Содержание к диссертации
Оглавление 2
Сокращения 5
Введение 7
Глава 1. Обзор литературы. Аутоантнтела различной специфичности
в патогенезе и диагностике аутоиммунных увеитов 13
1.1. Современные представления о патогенезе аутоиммунных
увеитов 14
1.2. Естественные аутоантнтела как причина и индикатор разви
тия аутоиммунных нарушений 24
1.2.1. Увеаретинальные аутоантнтела и их место в патоге
незе аутоиммунных увеитов 28
1.2.2. ДНК-связьтвающие аутоантнтела и их возможная
роль в патогенезе аутоиммунных увеитов 35
1.2.3. Каталитические аутоантнтела в патогенезе аутоим
мунных увеитов 39
1.3. Антитела различной специфичности как молекулярно-
диагностический инструмент в серодиагностике и серопрогно-
зировании аутоиммунных увеитов 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
Общая характеристика групп больных 45
Расходные материалы, реактивы и наборы иммунодиагно-стических реагентов («киты») 48
Методы иммунологического обследования 49
Определение содержания в сыворотках крови больных аутоантител различной специфичности 49
Определение содержания в сыворотках крови больных иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA 50
Определение содержания в сыворотках крови больных циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) 51
Постановка реакции связывания комплемента 50
2.3.5. Постановка реакции прямой иммунофлюоресцен-
ции 51
2.3.6. Проведение внутрикожной пробы с герпетической
поливакциной 51
2.3.7. Общелабораторные и клинико-инструментальные
методы исследования 51
2.4. Методы молекулярной и клеточной биологии 51
2.4.1. Метод аффинной сорбции для экспресс-скрининга
образцов крови на наличие ДНК-абзимов 51
Фракционирование, выделение и очистка ДНК-абзимов из сывороток крови 52
Определение ДНК-гидролизующей активности в препаратах анти-ДНК аутоантител 54
Культура эукарнотических клеток и анализ цито-токсического потенциала ДНК-абзимов 55
Анализ цитоплазматической фракции клеток на наличие фрагментов ДНК 57
2.5. Методы статистической обработки результатов 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1. Увеаретинальные аутоантитела в сыворотках крови боль
ных с аутоиммунными увеитами 59
Частота встречаемости увеаретинальных аутоантител в сыворотках крови у больных с различными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов 59
Титры органоспецифических увеаретинальных ау-тоантителв сыворотках крови у больных с различными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов 65
Корреляции между распространенностью и содержанием увеаретинальных аутоантител и клиническими вариантами аутоиммунного увеита 68
3.2. ДНК-связывающие аутоантитела у больных с аутоиммун
ными увеитами 78
3.2.1. ДНК-связывающие аутоантитела в сыворотках кро
ви больных с аутоиммунными увеитами 78
Частота встречаемости ДНК-связывающих аутоантител у больных с разными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов 78
Сывороточные уровни ДНК-связывающих аутоантител у больных с разными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов 80
Корреляции между распространенностью и содержанием ДНК-связывающих аутоантител и клиническими вариантами аутоиммунного увеита 82
3.2.1.4. Частота встречаемости ДНК-абзимов у боль
ных с различными клиническими формами и вари
антами течения аутоиммунных увеитов 84
3.2.1.5. Корреляции между распространенностью
ДЕК-абзимов, частотой встречаемости и титрами
специфических (увеаретинальных) аутоантител и
клиническими вариантами аутоиммунного увеита... 86
3.2.2. Каталитическая и цитотоксическая активность
ДНК-связывающих аутоантител у больных с аутоиммун
ными увеитами 92
Уровни каталитической и цитотоксической активности ДНК-абзимов у больных с разными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов 92
Зависимость между частотой встречаемости и титрами аутоантител разной специфичности, ферментативной активностью ДНК-абзимов и клиническими вариантами аутоиммунного увеита 95
Обсуждение 98
Выводы 107
Практические рекомендации 109
Приложения 110
Список литературы 114
Сокращения
АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность АПК - антиген-презентирующая клетка АУ - аутоиммунный увеит аутоАГ - ауто антиген АЯА - антиядерные антитела
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГКГ (МНС) - молекулы главного комплекса гистосовместимости (от англ. major histocompatibility complex) дцДНК - двухцепочечная ДНК ИЛ - интерлейкин ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон ЛД - линейный дихроизм
МТТ - 3(4,5-диме-тилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолия бромид оцДНК - одноцепочечная ДНК
ПИФАС - постинфекционный аутоиммунный синдром ссДНК - сверхспирализованная плазмидная ДНК ТкР - Т-клеточный рецептор Тр - регуляторний Т-лимфоцит Тх - Т-хелпер
Тц - цитотоксичсский Т-лимфоцит ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат ФНО - фактор некроза опухоли ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы ЭАМ - экспериментальный аутоиммунный миокардит ЭАУ - экспериментальный аутоиммунный увеаретинит ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
6 CDR - участки, определяющие комплементарность ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ Ig - иммуноглобулин
IRBP - межфоторецепторный ретиноид-связывающий белок NK, НК - естественные киллерные клетки
Введение к работе
Актуальность проблемы
Особая роль среди воспалительных заболеваний глаза принадлежит аутоиммунным увеитам - тяжелым воспалительным процессам, зачастую принимающим хроническое рецидивирующее течение и приводящим к слепоте и инвалидизации. В последние 8-12 лет, однако, в этой сфере наметился значительный прогресс — уникальные возможности для создания новейших диагностических и лечебно-реабилитационных технологий в практике аутоиммунных увеитов появились в результате исследований молекулярно-клеточных механизмов иммунорегуляции, в первую очередь, механизмов ци-тотоксичности и реализации широкой палитры свойств природных аутоанти-тел.
Известно, что в контроле за общим фоном аутореактпвности у больных с аутоиммунными увеитами активно участвуют два основных вида иммунного ответа — врожденный (наследственный или hereditary/innate) и приобретенный в постнатальном периоде (адаптивный или adaptive).
Адаптивная ветвь иммунитета, в основе которой лежат механизмы Т-клеточной и антителоопосредованной иммунологической реактивности, играет в патогенезе аутоиммунных нарушений у больных с увеитами ключевую роль. Несмотря на активное развитие фундаментальных представлений об этиопатогенезе аутоиммунных увеитов и аутоиммунном синдроме (в частности, постинфекционном аутоиммунном синдроме, или ПИФАС) в целом, феномен аутоаитигенности собственных тканей и биологическое значение ау-тоантител остаются малопонятными. Это тормозит развитие теоретической базы аутоиммунитета и разработку новых методов диагностики, в частности, применительно к офтальмологии.
Один из ключевых объектов исследований в этиологии и патогенезе аутоиммунных увеитов - обширное семейство аутоантигсл разной специфичности, изучению которых сегодня уделяется большое внимание. Аутоан-
8 титела к специфическим детерминантам клеток сетчатки и сосудистой оболочки, не имеющим в живом организме аналогов, участвуют в развитии локализованного воспалительного процесса, как правило, аутоиммунного характера, реализуя свое патогенное действие как через классические (Т- и В-зависимые) пути иммунного ответа, так и через механизмы цитотоксичности и апоптоза.
В отличие от аутоантител к антигенам клеток сетчатки и сосудистой оболочки, специфичность которых в значительной степени была «законсервирована» в ходе эволюции и обладает минимальными резервами для участия в реакциях с перекрестно-реагирующими эпитопами, аутоантитела к антигенам, присутствующим в разных органах и тканях, обнаруживают массу мимикрирующих (перекрестно-реагирующих между собой) эпитопов, способных к индукции аутоиммунных процессов независимо от локализации первичного иммуногена и/или очага индукции аутоиммунного воспаления.
Особое внимание в этом плане уделяется ДНК-связывающим аутоанти-телам как наиболее полно изученному семейству «естественных» органонес-пецифических аутоантител. Их появление в кровотоке и средах макроорганизма в целом рассматривается рядом исследователей как ранній! предвестник аутоиммунного конфликта, позволяя внести ясность и в ситуацию с обнаружением при аутоиммунных увеитах ДНК-абзимов, т.е. аііти-ДНК аутоантител с каталитическими свойствами.
Наличие у больных с аутоиммунными увеитами аутоантител разной специфичности и биологической значимости служит не только диагностическим критерием, но и вносят свой вклад в прогноз заболевания. Однако проблема применения иммунологических методов для верификации диагноза аутоиммунного увеита, оценке эффективности проводимой терапии и прогноза заболевания заключается в отсутствие патогенетически обоснованных тест-систем, включающих целевые пакеты на органоспецифические и орга-нонеспецифические аутоантитела. В клинической практике применяются лишь отдельные тесты, информативность которых достаточно ограничена и
9 порой не соответствует поставленным задачам. Эта ситуация обусловлена недостаточной информацией о патогенетической и клинической значимости аутоантител разной специфичности, а также слабым взаимодействием между офтальмологией и клинической иммунологией.
Таким образом, обнаружение и исследование аутоантител разной специфичности и биологической активности, изучение их свойств и клинической значимости при аутоиммунных увеитах является актуальной медицинской проблемой.
Цель работы
Изучение роли аутоантител разной специфичности в патогенезе аутоиммунных увеитов и анализ их возможной клинико-диагностической значимости для мониторинга изменений в состоянии больных с аутоиммунными увеитами.
Задачи работы
Изучить частоту встречаемости аутоантител разной специфичности, в том числе антител к органоспецифическим антигенам увеаретинальной ткани и оргапонеспецифических ДНК-связывающих аутоантител в сыворотках крови больных с различными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов.
Провести сравнительное исследование содержания в сыворотках крови больных с различными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов аутоантител разной специфичности - от орга-носпецифических увеаретинальных аутоантител (к S-антигену, аг антигену, IRBP, родопсину, рековерину, фосдуцину) до органонеспе-цифических ДНК-связывающих аутоантител.
Исследовать частоту встречаемости аутоантител с различным эффек-торным потенциалом (ДНК-связывающих аутоантител с ДНК-гидролизующимп и цитотоксическими свойствами/ДНК-абзимов) в сыворотках крови больных с разными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов.
Проанализировать зависимость между органоспецифическими (к увеа-ретинальным ау то антигенам) и органонеспецифическими (ДНК-связывающими) аутоантителами и различными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов.
Провести сравнительное исследование показателей функциональной (каталитической и цитотоксическон) активности ДНК-абзимов в сыворотках крови больных с разными клиническими формами и вариантами течения аутоиммунных увеитов.
Исследовать зависимость между каталитической (ДНК-гидр о л изующей) и цитотоксической активностью ДНК-абзимов в крови больных с аутоиммунным увеитом, с одной стороны, и особенностями течения заболевания, с другой.
Разработать протокол клинической серодиагностики на основе выявления аутоантител разной специфичности для применения в офтальмологической практике в качестве дополнительного иммунологического критерия оценки течения увеита и прогноза развития заболевания.
Научная новизна работы
Впервые показано, что присутствие в крови больных увеитами аутоантител к специфическим увеаретинальным маркерам (S-ангигену, аг глобулину, IRBP, родопсину, рековерину, фосдуцину) и аутоантигенам широкой межорганной специфичности (дцДНК), в том числе аутоантител с наличием каталитических и цитотоксических свойств, может служить одним из основных иммунологических критериев оценки степени тяжести и активности процесса, а также прогноза развития и прогрессирования аутоиммунного увеита.
Практическая значимость работы
Установлено, что сочетанная серопозитивность по аутоантителам разной специфичности служит информативным индикатором аутоиммунного воспаления и может расцениваться как неблагоприятный прогностический фактор в клинике аутоиммунных увеитов.
]0
11 Результаты проведенных исследований позволяют начать разработку современных клинико-иммунологических критериев течения аутоиммунных увеитов и формировать клинико-лабораторные протоколы, основанные на комбинациях диагностических тест-систем, необходимые для оптимизации практической деятельности врача-офгальмолога.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международном офтальмологическом симпозиуме «Surgical and medical proposal for visual rehabilitation» в 2001 г. в г. Черновцы (Украина), на 4-ом Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии» в 2001 г. в г. Москве, на Научно-практической конференции «Современные технологии в диагностике и хирургическом лечении осколочных ранений глаза и орбиты» в 2001 г. в г. Москве, на I Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» в 2002 г. в г. Москве, на Научно-практической конференции «Медицина будущего» в 2002 г. в г. Сочи, на II Конференции иммунологов Урала в г. Пермь, во время Национальных дней лабораторной медицины в 2002 г. в г. Москва, на Конгрессе Всемирной организации по аллергии (WAO)-XVIII Конгрессе 1С АСІ в 2003 г. в г. Ванкувер (Канада), на VIII Съезде офтальмологов России в 2005 г. в г. Москва, на X форуме «Дни иммунологии» в 2006 г. в г. Санкт-Петербург, на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ-Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов-Ш Российской конференции по иммунотерапии в 2006 г. в г. Москва, на 8-ом Дрезденском симпозиуме по антителам «Prediction and early diagnosis of disease by autoantibodies» в 2007 г. в г. Дрезден (Германия).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложений и списка литературы. Диссертация включает 9 таблиц и 18 рисунков. Библиографический указатель содержит 298 источников, из них 33 отечественных и 265 зарубежных автора.
![Патогенетические и клинические аспекты безопасности общей управляемой гипертермии высокого уровня (42,5 - 44,0[O]C)](/i/i/4332/409700.png "Патогенетические и клинические аспекты безопасности общей управляемой гипертермии высокого уровня (42,5 - 44,0[O]C) Быкова Елена Владимировна")
