Введение к работе
Актуальность исследования По данным ВОЗ в настоящее время в мире насчитывается более 170 млн больных хроническим вирусным гепатитом С, а количество инфицированных HCV (вирус гепатита С) достигает 500 млн человек [Радченко В Г и соавт, 2004, Lauer GM et al, 2001] Вирусный гепатит С занимает лидирующее место среди гепатотропных инфекций в развитых странах, где инфицировано 1-2% населения [Alter Н J et al, 2000, Afdhal N H et al, 2004] В России больных хроническими формами и носителей HCV не менее 2 млн человек [Шахгильдян И В и соавт , 2003] Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции (>85%), развития цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) [Соринеон СН, 1998, Marcellm Р et al, 2002, Ahmad A et al, 2004] Различное течение и исходы заболевания обусловлены гетерогенное! ью иммунного ответа, определенного как иммуногенетическим своеобразием организма-хозяина, так и биологическими особенностями HCV
Считается, что главным фактором, обуславливающим персистенцию HCV, является высокая скорость мутаций вируса Благодаря высокой генетической вариабельности, HCV у каждого инфицированного лица существует в виде комплекса генетически близких постоянно изменяющихся вариантов (квазивидов) [Соринеон С Н и соавт, 1998, Kanto Т , 1995, Alter Н J , Seeff L В , 2000] Другим механизмом, реализующим возможность персистенции, может быть подавление иммунного ответа под действием белков HCV [Фридлянд И Ф и соавт, 2002, Sarobe Р et al, 2003] Третьим фактором, способствующим персистенции HCV, считается инфицирование этим вирусом лимфоидных клеток [Соринеон СН и соавт, 1997, Lauer GM et al, 2001, Kanto T, Hayashi N, 2006] Резервуаром инфекции в периферической крови и других тканях организма могут служить В- и Т-лимфоциты, моноциты/межрофаги, гранулоцити и другие клетки Кроме названных механизмов персистенции, имеется предположение о том, что важнейшую роль в хронизации и прогрессировании гепатита С играют дисбаланс между ТЫ- и Тл2-лимфоцитами и секретируемыми ими цитокинами [Приймяги Л С и соавт , 2002, Царегородцева Т М , Серова Т И, 2003, Наследникова И О и соавт, 2005, Рязанцева Н В и соавт, 2006, Antonact S et al, 1998; Fan X et al, 1998, Cramp M et al, 1999, Boyer N et al, 2000]
Наличие хронического инфекционного процесса, безусловно, является
следствием недостаточности противовирусного иммунитета Как
продемонстрировали многочисленные исследования, главную роль в элиминации HCV играет Т-клеточный ответ, так как действие нейтрализующих антител зачастую оказывается неэффективным Спонтанное прекращение острой HCV-инфекции ассоциируется с сильным продолжительным мультиспецифическим С04+-Т-клеточным пролиферативным и IFN-y-ответом, направленным одновременно на множество вирусных эпитопов-мишеней [Cramp М et al, 1999, Day С L et al, 2002, Rosen H R et al., 2002, Chang К M et al, 2003, Wertheimer AM et al, 2003, Wollard D J et al, 2003] При хроническом течении болезни наблюдается утрата способности СБ4^- и С08+-Т-клеток к пролиферации и к \
секреции IFN-y [Wedemeyer H et al, 2002, Ulsmheimer A et al., 2003] В ряде исследований было показано, что HCV способен снижать СВ8+-Т-клеточный ответ [Wedemeyer Н et al, 2002, Sugimoto К et al, 2003, Boettler T et al, 2005]. Этот факт может объяснять частую клиническую ассимптоматичность острой HCV-инфекции и слабую степень повреждения печени у большинства пациентов [Wedemeyer Н et al, 2002, Accapezzato D et al, 2004, Kanto T, Hayashi N , 2006J
Предполагается, что и острое и хроническое повреждение печени при гепатите С происходит, в основном, за счет реализации иммунного ответа на HCV, а не его цитопатического действия [Racanelh V et al, 2001; Chang К M et al, 2003, Ahmad A , Alvares F , 2004, Kanto T, Hayashi N, 2006] Клеточный иммунный ответ играет ключевую роль не только в элиминации вируса, но и в патологии печени при хронической HCV-инфекции Однако, в настоящее время об изменениях субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, других, участвующих в иммунном ответе факторах, связанных с повреждением печени при хронической HCV-инфекции, известно немного
Особое внимание уделяется изучению роли в иммунопатогенезе ХГС регуляторньгх Т-клеток с иммунофенотипом CD3+CD4+CD25+ (Tregs) [Sugimoto К et al, 2003, Cabrera R et al, 2004, Sakaguchi S , 2004, Boettler T et al, 2005] В большинстве работ сообщается о повышении содержания CD4+CD25hlgh Tregs (популяция с высокой степенью экспрессии антигена CD25) в периферической крови HCV-инфицированных пациентов по сравнению с выздоровевшими больными или .неинфицированным контролем [Sugimoto К et al, 2003, Cabrera R et al, 2004] Тем не менее, до сих пор не ясна причина повышения Tregs при HCV-инфекции [Kanto Т, Hayashi N, 2006] Большой интерес представляет исследование Т-клеток с экспрессией маркеров NK-клеток (СШ6, CD56, CD161), включающих CD3+CD16+56+ Т-киллеры и регуляторные NKT-клетки, несущие на своей поверхности инвариантный Т-клеточный рецептор (ТКР), также участвующие в механизме повреждения печени при ХГС за счет выработки профибротических цитокинов (IL-4 и DL-13) 2 типа [Kawarabayashi N et al, 2000, Ahmad A , Alvares F., 2004, De Lalla С et al, 2004]
В последнее время интенсивно изучается характер CD4+- и CD8+-T-клеточного ответа на белки HCV как в печени, так и в других компартментах (периферическая кровь, костный мозг и др ) [Shirren С A et al, 2000, Penna A et al, 2002, Leroy V et al, 2003, Watson M W et al, 2003, Monta К et al, 2005] Было выявлено, что IFN-y-ответ мононуклеаров периферической крови (МНГЖ) на С-core-антиген HCV может быть маркером тяжести заболевания при ХГС [Watson М W et al, 2003] Важное прогностическое значение при хронических заболеваниях печени могут иметь исследования цитокинового спектра Как показано в большинстве работ, повышение содержания некоторых цитокинов связано с изменением активности и прогрессией ХГС [Логинов А С и соавт, 2001, Приймяги Л С и соавт , 2003; Наследникова И О и соавт , 2005, Скляр Л Ф и соавт , 2005, Рязанцева НВ и соавт , 2006, Zilberberg Н et al, 1999] Появились публикации о связи В-клеточного фенотипа со степенью фиброза у пациентов с хронической HCV-инфекцией [Racanelh V. et al, 2001, Nr J et al, 2003, Sansonno D et al, 2004, Monta К et al, 2005]
1"
В то же время, многие аспекты иммунопатогенеза HCV-инфекции остаются неясными и требуют более глубокого изучения Так, практически отсутствуют сведения об экспрессии активационных маркеров (CD25, HLA-DR, CD9f>) на поверхности основных субпопуляций Т-, В-лимфоцитов и натуральных киллеров (NK-клеток) у больных с различной степенью фиброза печени Важной представляется оценка роли Т-хелперов и питотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD25 и HLA-DR, а также Т-киллеров (CD3+CD16+56 ) в иммунопатогенезе ХГС и прогрессировании заболевания на стадии формирования цирроза печени Мало изучена диагностическая значимость изменений провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, которые могли бы выступать в качестве иммунологических маркеров прогрессирования и дифференцирования стадий ХГС До сих пор не установлены взаимосвязи между факторами гуморального, врожденного иммунитета и темпами прогрессирования фиброза печени у больных ХГС
Особое значение приобретает создание дифференциально-диагностических и прогностических алгоритмов при ХГС, разработанных на основе анализа изменений клеточного и гуморального звена иммунной системы дія случаев, когда отсутствует возможность проведения пункционной биопсии печени. В настоящее время их практически нет, поэтому разработка и практическое внедрение таких алгоритмов поможет клиницисту дифференцировать стадии, тип иммунного ответа при ХГС, оценить прогноз и выбрать рациональную лечебную тактику у конкретного больного
Таким образом, дальнейшее уточнение иммунопатогенеза хронической HCV-инфекции и идентификация иммунологических критериев, ассоциированных с прогрессией ХГС, нарастанием степени фиброза печени и благоприятным ответом на лечение, является актуальной медицинской проблемой
Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования
Цель исследования. Изучить иммунопатогенез хронической HCV-инфекции при различных степенях фиброза печени и генотипах HCV, разработать дифференциально-диагностические и прогностические критерии заболевания
Задачи исследования.
-
Дать характеристику изменений клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС на различных стадиях заболевания
-
Исследовать изменения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС с циррозом печени
-
Оценить роль клеточных и гуморальных факторов иммунной сие темы в иммунопатогенезе хронической HCV-инфекции
-
Выявить особенности изменений иммунной системы при хронической HCV-инфекции, вызванной За и lb генотипами вируса
-
Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза течения хронической HCV-инфекции
Научная новизна исследования. У больных ХГС со слабой, умеренной, тяжелой степенями фиброза и циррозом печени впервые выявлены обусловленные прогрессией заболевания достоверные различия в содержании субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ЦИК, иммуноглобулинов, интерлейкинов и функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов
Впервые выявлены особенности иммунопаюгенеза ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени и сформулированы положения о доминировании гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижении субпопуляций Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности
Впервые выявлены прогностические и дифференциально-диагностические иммунологические критерии, позволяющие проводить иммунологический мониторинг и прогнозировать течение ХГС у больных с различными степенями фиброза и компенсации цирроза печени
Вйервые выявлены закономерности и взаимосвязь процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных ХГС
На основе изученных у больных ХГС закономерностей изменений клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности для практического здравоохранения впервые разработаны расширенный и сокращенный варианты обследования больных и аггоритмы дифференциальной иммунодиагностики ХГС на различных стадиях заболевания
Практическая значимость. В целях дифференциальной диагностики и прогнозирования течения ХГС при слабой, умеренной и тяжелой степени фиброза, компенсированном и декомпенсированном циррозе печени предложен перечень иммунологических критериев и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики заболевания
Определен объем первичного иммунологического обследования больных ХГС, включающий изучение показателей Т-, В-систем иммунитета, факторов неспецифической резистентности Разработаны расширенный и сокращенный варианты углубленного иммунологического обследования больных ХГС, позволяющие установить доминирующий тип иммунного ответа
Предложена система иммунологического мониторинга у больных ХГС, включающая изучение в динамике определенных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, в том числе, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза На основании изучения соотношений активированных и неактивированных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, разработаны иммунологические критерии прогноза ХГС
Личное участие автора в получении результатов. Автором уточнены
особенности иммунопатогенеза начальных и поздних стадий HCV-инфекции,
проанализированы иммунологические, клинико-лабораторные и
морфологические проявления заболевания на различных его этапах, созданы алгоритмы дифференцирования начальных и поздних стадий ХГС, а также оценки
характера иммунного ответа, разработаны иммунологические критерии профессирования ХГС на основе анааиза изменений иммунной системы у больных с различной степенью выраженности фиброза печени
Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в иммунологическом обследовании больных, организации всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно проводил анализ количественного состава субпопуляций лимфоцитов периферической крови на проточном питометре с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител, а также осуществлял определение содержания различных цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Изменения иммунной системы у больных ХГС при слабой и умеренной степенях фиброза печени проявляются снижением уровня клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксической активности, доминированием гуморального иммунного ответа с преобладанием цитокинов Тп2-профиля, высоким уровнем В-лимфоцитов, иммуноглобулинов и ЦИК, нарушением функциональной активности найтрофильных лейкоцитов
-
При тяжелой степени фиброза и компенсированном циррозе печени у больных ХГС наряду с сохраняющимся превалированием В-клеточного иммунного ответа при прогрессии заболевания еще более снижается уровень CD3" CD8+, CD3"CD16+56"r естественных киллеров и усиливается активность Т-клеточного звена иммунной системы, проявляющаяся повышением содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций T-лимфоцитов
3 Профессирование ХГС сопровождается патогенетически значимыми
изменениями Т-клеточного звена иммунной системы, характеризующимися
взаимосвязью процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток
Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу ПИЛ общей иммунологии и иммуногенетики НИО передовых медико-биологических технологий НИЦ ВМедА им СМ Кирова, кафедр и клиник инфекционных болезней, факультетской терапии, клинической биохимии и лабораторной диагностики, микробиологии ВМедА им СМ Кирова, инфекционных центров и отделений госпиталей МО РФ На основании пол5'ченных данных изданы методические рекомендации ГВМУ МО РФ «Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов» (М , 2002), «Латентные формы вирусных гепатитов В, С и D диагностика, лечение и профилактика» (М, 2002), подготовлены к изданию методические рекомендации «Иммунологическое обследование больных вирусными гепатитами» (2006)
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием «Вирусные инфекции на пороге XXI века эпидемиология и профилактика» (Санкт-Петербург, 1999), Научной конференции «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 1999), 4 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 2000), 5 Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2001), 5 научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 >> (Санкт-Петербург, 2001-), Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора НК Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2001), 6 Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002), 1 съезде военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002), Научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2003), VIII, IX, X, XI Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004-2007).
По материалам исследования опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 методических рекомендаций, 16 научных публикаций, в журналах реферируемых ВАК
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 318 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 8 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 265 источников, в том числе 76 отечественных и 189 зарубежных Текст содержит 92 таблицы, 20 рисунков и 8 приложений
