 показаны результаты моделирования движения ионов с различными величинами m/z под действием двух вращающих полей. Амплитуды вращающих напряжений одинаковые, а частоты сдвинуты на 10 % от резонансной частоты для ионов с m/z = 1000 в ту и другую сторону.
Резонансные кривые на рис.3.2 демонстрируют принципиальную возможность активации и фрагментации не только исходных ионов с помощью вращающего поля, но также ионов, которые являются продуктами первичной фрагментации, и, таким образом, возможность наблюдать вторичные процессы фрагментации исследуемых ионов.
Для более реального представления электрических полей в RF-квадруполе, чем это было в случае использования простых аналитических формул, были рассчитаны три потенциальных массива с использованием широко известной программы SIMION 6.0. Первый из них, предназначенный для моделирования RF-поля, был рассчитан для описанной выше геометрии квадруполя с потенциалом на вертикальной паре стержней +1.01 В и потенциалом на горизонтальной паре -1.01 В. Нецелочисленные величины потенциалов были использованы для предотвращения вычисления базовых полей для каждого электрода. В случае целочисленных величин потенциалов программа SIMION 6.0 рассчитала бы ряд потенциальных массивов, соответствующих нулевому потенциалу на всех других электродах системы кроме выбранных. Потенциалы для других проводящих частей квадруполя были положены равными нулю. Для того, чтобы уменьшить количество точек для расчета потенциального массива, были использованы зеркальные симметрии для х - (горизонтального), - (вертикального) и z - (аксиального) направлений. Для того, чтобы рассчитать RF-поле в выбранной точке, были рассчитаны соответствующие производные потенциала для каждого направления, используя параболическое приближение для трех точек, ближайших к выбранной точке. Чтобы получить величины потенциалов для этих трех точек была использована линейная интерполяция между вершинами соответствующего куба в сетке расчета. После умножения этих производных на (VRF/l.0\)sin(a)Rft) было получено RF-поле в выбранной точке. Для моделирования вращающего поля была использована та же геометрия квадруполя с потенциалами 1.01 В на сегментах верхнего стержня вертикальной пары и потенциалами -1.01 В на сегментах нижнего стержня, потенциалы на горизонтальной паре стержней были равны нулю. Для обеспечения фокусировки ионов в квадруполе перед выходным отверстием потенциалы двух последних сегментов каждого стержня вертикальной пары были равны нулю. Как и ранее, потенциалы всех других электродов в квадруполе были приняты равными нулю. В данном случае для упрощения расчетов была использована симметрия для горизонтального и аксиального направлений.
Измерение подвижности ионов по их уходу на стержни квадруполя
Программа "МАс", созданная А.Р.Пихтелевым в среде Borland C++ 5.0, предназначена для регистрации и первичной обработки времяпролетных масс-спектров с возможностью управления периферийным оборудованием в процессе регистрации.
Программа работает на двухпроцессорном компьютере Pentium-II с операционной системой "Windows 2000" или "Windows NT". При регистрации спектров для измерения времени прихода ионов используется четырехканальный время-цифровой преобразователь фирмы "Ionwerks" TDCx4 с временным разрешением 625 пксек, управление и считывание данных с которого осуществляется программой с помощью 32-разрядной интерфейсной платы быстрого цифрового ввода-вывода фирмы "Fishcamp". Процесс регистрации идет на одном из процессоров компьютера с наивысшим приоритетом независимо от других задач системы, что позволяет минимизировать времена прерывания операционной системой процесса считывания данных и таким образом устранить переполнения FIFO время-цифрового преобразователя при его работе с допустимым потоком ионов (до 300 килоионов/сек). Другой процессор программа использует с обычным приоритетом для просмотра готовности данных, их отображения в виде графиков и обработки в реальном времени.
Периоды временной задержки между регистрациями отдельных спектров задаются оператором либо в мсек (в этом случае для отсчета времени используется таймер операционной системы с относительно большой погрешностью), либо в числе стартовых импульсов прибора, регистрируемых время цифровым преобразователем, что позволяет получать корректные времена регистрации спектров. В случае задания временной задержки = 1 регистрация вообще не прерывается, и данные не теряются.
В периоды времени между регистрациями спектров программа может управлять периферийными устройствами, меняя управляющие ими сигналы по задаваемому оператором закону. Для управления периферийными устройствами используются свободные от регистрации выводы цифровой интерфейсной платы и СОМ-порт компьютера. В текущей версии программы заложено управление генератором стартовых импульсов, SIN-COS генератором для создания вращающего поля и блоком управления продольным напряжением в МИР-2.
В данной программе предусмотрена регистрация в режиме сканирования, идущая непрерывно до остановки оператором. В этом случае массивы масс-спектров постоянно обновляются, в памяти компьютера сохраняется только последний зарегистрированный масс-спектр и выведенные на экран графики ионных токов и сумм масс-спектров.
При любом режиме регистрации оператор может работать с любыми типами окон масс-спектров и ионных токов. При выделении участка масс-спектра и открытии окна ионного тока будет получен график ионного тока для выделенного диапазона m/z. При выделении участка графика ионного тока и открытии окна масс-спектра будет получен график суммы масс-спектров в выделенном на графике ионного тока диапазоне. При этом все открытые графики обновляются динамически в процессе регистрации. По окончании регистрации полученные данные могут быть записаны в файл, а графики распечатаны на принтере либо все вместе, либо по отдельности, с заданными подписями и заголовком, а также сохранены в отдельных текстовых файлах для обработки с помощью других программ. При сохранении в текстовом виде графиков ионных токов, сохраняются также соответствующие значения параметров использовавшихся периферийных устройств. Для обработки полученных данных могут быть использованы функции сглаживания и устранения экспоненциальных "хвостов" у оснований пиков масс-спектров. Для оцифровки пиков (их обнаружения, определения m/z и площадей) имеется функция авто-обнаружения базовой и пороговой линий (имеется также возможность задавать их вручную).
Обнаруженные пики выводятся на графики, которые могут налагаться на исходные данные, с выводом значений m/z в режиме автозаполнения экранного пространства. Любые пики могут также быть оцифрованы вручную с использованием мыши.
Первым объектом для исследования был выбран грамицидин С, который много лет используется в ФИНЭПХФ РАН в масс-спектрометрических измерениях в качестве калибровочного вещества. Грамицидин С представляет собой короткий кольцевой пептид, структура которого схематично показана на рис.4.4. Для исследований использовался раствор грамицидина С в ацетонитриле с концентрацией 2-10"5 М. ESI источник ионов работал в режиме «самоподачи» раствора (скорость выхода раствора -0.1 мклитр/мин, внутренний диаметр кварцевого капилляра - 50 мкм, величина напряжения между капилляром и соплом - около 3 кВ). В качестве газа завесы и буферного газа использовался «сухой» азот при комнатной температуре. Используя выражение (2.23) была рассчитана резонансная частота вращающего напряжения для двухзарядного иона грамицидина С [М+2Н]2+ (m/z = 571.36) в условиях эксперимента (vWw-78.8 кГц). В определенной таким образом области частот регистрировалась серия масс-спектров раствора грамицидина С при вариации частоты вращающего напряжения, vrot, с шагом 0.25 кГц.
Исследование кинетики реакций фрагментации ионов: грамицидина С ([М+2Н] ), металл оорганического комплекса ([Fe3OL3+H]2+) и 9-(4-азидофенил) N-метилакридиния ([А])
Надо сказать, что не все зарегистрированные в масс-спектре (рис.4.5Ь) ионы-фрагменты являлись продуктами первичной фрагментации ионов [М+2Н] . Исходные ионы [М+2Н] фрагментировали в том числе и на два одинаковых однозарядных иона [М/2+Н]+ (это было видно из масс-спектров), которые имели ту же величину m/z и резонансно возбуждались тем же вращающим полем. Однако, это обстоятельство не повлияло на результаты сравнения полного числа ионов-фрагментов с убылью исходных ионов [М+2Н]2+, т.к. подсчитывался фактически баланс зарядов. Различие между экспериментально измеренной величиной резонансной частоты вращающего напряжения для иона [М+2Н] + и расчетной величиной резонансной частоты объясняется неточным измерением амплитуды RF-напряжения. В дальнейшем резонансная частота вращающего напряжения для исследуемых ионов определялась экспериментально.
На примере селективной фрагментации ионов [М+2Н]2+ было проведено сравнение между вращательным и «дипольным» резонансными возбуждениями. В случае «дипольного» возбуждения дополнительное синусоидальное напряжение подавалось только между одной парой противоположных стержней квадруполя. В тех же экспериментальных условиях была получена серия масс-спектров раствора грамицидина С, когда амплитуда сигнала с COS - выхода генератора равнялась нулю. Характер изменения масс-спектров при вариации частоты синусоидального напряжения был тем же самым, что и в случае вращательного возбуждения. Амплитуда этого напряжения, І/ф, была увеличена до достижения той же степени фрагментации исходных ионов [М+2Н] + в условиях резонанса, что и в случае вращательного возбуждения. Оказалось, что одинаковая степень фрагментации в условиях резонанса достигается, когда отношение Уф/ Urot » 1.38. Это объясняется тем, что в случае «дипольного» возбуждения ион не находится постоянно на фиксированном расстоянии от оси квадруполя, как в случае вращательного возбуждения, а совершает колебательное движение между стержнями квадруполя. При этом его средняя кинетическая энергия остается постоянной; на максимальном удалении от оси квадруполя она близка к средней кинетической энергии быстрых осцилляции иона в RF-поле, а на оси квадруполя равна максимуму кинетической энергии колебательного движения. Необходимо отметить, что приближенное теоретическое описание движения иона (глава 2) справедливо и для случая «дипольного» возбуждения, являющегося частным случаем вращательного возбуждения. Очевидно, что в случае «дипольного» возбуждения средняя кинетическая энергия ионов в случае резонанса (с учетом выражения (2.35)) может быть записана в виде: где xres - амплитуда колебательного движения ионов при резонансном «дипольном» возбуждении. Сравнивая это выражение с выражением (2.36) для полной средней кинетической энергии ионов в случае резонансного вращательного возбуждения и учитывая, что средняя кинетическая энергия ионов определяет их внутреннюю температуру при активации ионов в столкновениях с молекулами буферного газа, получим соотношение: которое должно выполняться в случае одинаковой степени фрагментации исходных ионов при «дипольном» и вращательном резонансных возбуждениях. Очевидно, что в этом случае (принимая во внимание выражение (2.24)) Из рис.4.7 видно, что при одинаковой степени фрагментации исходных ионов [М+2Н]2+, соотношение между амплитудами синусоидального и вращающего напряжений близко к 4Ї. Ширина резонансного пика для вращательного возбуждения оказалась несколько меньше, чем в случае «дипольного» возбуждения. В случае резонансного «дипольного» возбуждения наблюдался недостаток ( 20 %) числа ионов-фрагментов в масс-спектре при частоте синусоидального напряжения 72 кГц по сравнению с убылью исходного иона [М+2Н]2+ в результате реакции фрагментации. Оценим амплитуду колебательного движения иона [М+2Н] в случае резонансного «дипольного» возбуждения. Используя выражение (2.24) и учитывая соотношение (2.8), получим выражение для амплитуды: Величину подвижности, к, ионов [М+2Н]2+ в азоте в условиях эксперимента можно оценить, используя данные для приведенной подвижности ионов [М+2Н] (подвижность при нормальных условиях: ро = 760 Торр, Т0 = 273 К) [103]; вписанный радиус квадруполя R0 = (3.63 ± 0.03) мм. В результате получим: xres w 2.6 мм. Оценим амплитуду быстрых осцилляции ионов [М+2Н]2+ в RF-поле, используя выражение [105].
