Введение к работе
Актуальность проблемы Кальпротектин (КП) представляет собой белковый комплекс, содержащийся в большом количестве (до 5% общего внутриклеточного белка) в цитоплазме нейтрофилов, активированных макрофагов, и, в меньшей степени, моноцитов. В состав КП входят две субъединицы: MRP8 и MRP14, с молекулярной массой 10,8 и 13,2 кДа, соответственно (Odink et al., 1987). Биологическая роль КП окончательно не выяснена, хотя имеются данные о его антимикробной, кальцийсвязывающей и регуляторной активности. Согласно накопленным к настоящему времени сведениям, КП играет важную роль в процессах инфекционного и неинфекционного воспаления у человека (Hessian et al., 1993, Bhardwaj et al., 1992). Показана его высокая бактериостатическая и бактерицидная активность в отношении ряда патогенных микробов и грибков (Steinbakk et al., 1990, Sohiile, Collins-Lech, 1990). Получены данные о повышении уровня КП в плазме крови при некоторых ішфекциях, злокачественных опухолях, коллагенезах, муковиецндозе (Duiilop et al., 1991, Bemtzen et al., 1991). По-видимому, данный белок имеет существенное значение для роста и дифференшгровки клеток крови (Murao et а!., 1990). Вместе с тем, в представлениях о КП остаётся много неясных вопросов касающихся механизмов его синтеза, закономерностей экспрессии и экскреции клетками, участия в иммунорегуляторньгх процессах при различных патологических состояниях человека. До настоящего момента отсутствуют данные о содержании КП в клетках и плазме при патологиях, непосредственно затрагивающих нейтрофильный ряд лейкоцитов и моноцитарно-макрофагальную систему (инфекционные и неинфекционные гранулематозы).
Предполагается, что определение содержания КП в клетках и в плазме крови может служить критерием, характеризующим качественное и количественное состояние миелоидного ряда при гематологических заболеваниях, являться ранним маркером изменений в составе фанулоцитарного пула при развитии осложнений химиотерапии, а также при обострениях и наступлении ремиссии.
КП, как белок содержащийся в активированных макрофагах, может быть маркером функционального состояния макрофагальной системы, играющей важную роль в патогенезе гранулематозов лёгких инфекционной и неинфекцно'нной природы.
Работа выполнялась в рамках исследований, проводимых согласно темы НИР "Разработать современные биотехнологические подходы для исследования медиаторов иммунитета и кроветворения в эксперименте и клинике" (1991 -1495 г.г. N юс. регистрации 01.9.10018156); фанта Белорусского Фонда Сороса
"Кальпротектин как новый диагностический маркер для оценки нарушений макрофагально-гранулоцитарной системы человека при патологии (N В95-9-1100-6) и Соглашения о сотрудничестве между Комплексным центром исследования рака Калифорнийского Университета (Лос-Анжелес, США) и НИИ гематологии и переливания крови МЗ РБ.
Цель исследования
Целью работы являлось исследование закономерностей экспрессии КП в клетках миеломоноцитарного ряда и его содержания в плазме в норме- и' при патологии и изучение возможности использования количественного определения КП в плазме крови в качестве диагнбстического и дифференциально-диагностического критерия при заболеваниях крови и гранулематозах лёгких..
Задачи работы
1. Получить гибрПдомы, продуцирующие моноклональные антитела
(МкАТ) к КП. ...
-
Разработать на основе МкАТ метод иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения КП в культуральных супернатантах. и биологических жидкостях.
-
Исследовать содержание КП в плазме у здоровых лиц (доноров крови) и пациентов с заболеваниями крови и некоторыми гранулематозами легких.
-
Разработать метод иммуноцитохимического выявления КП с помощью МкАТ.
-
Исследовать экспрессию КП в клетках миелоидного ряда и в моноцитах периферической крови человека.
-
Оценить значение количественного и качественного определения КП для диагностики, дифференциальной диагностики и прогноза при гематологических заболеваниях и гранулематозах легких.
Научная новизна работы
Получена панель МкАТ к цитоплазматическому белку нейтрофильных граігулоцитоа (НГ) и моноцитов/макрофагов - кальпротектину, реагирующих с мономерными и мультнмерными формами белка. На основе МкАТ разработан метод для количественного определения КП в биологических жидкостях и культуральных супернатантах - гомологичный "сэндвич" ИФА. Исследованс распределение КП в лейкоцитах человека, установлена стадия дифференцировкг клеток миелоидного ряда, на которой начинается экспрессия данного белка Определено количественное содержание КП в моноцитах, исследована егс экспрессия на поверхности гранулоцитов. и моноцитов. Проанализирован! субъединичная структура кальпротектинового комплекса. Исследоваш содержание КП в плазме при. ряде гематологических заболеваний, выявлень нозологии, характеризующиеся повышенным содержанием КП в плазме
установлена связь между уровнем данного белка в плазме и патогенетическими факторами гемобластозов. Исследовано содержание КП в плазме при различных формах туберкулеза и саркоидозе легких. Обосновано дифференциально-диагностическое значение определения КП при данных заболеваниях.
Практическая значимость и пути реализации работы
Получены штаммы гибридом, продуцирующих МкАТ, пригодные для использования в современных методах исследовании: ИФЛ, иммуноаффинной очистке белка, иммуношггохимии, иммунофлуоресценшш, иммуноблоттинге. Созданная система иммуноферментного анализа КП пригодна для количественного определения данного белка как в культуральных супернатантах, так и в биологических жидкостях и может быть использована в лабораторной и клинической диагностике. Тест-система внедрена в НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ для дифференциальной диагностики туберкулёза и саркоидоза. Иммуноаффянное выделение КП с помощью МкАТ может быть использовано для получения высокоочищенного препарата в количестве, достаточном для исследования его свойств in vivo и in vitro. Разработанный метод определения внутриклеточного КП, позволяющий точно оценивать содержание нативкого белка в 'Небольшом количестве моноцитов, может использоваться для количественной оценки антигенов в прилипающих клетках. Исследование уровня КП в плазме при заболеваниях, связанных с количественными и качественными нарушениями в макрофагально-гранулоцитарной системе, имеет важное диагностическое, дифференциально-диагностическое и прогностическое значение. Выяснение закономерностей экспрессии КП в клетках миелоидного и моноцитарного ряда позволяет глубже понять механизмы дифференцировки этих клеток, а также их роль в патогенезе ряда заболеваний. Предложенные методы являются'ценным'инструментом в изучении структуры, функций, распределения КП, а проведенные исследования вносят важный вклад в понимание биологической роли данного белка.
Апробация работы Результаты исследований были доложены на Ш съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов (Гродно, 1995), IX ' Международном конгрессе иммунологов (Сан-Франциско, 1995), VIII Конгрессе Польского общества иммунологов (Вроцлав, 1995), I Международной конференции "Иммунодиагностика, и иммунотерапия" . (Витебск, 1995), Международном симпозиуме "Актуальные проблемы пульмонологии (Минск, 1995), XXVII съезде Скандинавского общества иммунологов (Турку, 19%),. II съезде Европейской Гематологической Ассоциации (Париж, 1996).
Апробация диссертации состоялась 5 января 1996 года . на заседании Учёного Совета НИИ гематологии и переливания.крови МЗ РБ.
Публикации По теме диссертации опубликовано 16 работ, в кото] отражены основные научные результаты диссертации. Оформл рационализаторское предложение, которое внедрено в пульмонологичесі отделении НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ.
Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 95 страница состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и меті исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические рекомендаи список литературы (включает 90 источников). Работа иллюстрирована таблицами и 18 рисунками.
![Изменения микроэлементов плазмы крови при болезни Паркинсона и синдроме паркинсонизма [Электронный ресурс]](/i/i/4367/199348.png "Изменения микроэлементов плазмы крови при болезни Паркинсона и синдроме паркинсонизма [Электронный ресурс] Шакирова Елена Геннадьевна")