Введение к работе
Актуальность проблемы.
Патогенез катаракты - сложный и во многом неизученный процесс. Катаракта - помутнение хрусталика глаза - развивается у более половины населения земного шара, перешагнувшего рубеж 65 лет. Механизм возникновения и развития этого заболевания до сих пор остаётся невыясненным. Существует предположение, что основной причиной, вызывающей модификацию белков хрусталика - кристаллинов - является окислительный стресс, а также нарушение обмена веществ (например, при сахарном диабете). Только в последние годы в научной литературе появился ряд работ, в которых предполагается, что процесс модификации белков хрусталика может быть связан с реакциями кинуренинов (KN) - молекул с небольшим молекулярным весом, находящихся в хрусталике в свободном состоянии. Эти соединения, по строению близкие к природным аминокислотам, обладают полосой поглощения в области 300-400 нм и короткими временами флуоресценции. Благодаря вышеуказанным свойствам эти соединения в хрусталиках глаз выполняют функцию светофильтров, защищая сетчатку глаза от УФ-облучения. Фотохимические и термические реакции кинуренинов приводят к образованию реакционных частиц - триплетных молекул и ненасыщенных кетонов, соответственно, а в ходе метаболизма молекулярных фильтров образуются продукты, фотохимическая и термическая активность которых может быть существенно выше, чем у исходных молекул. Предполагается, что кинуренины, подвергнувшиеся фотохимическому возбуждению или термическому разложению, могут присоединяться к кристаллинам, вызывая их многочисленные модификации, что ведет к агрегации белков и понижению их растворимости.
Химические реакции кинуренина и его производных к настоящему моменту изучены мало; в литературе отсутствует информация о полной схеме реакций данных соединений при физиологических условиях, моделирующих условия в хрусталике глаза. Вследствие этого исследование реакций кинуренина и его производного - дезаминированного кинуренина, в присутствии различных субстратов является очень актуальной задачей. Установление детальных механизмов химических реакций, приводящих к модификации белков хрусталика, может способствовать разработке медицинских препаратов, позволяющих ингибировать окислительные процессы в хрусталике, и, возможно, задерживать развитие катаракты.
Данная работа направлена на изучение химических и фотохимических реакций производных кинуренина при физиологических условиях. В работе с использованием комплекса химико-физических методов (оптическая спектроскопия, лазерный импульсный фотолиз,
масс-спектрометрия, ВЭЖХ) исследована реакционная способность промежуточного про-
дукта разложения кинуренина - карбоксикетоалкена (СКА). Изучены реакции СКА с рядом аминокислот и антиоксидантов, определена структура аддуктов кинуренина с модельными биологическими молекулами, присутствующими в хрусталике, а также предпринята попытка модифицирования модельного белка молекулами кинуренина. С использованием комплекса химико-физических методов исследована стабильность, а также фотохимические и фотофизические свойства полученных соединений. Развита методика определения количества триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных. Основными целями данной работы являются:
Установление механизма дезаминирования кинуренинов при различных значениях рН среды.
Разработка методик получения дезаминированного кинуренина и его аддуктов с аминокислотами и антиоксидантами, входящими в состав хрусталика и изучение стабильности синтезированных аддуктов с использованием методов химической физики.
Разработка методики модификации модельного белка молекулами кинуренина и анализ фотофизических свойств кинуренина, присоединенного к аминокислотам и к модельному белку.
Развитие физико-химических методов определения уровня триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных в зависимости от возраста и степени развития катаракты.
Научная новизна работы.
Установлен механизм дезаминирования кинуренинов в зависимости от кислотности среды. Впервые предложена методика синтеза и выделения дезаминированного кинуренина (СКА). С использованием комплекса химико-физических методов изучены реакции дезаминированного кинуренина при физиологических условиях, и установлено, что наибольшая константа скорости реакции СКА с аминокислотами наблюдается для аминокислоты цистеи-на и антиоксиданта глутатиона. Исследована термическая стабильность аддуктов кинуренина с лизином, гистидином, цистеином и глутатионом и установлено, что наиболее стабильным является аддукт с лизином.
Установлено, что при увеличении заместителя в молекуле кинуренина наблюдается увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни синглетного возбужденного состояния молекулы. Например, при присоединении кинуренина к модельному белку лизо-циму, наблюдается семикратное увеличение квантового выхода флуоресценции и тринадца-
тикратное увеличение времени жизни синглетного возбужденного состояния кинуренина. Это указывает на меньшую устойчивость по отношению к УФ излучению молекул кинуренина, присоединенных к белку.
Развиты физико-химические методы определения уровней триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках глаз крыс. Полученные данные свидетельствуют о том, что окислительный стресс организма, приводящий к развитию катаракты, влияет на концентрацию кинуренина и триптофана в хрусталиках крыс.
Практическая ценность. Полученные результаты по исследованию реакций присоединения СКА к аминокислотам и антиоксидантам могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов катарактогенеза, а также при разработке препаратов, предотвращающих или замедляющих процесс образования катаракты. Разработанная методики исследования небелкового состава в хрусталиках подопытных животных может быть усовершенствована и применена для исследования хрусталиков человека с различными степенями развития катаракты.
Личный вклад соискателя. Автор диссертации участвовал в постановке задач, решаемых в диссертационной работе, разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций. Все результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Оригинальные экспериментальные результаты получены автором с использованием целого ряда химико-физических методов исследования: кинетической оптической спектроскопии, ВЭЖХ, лазерного импульсного фотолиза, кинетической флуоресцентной спектроскопии и масс-спектрометрии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных симпозиумах и конференциях: International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry «Photoradchem-2007» (Коттаям, Керала, Индия, 8-11 февраля 2007 г.), VI Voevodsky Conference «Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes» (Черноголовка, Россия, 25-28 июня 2007 г.), International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules «ISRnjM-2007» (Аскона, Швейцария, 19-24 августа 2007 г.), I Международная конференция «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине» (Туапсе, Россия, 3-9 октября 2007 г.), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008 г.), XX и XXI Симпозиумы «Современная химическая физика» (Туапсе, Россия, 2008-2009 гг.), Всероссийская конференция молодых ученых и III школа им. академика Н.М. Эмануэля
«Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, Россия, 1-3 октября 2008 г.), 15і International Congress on Photobiology «ICP-2009» (Дюссельдорф, Германия, 18-23 июня 2009 г.), 18і International Mass Spectrometry Conference «IMSC-2009» (Бремен, Германия, 31 августа - 4 сентября 2009 г.), Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 9-13 сентября 2009 г.), Central European conference on photochemistry «CECP 2010» (Бад Хофгаштайн, Австрия, 7-11 февраля 2010 г.), XXIIIIUPAC Symposium on Photochemistry (Феррара, Италия, 11-16 июля 2010 г.), IV Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, Россия, 10-14 октября 2010 г.).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях в российских и международных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также в 15 тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 199 наименований. Работа изложена на 123 страницах, содержит 7 таблиц, 30 рисунков и 7 схем.
